Summary
软骨骨愈合过程中骨折愈伤组织发育的评价是监测愈合进程的关键。在这里, 我们报告的使用磁共振成像 (mri) 兼容外固定器的小鼠股骨, 允许 mri 扫描在小鼠骨再生。
Abstract
软骨骨折愈合是一个复杂的过程, 涉及发展的纤维, 软骨, 骨组织在骨折愈伤组织。骨痂中不同组织的数量为骨折愈合的进展提供了重要的信息。可用的体内技术纵向监测骨痂组织的发展在临床前骨折愈合研究中使用小动物包括数字造影和µCT 成像。然而, 这两种技术只能够区分矿化和 non-mineralized 组织。因此, 不可能区分软骨和纤维组织。相比之下, 磁共振成像 (MRI) 可视的解剖结构的基础上, 其含水量, 从而可以非识别软组织和软骨的骨折愈伤组织。在这里, 我们报告了使用 mri 兼容外固定器的小鼠股骨, 允许 mri 扫描在小鼠骨再生。实验表明, 该固定架和 custom-made 安装装置允许重复 MRI 扫描, 从而使纵向分析骨折-愈伤组织的发展。
Introduction
二次骨折愈合是最常见的骨愈合形式。这是一个复杂的过程, 模仿 ontogenic 软骨骨化的具体方面1,2,3。早期骨折血肿主要由免疫细胞、肉芽组织和纤维组织组成。低氧张力和高生物力学菌株在骨折间隙中阻碍成骨细胞分化, 但促进前体细胞分化成软骨细胞4,5,6。这些细胞在损伤部位开始增殖, 形成软骨基质, 提供骨折骨的初始稳定性。在愈伤组织成熟过程中, 软骨细胞变得肥大、凋亡或分化成成骨细胞。cartilage-to-bone 过渡区的新生血管提供了高氧水平, 使骨组织的形成7。骨折间隙骨桥接后, 生物力学稳定性提高, 外骨折愈伤组织发生破重塑, 获得生理骨轮廓和结构3。因此, 骨痂中纤维、软骨和骨组织的数量提供了骨骼愈合过程的重要信息。扰或延迟愈合变得可看见通过改变愈伤组织的发展在人和小鼠8,9,10,11。可用的体内技术纵向监测骨痂组织发育的临床前骨折愈合研究使用小动物包括数字造影和µCT 成像12,13。然而, 这两种技术只能够区分矿化和 non-mineralized 组织。相比之下, MRI 提供了优秀的软组织对比, 因此可以识别软组织和软骨在骨折愈伤组织。
先前的工作显示, 在膜骨缺损愈合15中, 在小鼠关节骨折的14和活体mri 检查中, 有希望的结果。然而, 这两项研究也表明空间分辨率和组织对比度有限。我们先前证明了高分辨率的体内 MRI 对小鼠软骨骨折愈合过程中软痂形成的纵向评估的可行性16。在这里, 我们报告的协议, 使用 MRI 兼容外固定器股骨截骨在小鼠, 以监测骨痂组织发展纵向在软骨骨折愈合过程。custom-made 安装装置的设计, 用于插入外固定架, 确保了在重复扫描过程中的标准化位置。
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Protocol
所有动物实验都遵守了对实验室动物的照顾和使用的国际规定, 并得到了区域管理当局的批准 (No. 1250、Regierungspr 和 #228; sidium T & #252; 宾, 德国)。所有小鼠每笼保持两到五只动物, 每个笼子上的 14 h 光, 10 小时黑暗的昼夜节律与水和食物提供了 ad 随意 .
1. 小鼠的外科材料和前处理的准备
- 对所有的外科材料进行消毒。使用灭菌温度为120-135 和 #176; C 用于20-30 分钟的灭菌时间.
- 从19-35 克体重之间的另一株 C57BL/6 中购买小鼠或小鼠。按照国家指导方针, 由调查人员和 #39 的机构动物保育和使用委员会批准, 遵循相应的动物保育和实验协议。在开始手术前至少允许7天的驯化期.
- 在手术前一天为所有小鼠提供镇痛, 直到第三个术后日.
