선물이 vivo에서 조직에서 장 3 차원 구조의 절연에 대 한 프로토콜 및 지하실 매트릭스 생체 외에서 organoids, 및 세부 다른 정착 immuno-microtubule의 라벨에 대 한 최적화 된 프로토콜을 얼룩이 지 포함 centrosomal, 그리고 접합 단백질도로 표식 줄기 세포 단백질 Lgr5를 포함 하 여 셀.
Vivo에서 조직 아키텍처와 morphogenesis 모방 3D 생체 외에서 organoids의 출현 크게 세포 및 개발 생물학에서 중요 한 생물 학적 질문을 공부 하는 능력을 고급 있습니다. 또한, 유전자 편집 및 바이러스 성 유전자 전달에 최근의 기술 진보와 함께 organoids 의료 연구 및 질병의 처리를 위한 새로운 약물의 개발을 약속 드립니다. Organoids에서 생체 외에서 지 매트릭스에서 성장 문제를 연구 하 고 다양 한 단백질의 기능에 대 한 강력한 모델 시스템을 제공 하 고 형광 태그 단백질의 라이브 이미징에 대 한 적합. 그러나, 설립 식 및 생 단백질의 지역화 ex vivo 조직에 생체 외에서 organoids는 태그 단백질의 동작을 확인 해야 합니다. 이 위해 우리 개발 하 고 조직 분리, 고정, 및 전 비보 장 조직 및 체 외에 장 organoids microtubules, centrosomal, 및 관련 단백질의 지역화에 대 한 면역 라벨 프로토콜 수정. 또한 항 체 antigenicity을 보존 하 고 좋은 침투 및 정착 액 및 항 체의 사용 하는 동안 organoids/조직의 3 차원 구조를 보존 하기 위해 정착 제에 대 한 목표가 이었다. 안정적인 microtubules 제외한 모든 감기에 노출 depolymerizes 그리고 다양 한 프로토콜을 수정할 때 중요 한 요소 했다. 우리는 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 농도 3 밀리미터에서 30 밀리미터에 증가 했다 villi 및 소장에 있는 지하실의 효율적인 분리 3 mM EDTA가 저 승 지하실에 대 한 충분 한 발견. 개발 된 포름알데히드/메탄올 기정 프로토콜 antigenicity microtubules, 말라와 최종 바인딩 (EB) 단백질의 효과적인 라벨에 대 한 보존 하는 동안 아주 좋은 구조 보존을 했다. 그것은 또한 centrosomal 단백질 ninein 메탄올 프로토콜 일 더 일관 되 게 비록 근무. 우리는 더 고정 및 microtubules과 관련 된 단백질의 면역 라벨 organoids에서 격리 또는 지 매트릭스 내 남아 있는과 달성 될 수 있었다 설립.
Apico 기초 극성으로 epithelia의 형성 개발에서 기본 과정 이며 microtubules centrosomal 단백질의 극적인 개편을 포함 한다. 방사형 microtubule 배열 위치 centrosomal microtubule 센터 조직에서 나오는 (MTOC) 많은 동물 세포에서 저명한 이며 이것이 비교적 평평한 세포에 적합. 반면, 원주 상피 세포, 소장의 그들과 같은 더 나은 모양 및 이러한 셀의 특수 기능을 지 원하는 비 방사형 transcellular microtubule 배열 조립. microtubules의이 극적인 개편 transcellular microtubules1,2 의 앵커리지에 대 한 책임 되는 centrosome 꼭대기와 꼭대기 비 centrosomal MTOCs (n MTOCs) 형성, 이동에 의해 이루어집니다. , 3 , 4 , 5.
