Vi presenterer protokoller for isolering av intestinal 3D strukturer fra i vivo vev og i vitro kjelleren matrix innebygd organoids, og detaljer forskjellige fiksering og Fargeprotokoller optimalisert for immuno-merking av microtubule, centrosomal og junctional proteiner også som celle indikatorer inkludert stamcelleforskningen protein Lgr5.
Ankomsten av 3D i vitro organoids som etterligner i vivo vev arkitekturen og morphogenesis har sterkt avansert mulighet til å studere viktige biologiske spørsmål i cellen og utviklingsbiologi. I tillegg lover organoids sammen med de siste tekniske utviklingen innen genet og viral gen levering å fremme medisinsk forskning og utvikling av nye legemidler for behandling av sykdommer. Organoids dyrket i vitro i kjelleren matrise gir kraftig modellsystemer for å studere atferd og funksjon av og er godt egnet for live-imaging fluorescerende-merket proteiner. Men er etablering uttrykk og lokalisering av endogene proteiner i ex vivo vev og i vitro organoids viktig å kontrollere atferden til merket proteiner. Dette har vi utviklet og endret vev isolasjon, fiksering og immun-merking protokoller for lokalisering av piskehale som henger, centrosomal og tilhørende proteiner i ex vivo tarmen tissue og i vitro intestinal organoids. Målet var bindemiddel å bevare 3D arkitektur organoids/vevet samtidig bevare antistoff antigenicity og aktivere god penetrasjon og rydding av bindemiddel og antistoffer. Eksponering for kulde depolymerizes alle, men stabil piskehale som henger, og dette var en viktig faktor når du endrer ulike protokollene. Vi fant at øker ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) konsentrasjonen fra 3 mM til 30 mM ga effektiv avdeling av villi og Krypter i tynntarmen mens 3 mM EDTA var tilstrekkelig for colonic Krypter. Utviklet formaldehyd/metanol fiksering protokollen ga veldig god strukturell bevaring samtidig bevare antigenicity for effektiv merking av piskehale som henger, utgangen og slutten-binding (EB) proteiner. Det har også jobbet for centrosomal protein ninein selv om metanol protokollen arbeidet mer konsekvent. Videre etablerte vi at fiksering og immun-merking av piskehale som henger og tilhørende proteiner kan oppnås med organoids isolert fra eller resterende innen kjelleren matrix.
Dannelse av epithelia med apico-basale polariteten er en grunnleggende prosess i utviklingen og innebærer en dramatisk omorganisering av piskehale som henger og centrosomal proteiner. En sirkulær microtubule matrise fra et sentralt centrosomal microtubule organisere center (MTOC) er fremtredende i mange dyreceller og dette er godt egnet for relativt flat celler. Derimot samle kolonne epitelceller, som de av tarmen, ikke-radielt transcellular microtubule matriser som bedre støtte form og spesialiserte funksjoner til disse cellene. Denne dramatiske omorganisering av piskehale som henger oppnås ved centrosome flytte til toppen og apikale ikke-centrosomal MTOCs (n-MTOCs) utgjør, som blir ansvarlig for anchorage til transcellular piskehale som henger1,2 , 3 , 4 , 5.
Mye av vår kunnskap om epithelial differensiering og tilknyttede microtubule omorganiseringen har kommet fra undersøkelser av 2D i vitro celle lag som ikke vises i vivo vev arkitektur. Utviklingen av 3D i vitro organoid kulturer, utviklet av Clevers og kolleger6, representerer en stor teknologisk fremgang som de etterligner i vivo arkitektur og utvikling. Et hierarki av epitelial differensiering er tydelig i tarmen; stamceller nederst Krypter gi opphav til umodne transitt forsterke celler som sprer og gradvis skille som de migrere opp krypten på små intestinal villus eller colonic overflaten, hvor de blir fullt differensiert før de blir kaste inn lumen7. Viktigere, replikeres dette i intestinal organoids der sprer celler fra stamcelleforskningen nisje danner cysts det deretter genererer krypt-lignende knopper med stamceller nederst og differensiering gradvis framover mot regionen cyste som blir villus-lignende8. Den intestinal organoid representerer derfor en kraftig modell å studere ikke bare microtubule og centrosomal omorganisering epithelial differensiering, men mange andre proteiner, samt gir en ideell plattform for screening av narkotika og mat forbindelser av potensielle terapeutiske fordeler9,10.