2。外固定器的手术方法及应用
- 将鼠标置于预加载的5-7% 异氟醚和60毫升/分钟氧气管中。在失去姿势反射后, 从麻醉诱导管中取出鼠标, 并通过吸入面罩维持麻醉, 提供1-3% 异氟醚和60毫升/分钟的氧气。
- 监视麻醉过程中的呼吸模式和后爪反射。确保呼吸率是大约100周期/分钟和后爪反射缺席.
#8203; 注意: 所需的气体量取决于年龄、性别、体重和老鼠的应变.
- 监视麻醉过程中的呼吸模式和后爪反射。确保呼吸率是大约100周期/分钟和后爪反射缺席.
- 手术前, 用单一剂量的抗生素皮下注射注射小鼠 (克林霉素, 45 毫克/千克)。此外, 为了维持生理体液平衡, 将老鼠注入500和 #181 的皮下液体库; L 生理盐水 (0.9% 氯化钠).
- 防止角膜干燥, 用眼膏涂抹于老鼠眼。将鼠标放在37和 #176 的加热板上; C 在麻醉和手术过程中保持生理体温.
- 去除右后肢的皮毛, 用酒精消毒剂擦洗手术区。用不育手套的一小部分将右后爪盖住, 以避免消毒的部位。将右后肢消毒三次。在整个鼠标上放置一个无菌的褶皱, 除了手术区.
- 沿右侧股骨前侧用手术刀切开大约1厘米的皮肤。用微剪刀和镊子将 m. 股二头肌 和 m. 股外 分开。切断肌腱的起源和 #160; 一侧在股骨粗隆与一个微型剪刀, 允许自由进入骨外侧部分。确保坐骨神经被保存.
- 将外部固定架 (轴向刚度 3/毫米, 图 1 A ) 与股骨平行。手动钻孔通过皮质与0.45 毫米钻头和安置陶瓷安装销进入钻孔。从最接近的引脚开始, 其次是最远端的引脚, 和两个引脚之间。
- 在安装过程中确保固定架上没有张力、压缩或剪切应力, 否则由于固定器松弛, 达到截骨间隙将不足够.
- 用少量的无菌氯化钠 Humidify 骨, 以避免在锯切过程中出现脱水.
- 通过使用 0.4 mm 吉利线锯, 在两个内针之间的整个骨骼之间创建一个 0.4 mm 截骨.
注: 可选地, 振荡微锯可用于创建截骨。请务必避免在截骨区的锯的任何金属芯片. - 用2毫升无菌氯化钠冲洗截骨间隙, 清除两个骨折的皮质之间的骨头碎片.
- 通过连续缝合和可缝合来适应肌肉 (请参阅 材料表 )。然后使用间断的 non-resorbable 缝合来调整皮肤 (请参见 材料表 )。为避免伤口咬伤, 请勿将缝线放置在伤口的颅骨部位.
注意: 请勿使用皮肤胶或夹子, 因为小鼠通常会将其从伤口上移除, 造成皮肤进一步损伤. - 用消毒剂清洗手术区, 并将鼠标放进笼子. #160; 监视鼠标并提供足够的热量 ( 如 通过红外线), 直到完全清醒为止. #160; 在手术后监测水、食物摄入量和体重确保动物没有痛苦和苦恼。通过饮用水为所有小鼠提供镇痛, 直到第三天后.
注: 小鼠可容纳多达四动物组. - 在手术后1到5天监视鼠标和 #39 的活动。在那段时间里, 老鼠应该在操作的肢体上承受重量。否则, 必须将鼠标排除在进一步分析之外.
3。mri 检查程序和图像分析
- 在 mri 扫描过程之前, 根据步骤2.1 和2.3 中的协议麻醉鼠标, 并使呼吸频率保持在100周/分钟左右. 插入外部固定器在右后肢小心地将鼠标放入 custom-made 安装设备 ( 图 1 B、C )。
- 确保在这一步中避免对固定架进行弯曲或压缩, 因为这可能会影响骨折愈合.
注: MRI 扫描可在手术后3天进行, 这取决于动物护理和实验协议.
- 确保在这一步中避免对固定架进行弯曲或压缩, 因为这可能会影响骨折愈合.
- 将鼠标放置在温度控制的底座上, 以便引入 MRI 设备。将安装装置刚性地连接到四元件的磁头线圈上.
- 使用专用的型小动物磁共振成像系统采集 mri 数据, 操作 11.7 T.
