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L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto e consegna delle cellule in un modello preclinico grande

Published: January 21, 2018 doi: 10.3791/56699
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3,4, 4, 1, 5
1Institute for Cardiovascular and Metabolic Research, School of Biological Sciences, University of Reading, 2Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 3Institute of Virology and Immunology (IVI), 4Departamento de Anatomía y Anatomía Comparada, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 5Unidad de Trasplante Hematopoyético y Terapia Celular, Departamento de Hematología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, IMIB, Universidad de Murcia
* These authors contributed equally

Summary

Nuove strategie terapeutiche nella medicina rigenerativa cardiaca richiedono studi estesi e dettagliati nei modelli animali preclinici grande prima che essi possono essere considerati per uso in esseri umani. Qui, dimostriamo una tecnica di iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto in conigli, che è importante per l'efficacia di tali terapie innovarici di verifica delle ipotesi.

Abstract

Terapia cellulare e genica sono interessanti e promettenti strategie ai fini della rigenerazione cardiaca nella cornice di insufficienza cardiaca con ridotta frazione di eiezione (HFrEF). Prima che possano essere considerati per l'uso e implementati in esseri umani, i vasti studi preclinici sono tenuti nei grandi modelli animali per valutare la sicurezza, l'efficacia e destino di injectate (ad es., cellule staminali) una volta consegnato nel miocardio. Piccoli roditore modelli offrono vantaggi (per esempio, costo-efficacia, disponibilità per manipolazione genetica); Tuttavia, dato le limitazioni intrinseche di questi modelli, i risultati in queste raramente si traducono in clinica. Al contrario, grandi modelli animali come conigli e presentano vantaggi (per esempio, elettrofisiologia cardiaca simile rispetto agli esseri umani ed altri animali di grandi dimensioni), pur mantenendo un buon equilibrio economico. Qui, dimostriamo come eseguire una tecnica di iniezione (IMI) intramiocardico ecocardiografia-guida percutanea contrasto, che è minimamente invasivo, sicuro, ben tollerato e molto efficace per la somministrazione mirata di injectates, compreso le cellule, in diverse posizioni all'interno del miocardio di un modello di coniglio. Per l'implementazione di questa tecnica, abbiamo anche approfittato di un sistema di ecocardiografia clinica ampiamente disponibili. Dopo aver messo in pratica il protocollo descritto qui, un ricercatore con conoscenza di base di ultrasuono diventerà competente nello svolgimento di questa tecnica mini-invasiva e versatile per uso sistematico negli esperimenti, volto alla sperimentazione di ipotesi del capacità di rigenerativa cardiaca terapeutica nel modello di coniglio. Una volta ottenuta la competenza, l'intera procedura può essere eseguita all'interno di 25 min dopo anestetizzante il coniglio.

Introduction

Terapie geniche e cellulari sono emozionanti e mai lo sviluppo di strategie per la rigenerazione o la riparazione del miocardio danneggiato in HFrEF. Alcuni studi hanno confrontato l'efficacia (ad es., tasso di ritenzione delle cellule) delle diverse vie di consegna delle cellule, che hanno sempre dimostrato la superiorità dell'IMI sulle rotte per via endovenosa o intracoronary1,2 , 3 , 4 , 5. così, non sorprende che gran parte degli studi su modelli traslazionale della terapia cellulare del miocardio danneggiato, consegnare il injectate via IMI eseguita sotto visione diretta in un torace aperto procedura6,7 . Tuttavia, questo approccio presenta diverse limitazioni, tra cui la natura invasiva della procedura, che comporta il rischio di mortalità peri-procedurale (spesso sotto-segnalata)8. Inoltre, un IMI sotto visione diretta non elimina la possibilità per l'involontaria iniezione nella cavità ventricolare. Nella pratica clinica un IMI durante l'ambulatorio aperto della cassa potrebbe essere un metodo appropriato per la consegna di terapeutica delle cellule, per esempio, nel corso dell'arteria coronaria di bypass coronarico (CABG); Tuttavia, questo approccio potrebbe non essere appropriato per la consegna delle cellule in cardiomiopatia globale di origine non-ischemica (ad es., HFrEF secondario a cardiomiopatia indotta da antraciclina (AICM)).