Organoids er godt egnet for live-imaging fluorescerende-merket proteiner og begge knock-i og Bank-out organoids kan genereres ved hjelp av CRISPR/Cas9 gene redigering11,12. Men er etablering uttrykk og lokalisering av endogene proteiner studier viktig, spesielt for å kontrollere virkemåten til merket proteiner. Immuno-merking 3D organoids vokst i kjelleren matrise eller ex vivo isolert vev er mer kompleks enn celler dyrket i kultur retter i 2D. Fiksering protokollen må bevare delikat 3D arkitektur organoids samtidig bevare antistoff antigenicity (dvs., epitopes for innbinding antistoffer). For eksempel 4% paraformaldehyde (PFA) brukes ofte som men mens det er et relativt raske fungerende bindemiddel og gir god morfologiske bevaring, i vår erfaring det ofte resulterer i tap av antigenicity og er ikke egnet for mange centrosomal antistoffer. Muligheten for bindemiddel og antistoffer å trenge 3D strukturer og vev bør også vurderes. Dette har vi endret og utviklet protokoller for vev isolasjon og indirekte immuno-merking av 3D i vitro organoids og ex vivo isolert tarmen tissue. Vi beskriver hvordan å isolere liten intestinal Krypter og villi og colonic vev, og inkluderer en protokoll for isolering av 3D organoids idet en alternativ å fikse og immun-merking i kjelleren matrix. Vi presenterer tre alternative fiksering protokoller for immuno-merking av piskehale som henger og centrosomal proteiner, slik som ninein, og microtubule plus-ende-sporing proteiner (+ TIPs), for eksempel EB proteiner og klipp-170 (se også referanser8, 13). Vi også diskutere fordeler og ulemper knyttet til hver protokoll.
Isolering av tarmen tissue
Isolasjon av små intestinal Krypter og villi og colonic Krypter innebærer utsette slimhinnen, behandling med EDTA løsning å løsne celle kontakter, fraksjoneres (rister) og sentrifugering. Presentert intestinal villi/krypten isolasjon protokollen har blitt endret fra Belshaw et al. og Whitehead et al. 17 , 18
Utsette slimhinnen
Vi har eksperimentert med en rekke tilnærminger til å eksponere slimhinnen av tarmkanalen i utviklingen av denne prosedyren. En klassisk tilnærming er å evert (slå genseren) røret, vanligvis i segmenter 100 mm lang, ved hjelp av et metall stang som er fanget i en fold av vev i ene enden og gjenværende røret gled over tube19. For musen vev er metall stang (2,4 mm diameter) med avrundede ender ideelt. Denne tilnærmingen har fordelen av å utvide slimhinnen bedre tilgang til PBS og EDTA. Vi først benyttet denne tilnærmingen, men flyttet til kutte røret i korte lengde (ca 5 cm) og åpne hver del med dissekere saks som dette bevist enklere. Denne tilnærmingen er riktig hvis bare noen tarmen er obligatoriske. men hvis flere dyr skulle bli brukt i et eksperiment deretter en spesialbygd enhet for skjæring åpne røret langs, som beskrevet av Yoneda et al. 14 ville være mer effektiv.
Avdeling av villi og Krypter fra muskel laget
Først brukte vi 3 mM EDTA i PBS og relativt lange inkubasjonstiden ganger opptil 60 min for å løsne slimhinnen fra underliggende vev17,18. På denne konsentrasjonen av EDTA fant vi en inkubering periode av 30 min var tilstrekkelig til å løsne Krypter fra musen kolon. Men for tynntarmen krypten/villus isolasjonen prøvde vi å bruke mer konsentrert EDTA i kortere tid, som viste seg for å være en effektiv tilnærming. Alle påfølgende arbeid ble foretatt med vev utdraget benytter 30 mM EDTA teknikken generere relevante brøker for villi eller crypts. Krypter, vi samlet normalt fraksjoner 3-5 før Utbedring men det er viktig å sjekke om dette er riktig fraksjoner som tidsberegningene vil avhenge av en rekke faktorer som plasseringen langs tarmkanalen, alder av musen, betennelse, tidligere diet , etc. , hvor lenge vevet må ristes etter EDTA behandling å være effektive variere under ulike forhold. Resultatet er isolert vev brøker som inneholder en blanding av villi og Krypter eller hovedsakelig villi eller crypts (figur 2). Som det er ingen villi i tykktarmen, krypten utvinning kan være oppnåelig i ett trinn ved å riste vevet i røret for 30 s. Disse fraksjoner kan deretter fast og behandles for immuno-merking.
Isolering av intestinal organoids fra kjelleren matrisen
Isolasjonen av organoids fra kjelleren matrix kupler kan oppnås ved hjelp av cellen gjenopprettingsløsning. Løsningen fungerer ved depolymerizing gelled kjelleren matrisen men temperaturen må være 2-8 ° C. Advarsel er at dynamisk piskehale som henger ikke beholdes. Derfor, for immuno-merking av dynamisk piskehale som henger og + TIPs som EBs cellen, utvinning fra kjelleren matrisen før fiksering er ikke anbefalt. Men de fleste av de piskehale som henger i unike organoid cellene er relativt stabil, og dette ble bevart (figur 6). Det fungerte også bra for immuno-merking av centrosomal og junctional proteiner som cellen markører.