#8203; 注意: MRI 数据的采集几何与股骨骨正交, 并与螺钉相吻合。- 使用捕获参数通过应用质子密度脂肪抑制的多层谢志伟序列 (PD) 获取数据: 回声/重复时间 TE = 5.8 毫秒/TR = 2500 毫秒, 分辨率和 #916; r = 52 和 #215; 52 和 #215; 350 和 #181; m 和 #179;, 视 (视) =20和 #215; 20 mm 和 #178;, 带宽和 #916; #969; = 150 赫.
- 注意:22 切片的总获取时间为 36 min.
- 使用图像分析软件打开获取的数据。输入体素大小为 0.05 x 0.05 x 0.35 mm 3 。在骨折愈伤组织 (骨, 软骨, 纤维组织/骨髓) 的不同组织的基础上, 其强度与半自动阈值如下。
- 单击 "#34"; 编辑新标签字段和 #34; 单击和 #34; 添加材料和 #34; 并将材料重命名为和 #34; 愈伤组织和 #34;。利用 #34; 套索和 #34; 工具, 从骨膜的低强度信号中区分愈伤组织区和周围组织.
- 单击和 #34; 添加到材料和 #34;。单击并 #34; 添加材料和 #34; 并将材料重命名为和 #34; 软骨和 #34。使用 #34; 阈值和 #34; 工具和 #34; 选择当前的材料和 #34; 从 #34; 愈伤组织和 #34;单击和 #34; 软骨和 #34; 和 #34; 添加到材料和 #34;。重复这些步骤与 #34; 骨骼和 #34; 和 #34; 骨髓/纤维组织和 #34;...
- 使用图像分析软件基于组织分割数据生成断裂股骨的3D 重建。单击和 #34; 生成表面和 #34; 应用和 #34; 无 #34; #34; 平滑类型和 #34; 单击和 #34; 表面视图和 #34;.
注: 非常小, 超强的地区周围的 en由于从骨组织到软组织的转变, 骨折皮层的 ds 可能是伪影。这些领域应排除在进一步分析之外。在骨折愈合的软骨期, 骨折愈伤组织中部的超强区域代表软骨组织。在骨折愈伤组织远端的低强度区, 在软骨骨化期的截骨间隙, 以及在整个骨折愈伤组织中, 在后期愈合阶段相同的部位, 表现为新近形成的骨痂组织。虽然这些区域有一个低强度的信号, 从成熟的骨骼 (皮质) 的信号密集度甚至较低。对骨折愈伤组织骨组织和软骨组织的信号强度进行阈值化后, 将其余组织标记为骨髓和纤维组织。组织细分的价值是: 骨组织 (包括成熟皮质, 小梁骨, 骨痂组织) 是分段范围内的 1-3. 3 (正常化信号强度到成熟皮质), 骨髓/纤维组织在 3.4-5.4 范围内, 并软骨痂组织在 5.5-6.2 的范围内. - 如果需要, 在骨折愈合过程中纵向重复 MRI 扫描。为了监测软骨痂的发育, 在手术后10、14、21天扫描小鼠.
注意: 时间点可能取决于动物保育和实验协议.
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Representative Results
首先, 通过对 MRI 扫描的分析可以确认手术的成功 (参见图 2中的示例)。所有四针应位于股骨干中间。截骨间隙的大小应介于 0.3-0.5 毫米之间。如果截骨间隙的大小与这些值相差很大, 则应将鼠标排除在进一步分析之外。
其次, 对同一动物骨折愈合过程中纵向扫描的评价提供了有关愈伤组织发育的信息。如果在10、14和21天扫描鼠标 (参见图 3中的示例), 软骨组织在每天 10 (相对软骨面积 = 30.8%) 和天 14 (相对软骨面积 = 29.0%) 的骨折愈伤组织的中部可见, 并减少到21天后手术 (相对软骨面积 = 10.5%)(图 3)。骨组织是可看见的在断裂愈伤组织的边缘在天 10 (相对骨头区域 = 7.2%), 增加直到天 14 (相对骨头区域 = 15.6%) 和身体桥梁发生直到天 21 (相对骨头区域 = 45.7%)。
第三, 利用图像分析软件对骨折愈伤组织的不同组织进行分割后, 可产生股骨骨折和骨痂的3D 图像。在图 4中所示的示例中, 显示了在断开后26天扫描的整个股骨。成熟皮质标记为灰色, 陶瓷针标记为黄色, 愈伤组织软组织标记为绿色, 软骨组织呈红色标记, 骨痂组织呈紫色。
图 1: 带有陶瓷安装销和 MRI 安装装置的外固定器.(A) 显示外部固定架的塑料体, 以及与 MRI 扫描相兼容的四陶瓷安装销。缩放栏: 1 厘米 (B) 在 MRI 扫描中, custom-made 安装装置用于插入外固定架的计算机辅助绘图显示。将鼠标右股骨的外固定器插入安装装置的浮雕中。然后, 在扫描前将该设备插入四元磁头线圈上。缩放栏: 0.4 厘米 (C) 鼠标放置在安装设备 (蓝色), 连接到4元头线圈 (白色)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 手术后3天股骨骨折的 MRI 影像.手术后3天扫描的大腿骨折的中央切片显示。骨髓;B: 骨头;FX: 骨折间隙。缩放栏: 0.5 mm请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 利用 MRI 技术对骨折愈伤组织发育进行纵向监测.中央 MRI 切片从骨折一只鼠标扫描 (A) 天 10, (B) 天 14, 和 (C) 天21后手术显示。超强的软骨组织在10天和14日的骨折愈伤组织中部可见, 术后21天减少。10天, 在骨折愈伤组织的周围可见低强度的骨组织, 增加至14天, 身体架桥发生到21天。骨髓;软骨组织;骨组织。缩放栏: 0.5 mm请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 手术后26天扫描的股骨骨折的3D 重建.成熟皮质标记为灰色, 陶瓷针标记为黄色, 愈伤组织软组织标记为绿色, 软骨组织呈红色标记, 骨痂组织呈紫色。图像是使用图像分析软件生成的。缩放栏: 0.4 mm请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