상피 분화와 관련된 microtubule 개편의 우리의 지식을 많은 2D 체 외에서 세포 층 vivo에서 조직 아키텍처를 표시 하지 않는의 조사에서 왔다. 6Clevers와 동료 의해 개척 organoid 문화, 3 차원 생체 외에서 개발 그들은 모방 vivo에서 아키텍처 및 개발 주요 기술적 진보를 나타냅니다. 상피 분화의 계층은 분명 소장; 지하실의 하단에 줄기 세포 미 숙 이동 증폭 세포를 증식 하 고 점차적으로 그들은 완전히 이전 되 고 분화 되는 작은 장 모 또는 저 승 표면에 토 굴을 마이그레이션할로 차별화를 일으키합니다 루멘7에 창. 중요 한 것은,이 장 organoids 줄기 세포 틈새에서 셀 이후에 아래와 낭종 지역으로 점차적으로 진행 하는 차별화에 줄기 세포와 토 굴 같은 싹을 생성 하는 형성 cysts을 증식에 복제 됩니다. 이 모 같은8된다. 장 organoid 따라서 microtubule 상피 분화 하지만 다른 수많은 단백질 뿐만 아니라, 의약품 및 식품의 심사에 대 한 이상적인 플랫폼을 제공 하는 동안 centrosomal 개편 뿐만 아니라 공부 하 고 강력한 모델을 나타냅니다. 화합물의 잠재적인 치료 혜택9,10.
Organoids 형광 태그 단백질의 라이브 이미징에 대 한 적합은 둘 다 노크-에서 노크 아웃 organoids11,12편집 CRISPR/Cas9 유전자를 사용 하 여 생성 될 수 있습니다. 그러나, 식 및 공부 생 단백질의 지역화 설정 태그 단백질의 동작을 확인 하기 위해 특히 중요 하다. 면역 라벨 3D organoids 지 매트릭스 또는 전 비보 고립에서 성장 조직 차원에서 문화 요리에서 성장 하는 세포 보다 더 복잡 하다. 기정 프로토콜 (즉, 항 체 바인딩을 위한 epitopes) 항 체 antigenicity 유지 하면서 organoids의 섬세 한 3D 건축을 보존 해야 합니다. 예를 들어 4 %paraformaldehyde (PFA) 일반적으로 정착 액으로 사용 하지만 상대적으로 빠른 행동 정착 액은 그것 좋은 형태 보존을 제공 하는 동안 우리의 경험에 그것 자주 antigenicity의 손실 귀착되 고 많은 적합 하지 않습니다. centrosomal 항 체입니다. 3 차원 구조와 조직에 침투 하는 정착 제와 항 체의 능력 또한 고려 되어야 한다. 이 위해, 우리 수정 하 고 조직 격리 및 간접 면역 3 차원 생체 외에서 organoids 및 전 비보 의 라벨에 대 한 개발된 프로토콜 고립 장 조직. 우리는 작은 장 지하실과 villi 조직과 저 승, 격리 하 고 해결 하 고 지하실 매트릭스 내에서 면역 라벨 대신 3D organoids의 격리에 대 한 프로토콜을 포함 하는 방법을 설명 합니다. 선물이 microtubules와 centrosomal, ninein, 등 단백질과의 microtubule 플러스-엔드 추적 단백질 (+ 팁), EB 단백질 및 클립-170 (참고 참조8, 같은 면역 라벨에 대 한 세 가지 대안 기정 프로토콜 13). 우리는 또한 각 프로토콜 관련 된 장단점 토론.
장 조직의 절연
작은 장 지하실과 villi 저 승 지하실의 분리 막 표면, EDTA 솔루션 셀 연락처, 분류 (동요) 및 원심 분리를 완화 하는 치료를 노출 포함 됩니다. 제시 장 villi/토 굴 격리 프로토콜 Belshaw 외. 화이트 헤드 외 에서 수정 되었습니다. 17 , 18
점 막 표면 노출
우리가이 절차의 개발에 장내 관의 점 막 표면 노출 방법의 번호와 실험을 했습니다. 기존의 방식 (안쪽 바깥쪽으로 회전) evert 것 세그먼트 약 100 m m 긴, 보통 튜브 튜브19위로 미끄러져 한쪽 끝 그리고 나머지 튜브에 조직의 배에 잡은 금속 막대를 사용 하 여. 마우스 조직에 대 한 끝부분을 금속 막대 (2.4 m m 직경)는 이상적 이다. 이 방법은 PBS와 EDTA에 대 한 더 나은 액세스를 허용 하는 점 막 표면 확대의 이점이 있습니다. 우리는 처음이 접근 방식을 사용 하지만 짧은 길이 (약 5cm)으로 튜브를 절단 하 고이 쉽게 입증가 위를 해 부와 각 섹션을 열고로 이동. 이 방식은 적절 한 경우에 몇 가지 내장이 필요; 경우 더 많은 동물을 했다 그러나 사용 실험에서 다음 목적 장치 절단 열기 튜브 경도, 요네다 외 설명 14 더 효율적일 것 이다입니다.
