Мы представляем протоколы для изоляции кишечных 3D конструкций из ткани в естественных условиях и в пробирке подвале матрица встроенного organoids и подробно различные фиксации и пятная протоколы, оптимизированный для иммуно маркировки микротрубочек, centrosomal и соединительной белки также как ячейки маркеры, включая стволовых клеток белка Lgr5.
Появлением organoids 3D в пробирке , которые имитируют в vivo ткани архитектуры и морфогенез значительно расширить возможности для изучения ключевых биологических вопросов в клетке и биологии развития. Кроме того organoids вместе с последних технических достижений в ген редактирования и вирусных генов доставки обещает продвижения медицинских исследований и разработки новых препаратов для лечения заболеваний. Organoids выращенных в пробирке в подвале матрицы обеспечивают мощную модель системы для изучения поведения и функции различных белков и хорошо подходят для жить изображений меткой флуоресцентных белков. Однако создание выражения и локализации эндогенного белков в ex vivo ткани и в пробирке organoids имеет важное значение для проверки поведения тегами белков. С этой целью мы разработали и изменения тканей изоляции, фиксации и иммуно маркировки протоколы для локализации микротрубочек, centrosomal и связанных с ней белков в ex vivo кишечника ткани и в пробирке кишечных organoids. Целью было для фиксатором для сохранения 3D архитектура organoids/ткани также сохраняя антигенностью антитела и позволяет хорошее проникновение и распродажа фиксатором и антител. Воздействие холода depolymerizes все, но стабильные микротрубочки и это является ключевым фактором при изменении различных протоколов. Мы обнаружили, что увеличение Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) концентрации от 3 мм до 30 мм дал эффективное отряд ворсинки и склепы в тонкой кишке, в то время как ЭДТА 3 мм было достаточно для толстой склепы. Протокол фиксации развитых формальдегида/метанола дали очень хорошие структурных сохранения сохраняя при этом антигенностью для эффективного нанесения этикеток микротрубочек, актина и конец связывающих белков (EB). Он также работал для centrosomal белка ninein, хотя протокол метанола работал более последовательно. Далее мы установили, что фиксация и иммуно маркировки микротрубочек и связанных белков может быть достигнуто с organoids изолированы от или оставаясь в подвале матрицы.
Формирование эпителия с apico базальной полярности является основополагающим процесс развития и включает в себя драматической реорганизации микротрубочек и centrosomal белков. Массив радиальные микротрубочек, вытекающих из расположен centrosomal микротрубочки, организует центр (КТВМ) видно в многих животных клеток, и это хорошо подходит для сравнительно плоские клетки. В противоположность этому столбчатых эпителиальных клеток, таких, как те из кишечника, собрать-радиальная transcellular микротрубочки массивы, которые лучше поддерживать форму и специализированные функции этих клеток. Это драматической реорганизации микротрубочек достигается Центросома, переход к вершине и апикальной не centrosomal MTOCs (n-MTOCs) формирования, который становится ответственным за Анкоридж микротрубочек transcellular,1,,2 , 3 , 4 , 5.
Большая часть наших знаний эпителиальных дифференциации и связанные микротрубочек реорганизации пришла из исследования 2D в vitro слои клеток, которые не отображаются в vivo ткани архитектуры. Разработка 3D в vitro органоид культур, впервые,6Clevers и коллегами, представляет собой крупные технологические улучшения как они имитируют в vivo архитектуры и развития. Иерархия эпителиальных дифференциация проявляется в кишечнике; Стволовые клетки в нижней части склепы порождают незрелых транзита, усиливая клетки, которые размножаются и постепенно дифференцировать как они мигрируют вверх склеп на небольшой кишечных ворсинок или толстой поверхность, где они становятся полностью дифференцированной до того, как сарай в просвете7. Важно отметить, что это реплицируется в кишечных organoids, где клетки от ниши стволовых клеток пролиферировать образуя кисты, которые впоследствии сформировать бутоны склеп как с помощью стволовых клеток на дне и дифференциации, постепенно продвигается к кисты региона, который становится ворсинок как8. Кишечные органоид поэтому представляет мощную модель для изучения не только микротрубочек и centrosomal реорганизации во время дифференцировки эпителия, но многочисленные другие белки, а также обеспечивая идеальную платформу для скрининга наркотиков и продовольствия соединений потенциал терапевтические преимущества9,10.