修改和故障排除:
本研究的主要目的是描述一个协议的使用 MRI 兼容外固定器股骨截骨在小鼠的能力, 以监测骨痂组织发展纵向软骨骨折愈合过程。custom-made 安装装置的设计, 用于插入外固定架, 确保了在重复扫描过程中的标准化位置。半自动组织分割允许分析的数量的纤维, 软骨, 骨组织的骨折骨痂。此外, 3D 重建的 MRI 图像允许可视化的软骨骨折愈合过程中每个单独的鼠标。
协议中的关键步骤:
手术过程中最关键的步骤是使用 MRI 兼容的外固定支架: (1) 在手术中避免坐骨神经损伤, 否则, 在截骨术后5天内, 小鼠就不能负重, 必须排除进一步分析。(2) 在安装过程中, 避免固定架上的张力、压迫或剪切应力, 否则截骨间隙不会有一个标准化的尺寸和形状。此外, 一定要安装与股骨纵轴平行的固定架, 确保截骨的稳定固定。(3) 避免金属芯片从锯, 如果使用吉利线锯, 因为那些将干扰核磁共振扫描程序。
MRI 扫描过程中最关键的步骤是: (1) 在安装装置的插入和拆卸过程中, 一定要避免固定架的弯曲或压迫, 因为这可能会影响骨折愈合。(2) 在扫描过程中确保适当的温度控制, 以保持生理体温。
在现有方法和技术限制方面的重要性:
以前的研究显示有希望的结果宰后磁共振成像在小鼠关节骨折14和体内mri 在小鼠膜骨缺损愈合15。然而, 这两项研究也表明空间分辨率和组织对比度有限。我们以前展示了高分辨率的在体内mri 对小鼠骨折愈合早期和中期的软愈伤组织形成进行纵向分析的可行性和准确性, 并将新的 mri 技术与金标准µCT 和计量16。然而, 我们也发现, MRI 的空间分辨率明显低于前体µCT 的分辨率。这是一个明确的局限性, MRI 技术时相比, 竞争技术, 包括ex 体内, 但也在体内µCT。
未来应用:
磁共振成像在小鼠骨折愈合研究中的应用前景是: (1) mri 与造影剂结合使用, 测量血流通过损伤肢体。(2) MRI 与 PET 扫描相结合, 以及用顺颗粒标记细胞进行细胞贩运实验17,18,19,20。
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Disclosures
作者罗马 Matthys 是 RISystem AG 达沃斯的雇员, 瑞士, 生产植入物和植入在本文中使用的特定仪器。所有其他作者都没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
我们感谢 Sevil Essig, 孙燕姿 Schroth, Verena 费舍尔, 卡嘉 Prystaz, 伊冯 Hägele 和安妮 Subgang 的优秀技术支持。我们还感谢德国研究基金会 (CRC1149, INST40/499-1) 和 AO 创伤基金会德国资助这项研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anaesthesia tube | FMI, Seeheim, Germany | ZUA-82-ANA-TUB-Mouse | |
| Anaesthetic machine | FMI, Seeheim, Germany | ZUA-82-GME-MA | |
| Artery forceps | Aesculap, Tuttlingen, Germany | BH104R | |
| Autoclave | Systec, Wettenberg, Germany | DX-150 | |
| Autoclaving packaging | Stericlin, Feuchtwangen, Germany | 2301-04/06/10/12/16 | |
| Avizo software | FEI, Burlington, USA | - | Version 8.0.1 |
| BioSpec 117/16 magnetic resonance imaging system | Bruker Biospin, Ettlingen, Germany | 117/16 | |
| Bulldog clamp | Aesculap, Tuttlingen, Germany | BH 021R | |
| Carbon steel scalpel no. 11/15 | Aesculap, Tuttlingen, Germany | BA211/215 | |
| Ceramic mounting pin 0.45 mm | RISystem, Davos, Switzerland | HS691490 | |
| Clindamycin (300 mg / 2ml) | Ratiopharm, Ulm, Germany | - | |