Non c'è dubbio che la malattia cardiaca ischemica (IHD) è la causa più comune di HFrEF (~ 66%)9,10; tuttavia, cardiomiopatia non ischemica, tra cui AICM, colpisce ancora una percentuale significativa di pazienti con HFrEF (33%)9 . Infatti, recenti progressi in oncologia clinica hanno provocato più di 10 milioni i superstiti di cancro negli Stati Uniti da solo11, con stime di un numero simile in Europa, coerenza con una generale tendenza verso una migliore sopravvivenza dei malati di cancro12 ,13. Così, esplorare i benefici delle terapie innovarici come trapianto di cellule staminali per cardiomiopatia non ischemica, come pure la trialing di un percorso efficace e minimamente invasivo di cellule staminali consegna è della massima importanza, dato il crescente numero di pazienti influenzato dalla cardiotossicità secondaria a farmaci antitumorali.

Da notare, gli studi che utilizzano la terapia della cellula formativa con l'obiettivo di riparazione/rigenerare il miocardio danneggiato frequentemente di verifica delle ipotesi prevede l'utilizzo di piccoli roditori (ad es., topi e ratti). Questi modelli richiedono spesso costosi ad alta frequenza ultrasuoni per la valutazione della funzione del miocardio, solitamente dotata di trasduttori di allineamento lineare che hanno alcune limitazioni intrinseche associato (ad es., riverbero)14. Tuttavia, altri modelli come i conigli, che rappresenta un grande modello preclinico, avere alcuni vantaggi per test di ipotesi di terapie con cellule staminali in HFrEF. Così, contrariamente ai ratti e topi, conigli mantengono un sistema di trasporto di Ca+ 2 e di elettrofisiologia cellulare simile a quella degli esseri umani e altri animali di grandi dimensioni (ad esempio, cani e maiali)15,16,17 ,18,19. Un altro vantaggio, è la loro disponibilità per ecografia cardiaca imaging utilizzando relativamente poco costoso e l'ecocardiografia clinica ampiamente disponibili sistemi dotati di relativamente alta frequenza fase matrice trasduttori, per esempio, 12 MHz, come quelli frequentemente utilizzati in cardiologia pediatrica e neonatale. Questi sistemi consentono un'eccellente immagine ecocardiografica con tecnologia d'avanguardia, e sfruttano la superiorità di harmonic imaging20. Inoltre, test di ipotesi ricca di potenziale delle terapie rigenerative cardiache (ad es., terapia con cellule staminali), loro sicurezza, efficacia, cardiomiogenici potenziale, nonché valutazione del destino della per iniettato una volta immessa la miocardio, è obbligatorio prima di essi possono essere considerati per uso umano, e richiedono l'uso di grandi modelli animali preclinici, come ad esempio il coniglio17,19. Qui, descriviamo una tecnica mini-invasiva per la consegna delle cellule tramite ecocardiografia di contrasto percutanea guidata IMI utilizzando un sistema di ecocardiografia clinica, che si rivolge a terapia a base di trapianto della cellula formativa per cardiomiopatia non ischemica20 . Inoltre descriviamo i vantaggi dell'inchiostro di India (InI, noto anche come inchiostro di China) come un ultrasuono contrasto agente ed in situ dell'elemento tracciante di injectate nel cuore di coniglio.

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Protocol

Gli esperimenti descritti nel presente documento sono stati approvati dal comitato etico di ricerca dell'Università di Murcia, Spagna e sono stati eseguiti in conformità con la direttiva 2010/63/UE della Commissione europea. Le operazioni descritte sono state eseguite sotto protocolli operativi standard che facevano parte del piano di lavoro e non sono stati effettuati esclusivamente allo scopo di filmare il video allegato al presente documento.

1. preparazione delle cellule e vettore di espressione dei mammiferi

Nota: Qui, descriviamo brevemente un protocollo per la preparazione e la transfezione di una linea cellulare (embrionali umane del rene 293 (HEK-293)); Tuttavia, specifici protocolli di cella appropriata per il tipo di cella di interesse dovrebbero essere ottimizzato (per esempio, cellule staminali).