Organoids хорошо подходят для жить изображений меткой флуоресцентных белков и оба забивные и organoids нокаут-может быть создан с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования11,12. Однако создание выражения и локализации эндогенного белков для изучения важно, особенно для проверки поведения тегами белков. Иммуно маркировки 3D organoids, выращенных в подвале матрицы или ex vivo изолированные ткани является более сложным, чем клетки выросли в культуре блюда в 2D. Протокол фиксации необходимо сохранить деликатные 3D архитектура organoids сохраняя антигенностью антитела (то есть, epitopes для связывания антител). К примеру параформальдегида 4% (PFA) обычно используется как фиксатор, но пока это относительно быстрый обязанности фиксатором и дает хорошие морфологические сохранения, в наш опыт это часто приводит к потере антигенностью и не подходит для многих centrosomal антител. Следует также рассмотреть фиксатором и антител способность проникать 3D конструкций и тканей. С этой целью мы изменили и развитых протоколы для изоляции тканей и косвенные иммуно маркировки 3D в vitro organoids и ex vivo изолированных кишечных тканей. Мы опишем, как изолировать малого кишечника склепы и ворсинки и толстой ткани, и включить протокол для изоляции 3D organoids как альтернатива для фиксации и иммуно маркировки в матрице подвале. Мы представляем три альтернативных фиксации протоколы для иммуно маркировки микротрубочек и centrosomal белков, таких как ninein, и микротрубочек плюс конец отслеживания белков (+ советы), таких как белки EB и клип-170 (см. также ссылки8, 13). Мы также обсудить достоинства и недостатки, связанные с каждым протоколом.
Изоляция кишечника ткани
Изоляция малого кишечника склепы и ворсинки и толстой склепы предполагает, подвергая поверхность слизистой оболочки, лечение с ЭДТА решение ослабить ячейку контакты, фракционирование (встряхивания) и центрифугирования. Протокол изоляции представленных кишечных ворсинок/склеп был изменен от Belshaw et al. и Уайтхед и др. 17 , 18
Подвергая поверхность слизистой оболочки
Мы экспериментировали с целый ряд подходов к разоблачить поверхности слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта в развитии этой процедуры. Классический подход является Эверт (поворот наизнанку) трубка, обычно в сегментах около 100 мм в длину, с помощью металлического стержня которое перехватывается в складку ткани на одном конце, а затем оставшиеся трубки скользнул через трубу19. Для мыши ткани идеально металлический стержень (2,4 мм) с закругленными кончиками. Этот подход имеет преимущество расширения поверхности слизистой оболочки, позволяя более широкого доступа к PBS и ЭДТА. Мы изначально используется этот подход, но переехал в резки трубки в короткой длины (около 5 см) и открытия каждой секции с рассечения ножницы, как это оказалось проще. Этот способ уместен, если только несколько кишечника требуется; но если больше животных должны были быть использованы в эксперименте затем устройство специально для резки открыть трубку продольно, как описано в Йонеды et al. 14 будет более эффективным.
Отряд ворсинки и склепы из мышечных слоя
Сначала мы использовали 3 мм ЭДТА в PBS и относительно длительный инкубационный период до 60 мин ослабить поверхности слизистой оболочки из основной ткани17,18. На этой концентрации ЭДТА мы обнаружили, что время инкубации 30 минут было достаточно, чтобы ослабить склепы из мыши кишки. Однако для изоляции склеп/ворсинок тонкой кишки мы стараемся, используя более концентрированной ЭДТА за более короткое время, которое оказалось эффективным подходом. Все последующие работа была проведена с ткани, извлеченные с помощью метода ЭДТА 30 мм, создания соответствующих фракций ворсинки или склепы. Для склепы мы обычно объединяют фракции 3-5 до фиксации, но важно проверить, являются ли эти соответствующих фракций как таймингов будет зависеть от ряда факторов, таких как положение вдоль желудочно-кишечного тракта, возраст мышь, воспаление, Предыдущая диета , и т.д. аналогичным образом, продолжительность времени, ткани необходимо быть поколеблен после ЭДТА лечение эффективным могут отличаться в различных условиях. В результате получается фракции изолированных ткани, содержащие смесь ворсинки и склепы или главным образом ворсинки или склепы (рис. 2). Как есть нет ворсинки в толстой кишке, склеп добыча может быть достижимыми в один шаг путем встряхивания ткани в тубе 30 s. Эти фракции можно затем фиксированной и обрабатываются для иммуно маркировки.
Изоляция кишечных organoids из подвала матрицы
Изоляция organoids с подвале матрица куполов можно достичь с помощью решения восстановления клеток. Решение работает на depolymerizing матрице загущенное подвал, но температура должна быть 2-8 ° C. Предостережение что динамический микротрубочки не могут быть сохранены. Таким образом, для иммуно маркировки динамических микротрубочек и + советы как EBs клеток, восстановления от подвала матрицы до фиксации не рекомендуется. Однако большинство микротрубочек в дифференциации органоид клетки являются относительно стабильными, и они были сохранены (рис. 6). Он также работал хорошо для иммуно маркировки centrosomal и соединительной белков, а также ячейки маркеры.