| Dressing forceps 115 mm | Aesculap, Tuttlingen, Germany | BD210R | |
| Dressing forceps 130 mm | Aesculap, Tuttlingen, Germany | BD025R | |
| Drill bit coated 0.45 mm | RISystem, Davos, Switzerland | HS820420 | |
| Durogrip needle holder 125 mm | Aesculap, Tuttlingen, Germany | BM024R | |
| Foliodrape | Hartmann, Heidenheim, Germany | 2513026 | |
| Frekaderm | Fresenius, Bad Homburg, Germany | 4928211 | |
| Gigli saw 0.44 mm | RISystem, Davos, Switzerland | RIS.590.110.25 | |
| Hand drill | RISystem, Davos, Switzerland | RIS.390.130-01 | |
| Heating plate | FMI, Seeheim, Germany | IOW-3704 | |
| Hygonorm gloves | Hygi, Telgte, Germany | 2706 | |
| Isoflurane | Abbot, London, UK | Forene | |
| Micro forceps 155 mm | Aesculap, Tuttlingen, Germany | BD343R | |
| Micro scissors 120 mm | Aesculap, Tuttlingen, Germany | FD013R | |
| Mouse FixEx L 0.7 mm | RISystem, Davos, Switzerland | RIS.611.300-10 | |
| Needle case for drills | Aesculap, Tuttlingen, Germany | BL911R | |
| Needle holder | Aesculap, Tuttlingen, Germany | BB078R | |
| Octenisept | Schülke, Norderstedt, Germany | 121403 | |
| Osirix software | Pixmeo SARL, Bernex, Switzerland | - | Version 4.0 |
| Oxygen, medical grade | MTI, Ulm, Germany | - | |
| Resolon 5/0 | Resorba, Nürnberg, Germany | 88143 | |
| Saline 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 3570350 | |
| Scalpel handle 125 mm | Aesculap, Tuttlingen, Germany | BB073R | |
| Scissors 150 mm | Aesculap, Tuttlingen, Germany | BC006R | |
| Sealer for autoclave packaging | Hawo GmbH, Obrigheim, Germany | HM500 | |
| Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| Sterile surgical blades no. 11/15 | Aesculap, Tuttlingen, Germany | BB511/515 | |
| Surgical gloves | Hartmann, Heidenheim, Germany | Peha-micron 9425712 | |
| Surgical light | Maquet SA, Ardon, France | Blue line 80 | |
| Syringes 5 ml | Braun, Melsungen, Germany | Injekt 4606051V | |
| Tissue forceps 80 mm | Aesculap, Tuttlingen, Germany | OC091R | |
| Tramadol 25 mg/l | Grünenthal, Aachen, Germany | 100mg/ml | |
| Vasofix Safety | Braun, Melsungen, Germany | 4268113S-01 | |
| Vicryl 5-0 | Ethicon, Norderstedt, Germany | V30371 | |
| Visdisic eye ointment | Bausch & Lomb, Berlin, Germany | 3099559 |
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