Villi와 근육 층에서 지하실의 분리
처음 우리 느슨하게 기본 조직17,18점 막 표면에 3 mM EDTA PBS에 비교적 긴 보육 시간 최대 60 분의 사용. EDTA의이 농도에서 우리는 보육 시간 30 분의 마우스 콜론 으로부터 지하실을 풀고 충분 한 발견. 그러나, 소장 토 굴/모 격리에 대 한 효율적인 접근 입증 짧은 시간에 대 한 더 많은 집중된 EDTA를 사용 하 여 것이 보았습니다. 모든 후속 작업 생성 villi 또는 지하실에 대 한 관련 분수 30 mM EDTA 기법을 사용 하 여 추출 하는 조직으로 착수 했다. 지하실, 우리가 일반적으로 고정 하기 전에 분수 3-5을 풀링된 하지만 타이밍 창 자 위치 등 요인의 숫자, 마우스, 염증, 이전 다이어트의 나이에 따라 달라 집니다로이 적절 한 분수 지 확인 하는 것이 중요 하다 등 유사 하 게, 시간 조직 EDTA 치료 효과 따라 흔들릴 필요가 다른 조건 하에서 다를 수 있습니다. 격리 된 조직 분수 villi 지하실 또는 주로 villi 및 지하실 (그림 2)의 혼합물을 포함 하는. 콜론 없는 villi로 토 굴 추출 수 있습니다 달성 한 단계에 30에 대 한 튜브에 조직을 떨고 하 여 s. 이 분수 다음 고정 하 고 면역 라벨에 대 한 처리 수 있습니다.
지 매트릭스에서 장 organoids의 격리
절연 지 매트릭스 돔에서 organoids의 세포 복구 솔루션을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. Depolymerizing gelled 지하실 매트릭스 하지만 온도 필요 2-8 ° c.에 의해 작동 하는 솔루션 주의의 참고는 동적 microtubules 유지 되지 않을 수 있습니다. 따라서, 동적 microtubules의 면역 라벨에 대 한과 + EBs 셀 등 팁, 고정 이전 지 매트릭스에서 복구 권장 하지 않습니다. 그러나, 차별화 organoid 셀에 microtubules의 대부분은 상대적으로 안정적인 고이 (그림 6)를 보존 했다. 그것은 또한 세포 마커 뿐만 아니라 centrosomal 및 접합 단백질의 면역 라벨에 대 한 잘 일했다.
기정 프로토콜
포름알데히드 (PFA에서 만든 갓) 가역 형성 하는 상대적으로 빠른 연기 정착 액 크로스 링크 이며 4 %PFA 등 면역 라벨 microtubules 및 감마-tubulin Phalloidin 얼룩 걸 필 라 멘 트를 위해 잘 작동 합니다. 더 잘 근무 등 면역 라벨 토 굴 줄기 세포 틈새 시장 내에서 줄기 세포 마커 Lgr5 및 Paneth 세포 마커 CD24와 PFA의 높은 농도 작동 하지 않았다 동안 1 %PFA 솔루션을 희석.
도의 추가 제공 microtubules 3.7 %PFA, 0.05%도 및 PHEMO 버퍼 (68 m m 파이프, 25mm HEPES, 15mm EGTA 및 3mm MgCl2)2 에서 0.5% 세제의 혼합물로 구성 된 이른바 PHEMO 고정의 더 나은 보존 antigenicity을 타협 하지 않고 microtubules의 우수한 보존을 제공 합니다. 그것은 또한 면역 라벨 감마-tubulin, β-catenin, 그리고 E-cadherin, phalloidin 착 걸 필 라 멘 트에 대 한 잘 작동합니다. 그러나, 3 차원 조직, organoid 문화 PHEMO 고정 일관성 없는 결과 생산 하 고 그러므로 사용 하지.