Фиксация протоколы
Формальдегид (свежеприготовленные из PFA) является относительно быстрого действия фиксатором, который формирует реверсивные cross-links, и 4% PFA работает хорошо для, например, в иммуно маркировки микротрубочек и гамма тубулина и окрашивания нитей актина с Фаллоидин. Более разбавлять PFA решения, такие как 1% хорошо работала для иммуно маркировки например, маркером стволовых клеток маркеры Lgr5 и Paneth ячейки CD24 в склепе ниши стволовых клеток, в то время как более высокие концентрации PFA не работает.
Добавление глютаральдегид дает лучшее сохранение микротрубочек и так называемые PHEMO фиксации, которая состоит из смеси 3,7% PFA, глютаральдегид 0,05% и 0,5% моющего средства в PHEMO буфера (68 мм трубы, мм 25 HEPES, 15 мм EGTA и 3 мм MgCl2)2 без ущерба для антигенностью дает отличную сохранность микротрубочек. Он также хорошо работает для иммуно маркировки гамма тубулина, β-катенина и E-Кадгерины и окрашивания нитей актина с Фаллоидин. Однако в 3D ткани и органоид культур, PHEMO фиксации несогласованные результаты и поэтому не использовался.
Метанол является коагулянта фиксатором, который дает относительно хорошее проникновение и стремится сохранить антигенностью. Фиксация с 100% метанола (-20 ° C) вводит некоторые усадка, дает умеренный морфология сохранение и работает микротрубочек, + советы и много centrosomal антител, включая ninein в 2D клеточных культур. Однако некоторые organoids рухнул при использовании этого метода фиксации. Кроме того проникновение антител через весь склепы, ворсинки или organoids первоначально было проблемой, но добавление 0,1% моющего средства промывочный раствор и длительное Стиральная достигнуты лучшие результаты.
Сочетание формальдегида и метанола ранее использовалось Роджерс и др. 20 -иммуно лейбл EB1 в дрозофила. Протокол фиксации на основе смеси формальдегида и метанола, поэтому был разработан для кишечных тканей и organoids, основанные на 3% формальдегида и 97% метанола охлажденным до-20 ° C, но пропуск карбонат натрия 5 мм из смеси, которая использовалась Роджерс и др. 20 Кроме того, образцы были установлены в холодильнике при температуре-20 ° C. Это работает особенно хорошо для маркировки immuno + советы, например КЛИПА-170 и EBs, но доказано также отлично подходит для фиксации и иммуно маркировки микротрубочек и актина в ткани и 3D organoids. Очень хорошо структурных сохранение было очевидным и антигенностью сохранилось несколько белков цитоскелета и связанных с ними, а также centrosomal белков, таких как гамма тубулина и ninein, хотя маркировки для ninein более последовательно работал с метанолом Фиксация.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Пол Томас за микроскопом консультации и помощь. Эта работа, здесь была поддержана СИББН (Грант нет. BB/J009040/1 м.м.м. и Т.У).
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | washing and PFA |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | isolate organoids |
lobind microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30108116 | prevent cells sticking |
0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | Sigma | 03690-100ML | Crypt isolation |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 11517532 | Isolate crypts from villi |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | detergent |
goat serum | Sigma | G6767 | blocking agent |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | used as non-stick agent | |
Paraformaldehyde, 4% in PBS | Alfa Aesar | J61899 | fixative |
Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) | Sigma | F8775 | used as fixative |
Methanol 99.9% Analytical grade | Fisher | M/4000/17 | used as fixative |
MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit | Maxvision Biosciences |
MF01-S | commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling |
Rotator SB2 or SB3 | Stuart | microcentrifuge tube rotator | |
Sodium citrate | antigen retrieval | ||
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | mountant |
DABCO – 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802 | anti-fade agent |
Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges | Clarity | N/C366 | slides |
Glass coverslip – thickness no. 1, 22 x 50 mm | Clarity | NQS13/2250 | coverslips |
Matrigel | Corning | 356231 | Basement matrix for 3D organoid culture |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | for processing tissue/organoids |
15 mL conical tubes | Sarstedt | 62.554.502 | for processing tissue/organoids |
1.5 mL LoBind tubes | Eppendorf | 30108051 | for isolated organoids |
Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | primary antibody 1:500 |
Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody | Abcam | ab6160 | primary antibody 1:100 |
Rabbit alpha-tubulin antibody | Abcam | ab15246 | primary antibody 1:100 |
Rabbit anti-beta-actin antibody | Abcam | ab8227 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal anti-p150Glued antibody | BD Bioscience | 610473/4 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal EB3KT36 antibody | Abcam | ab53360 | primary antibody 1:200 |
Mouse monoclonal EB1 antibody | BD Bioscience | 610535 | primary antibody 1:200 |
Rabbit anti-Lgr5 antibody | Abgent | AP2745d | primary antibody 1:100 |
Dylight anti-rat 488 | Jackson | 112545167 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-mouse 488 | Jackson | ST115545166 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-rabbit 647 | Jackson | 111605144 | seconday antibody 1:400 |