Fiksering protokoller
Formaldehyd (ferske fra PFA) er et relativt rapid-fungerende bindemiddel som danner reversibel cross-links 4% PFA fungerer godt for eksempel i immuno-merking piskehale som henger og gamma-tubulin og flekker begrepsordbok filamenter med Phalloidin. Mer fortynne PFA løsninger som 1% fungerte bra for immuno-merking for eksempel med stilk cellen markørene Lgr5 og Paneth cellen merket CD24 innen krypten stamcelleforskningen nisje, mens høyere konsentrasjoner av PFA ikke fungerte.
Tillegg av glutaraldehyde gir bedre bevaring av piskehale som henger og såkalte PHEMO fiksering som består av en blanding av 3,7% PFA, 0,05% glutaraldehyde og 0,5% vaskemiddel i PHEMO buffer (68 mM rør, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA og 3 mM MgCl2)2 gir utmerket bevaring av piskehale som henger uten å svekke antigenicity. Det fungerer også godt for immuno-merking gamma-tubulin, β-catenin, og E-cadherin og flekker begrepsordbok filamenter med phalloidin. Men i 3D vev og organoid kulturer, PHEMO fiksering produsert inkonsekvente resultater og var derfor ikke brukes.
Metanol er et coagulant bindemiddel som gir relativt god penetrasjon og tendens til å beholde antigenicity. Fiksering med 100% metanol (20 ° C) introduserer noen krymping, gir moderat morfologi bevaring og arbeider for piskehale som henger, + TIPs og mange centrosomal antistoffer inkludert ninein i 2D cellekulturer. Noen organoids kollapset imidlertid når du bruker denne fiksering metoden. I tillegg penetrasjon av antistoffer gjennom hele Krypter, villi eller organoids var opprinnelig et problem men tillegg av 0,1% vaskemiddel vaskeløsning og langvarig vask oppnådd bedre resultater.
En kombinasjon av formaldehyd og metanol hadde tidligere blitt brukt av Rogers et al. 20 til immuno-label EB1 i Drosophila. En fiksering protokoll basert på en blanding av formaldehyd og metanol ble derfor utviklet for tarmen tissue og organoids basert på 3% formaldehyd og 97% metanol nedkjølt til 20 ° C, men utelater 5 mM natriumkarbonat fra blandingen som ble brukt av Rogers et al. 20 i tillegg prøver ble løst i fryseren på 20 ° C. Dette fungerte spesielt godt for immuno-merking + TIPs, som CLIP-170 og EBs, men også viste seg utmerket for feste og immun-merking piskehale som henger og utgangen innen vev og 3D organoids. Veldig god strukturell bevaring var tydelig og antigenicity ble bevart for flere cellen cytoskjelett og tilhørende proteiner, samt centrosomal proteiner som gamma-tubulin og ninein, selv om merkingsteknikker for ninein arbeidet mer konsekvent med metanol fiksering.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Paul Thomas for mikroskop råd og hjelp. Dette arbeidet involvert her ble støttet av BBSRC (gi nei. BB/J009040/1 M.M.M. og T.W.).
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | washing and PFA |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | isolate organoids |
lobind microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30108116 | prevent cells sticking |
0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | Sigma | 03690-100ML | Crypt isolation |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 11517532 | Isolate crypts from villi |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | detergent |
goat serum | Sigma | G6767 | blocking agent |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | used as non-stick agent | |
Paraformaldehyde, 4% in PBS | Alfa Aesar | J61899 | fixative |
Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) | Sigma | F8775 | used as fixative |
Methanol 99.9% Analytical grade | Fisher | M/4000/17 | used as fixative |
MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit | Maxvision Biosciences |
MF01-S | commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling |
Rotator SB2 or SB3 | Stuart | microcentrifuge tube rotator | |
Sodium citrate | antigen retrieval | ||
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | mountant |
DABCO – 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802 | anti-fade agent |
Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges | Clarity | N/C366 | slides |
Glass coverslip – thickness no. 1, 22 x 50 mm | Clarity | NQS13/2250 | coverslips |
Matrigel | Corning | 356231 | Basement matrix for 3D organoid culture |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | for processing tissue/organoids |
15 mL conical tubes | Sarstedt | 62.554.502 | for processing tissue/organoids |
1.5 mL LoBind tubes | Eppendorf | 30108051 | for isolated organoids |
Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | primary antibody 1:500 |
Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody | Abcam | ab6160 | primary antibody 1:100 |
Rabbit alpha-tubulin antibody | Abcam | ab15246 | primary antibody 1:100 |
Rabbit anti-beta-actin antibody | Abcam | ab8227 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal anti-p150Glued antibody | BD Bioscience | 610473/4 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal EB3KT36 antibody | Abcam | ab53360 | primary antibody 1:200 |
Mouse monoclonal EB1 antibody | BD Bioscience | 610535 | primary antibody 1:200 |
Rabbit anti-Lgr5 antibody | Abgent | AP2745d | primary antibody 1:100 |
Dylight anti-rat 488 | Jackson | 112545167 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-mouse 488 | Jackson | ST115545166 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-rabbit 647 | Jackson | 111605144 | seconday antibody 1:400 |