메탄올은 상대적으로 잘 침투를 제공 하 고 antigenicity을 보존 하는 경향이 응집 정착 액. 100% 메탄올 (-20 ° C)와 고정 어떤 수축 량을 소개 하 고 적당 한 형태 보존을 제공 microtubules, + 팁, 그리고 ninein를 포함 하 여 2 차원 세포 배양에 많은 centrosomal 항 체에 대 한 작동 합니다. 그러나, 일부 organoids이 고정 방법을 사용할 때 쓰 러 졌다. 또한, 전체 지하실, villi, 또는 organoids를 통해 항 체의 보급률은 처음에 문제가 있지만 0.1% 세제 세척 솔루션을 장기간된 세척의 추가 더 나은 결과 달성.
포름알데히드와 메탄올의 조합이 Rogers 그 외 여러분 에 의해 사용 이전 했다 20 에 면역 레이블 EB1 초파리. 포 름 알 데히드의 혼합물을 기반으로 고정 프로토콜 및 메탄올 따라서 개발 장 조직 및 organoids 3% 포름알데히드와 97% 메탄올-20 ° C에 냉장 하지만 로저스에 의해 사용 되었다 혼합물에서 탄산 나트륨 5 m m를 생략에 따라 외. 20 또한, 샘플-20 ° c.에 냉장고에서 수정 된 이 특히 면역 라벨에 대 한 잘 + 클립-170 등 EBs, 팁, 근무 하지만 또한 우수한 고정 및 면역 라벨 microtubules 및 조직 및 3D organoids 내 걸 입증 했다. 아주 좋은 구조 보존 되었다 분명 하 고 메탄올으로 더 일관 되 게 일 ninein에 대 한 라벨 비록 antigenicity 감마-tubulin 등 ninein, centrosomal 단백질 뿐만 아니라 여러 cytoskeletal와 관련 된 단백질에 대 한 보존 되었다 고정입니다.
The authors have nothing to disclose.
저자 폴 토마스 현미경 조언과 도움 감사합니다. 여기에 관련 된이 작품은 BBSRC에 의해 지원 되었다 (no를 부여 합니다. M.M.M. 및 T.W. BB/J009040/1).
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | washing and PFA |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | isolate organoids |
lobind microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30108116 | prevent cells sticking |
0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | Sigma | 03690-100ML | Crypt isolation |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 11517532 | Isolate crypts from villi |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | detergent |
goat serum | Sigma | G6767 | blocking agent |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | used as non-stick agent | |
Paraformaldehyde, 4% in PBS | Alfa Aesar | J61899 | fixative |
Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) | Sigma | F8775 | used as fixative |
Methanol 99.9% Analytical grade | Fisher | M/4000/17 | used as fixative |
MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit | Maxvision Biosciences |
MF01-S | commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling |
Rotator SB2 or SB3 | Stuart | microcentrifuge tube rotator | |
Sodium citrate | antigen retrieval | ||
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | mountant |
DABCO – 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802 | anti-fade agent |
Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges | Clarity | N/C366 | slides |
Glass coverslip – thickness no. 1, 22 x 50 mm | Clarity | NQS13/2250 | coverslips |
Matrigel | Corning | 356231 | Basement matrix for 3D organoid culture |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | for processing tissue/organoids |
15 mL conical tubes | Sarstedt | 62.554.502 | for processing tissue/organoids |
1.5 mL LoBind tubes | Eppendorf | 30108051 | for isolated organoids |
Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | primary antibody 1:500 |
Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody | Abcam | ab6160 | primary antibody 1:100 |
Rabbit alpha-tubulin antibody | Abcam | ab15246 | primary antibody 1:100 |
Rabbit anti-beta-actin antibody | Abcam | ab8227 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal anti-p150Glued antibody | BD Bioscience | 610473/4 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal EB3KT36 antibody | Abcam | ab53360 | primary antibody 1:200 |
Mouse monoclonal EB1 antibody | BD Bioscience | 610535 | primary antibody 1:200 |
Rabbit anti-Lgr5 antibody | Abgent | AP2745d | primary antibody 1:100 |
Dylight anti-rat 488 | Jackson | 112545167 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-mouse 488 | Jackson | ST115545166 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-rabbit 647 | Jackson | 111605144 | seconday antibody 1:400 |