  1. Mantenere le cellule HEK-293 in alto glucosio Dulbecco s modified esente Eagle (DMEM) completati con 10% siero fetale del vitello (FCS), piruvato di sodio 1%, 2 mM glutammina, 1% di penicillina/streptomicina e incubate a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% CO2 . Una volta che le cellule sono sub-confluenti, dividere con un rapporto di 1:3.
  2. Iniziare a spaccare le cellule aspirando i media, poi lavata una volta con fosfato sterile tampone salino (PBS), rimuovere l'eccesso di PBS e poi incubare con 2,5 mL di 0.5 x acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) (5 min, 37 ° C).
    1. Aggiungere un volume di media DMEM (completato come descritto sopra) per arrestare la reazione e poi staccare le cellule aspirando lentamente e delicatamente su e giù con una pipetta elettronica.
  3. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in un apposito contenitore (ad esempio, provetta conica per centrifuga 15-50 mL). Centrifugare in un secchio di oscillazione (100 x g), scartare il surnatante e lavare la pallina due volte con PBS sterile.
  4. Risospendere il pellet in fresco DMEM media e seme ad una densità di cella appropriata (ad es., 1 x 106 cellule in una boccetta di2 cm 75) in matracci di cultura fresco o grandi piatti secondo le pratiche di laboratorio locale.
    1. Sostituire il supporto esistente con i media freschi ogni 2 giorni.
      Nota: Il vettore di espressione è stato derivato da pIRES1hyg e utilizzato secondo le istruzioni del produttore come descritto in precedenza21. p(EGFP) IRES1hyg è stato generato da subcloning EGFP cDNA come un BamHI + NotI inserire da pEGFP-N1 il BamHI + NotI digeriti pIRES1hyg21.
  5. 1 giorno prima della trasfezione, seme HEK-293 cellule ad una densità di 0.5 x 105 cellule/cm2 a 12 o a 24 pozzetti piastre di coltura del tessuto.
  6. Il giorno della transfezione, preparare complessi di reagente di transfezione DNA-lipidico in microcentrifuga separata 1,5 mL (1 tubo/pozzetto).
    1. Iniziamo con l'aggiungere 250 µ l di siero riduttore terreno in ogni provetta e quindi aggiungere 4 µ g del DNA (mescolare delicatamente).
    2. Successivamente, aggiungere 250 µ l da un mix precedentemente preparato di reagente di transfezione di 10 µ l del lipido e 250 µ l di siero riduttore terreno, ad ogni provetta (mescolare dolcemente).
    3. Infine, procedere con transfezioni, incubando le cellule HEK-293 con complessi di reagente di transfezione del lipido DNA per 4 h e quindi sostituire con medium DMEM completate come descritto in precedenza (punto 1.1) e incubare per un altro 48 h. Esegui selezione della droga della scuderia Transfectants con 100 µ g/mL igromicina B.
  7. Staccare le cellule HEK-293 con tripsina, come descritto in precedenza (punto 1.2). Dopo aver lavato le cellule in PBS sterile, risospendere in un veicolo adatto (per esempio, 10% v/v InI in PBS), per ottenere una concentrazione di cella finale di 5 x 106/ml.

2. preparazione del coniglio

Nota: Il posizionamento del coniglio e il trasduttore per l'IMI non è ottimo per valutare morfologia e funzione del cuore dell'animale. Pertanto, si consiglia di eseguire un esame ecocardiografico completo20 prima l'IMI (Vedi sotto) e a intervalli di tempo successivi, come definito dal disegno sperimentale. Questo mirerà a valutare le caratteristiche al basale anatomico e funzionale del cuore nell'animale che riceverà un'iniezione e valutare anche gli effetti, dell'IMI nella funzione del cuore.

  1. Eseguire questo esame in cieco e seguendo le linee guida del Comitato ecocardiografia dell'American College of Veterinary Internal Medicine e la società di ecocardiografia/europea associazione americana per l'Imaging cardiovascolare 22 , 23 , 24.
  2. Ottenere un analisi simultanea 1-piombo elettrocardiogramma (ECG) in tutto lo studio intero ecocardiografico.
  3. Anestetizzare il coniglio con ketamina 10 mg/kg, combinato con medetomidina 200 µ g/kg, iniezione intramuscolare (I.M.).
  4. Verificare il livello di anestesia dopo 10-20 min dopo la somministrazione dell'anestesia.
  5. Utilizzando un tagliatore di capelli rimuovere i peli del torace ampiamente (ad es., sotto il collo alla regione sub-xifoide) (Figura 1A).
  6. Radersi ulteriori regioni dell'1-2 cm,2 nella faccia interna dell'arto anteriore destro (regione mediocubital) e di entrambi gli arti posteriori (regione mediotibial) (Figura 1B).
  7. Posizionamento degli elettrodi ECG adesivi rasate regioni degli arti in modo sincrono monitorare il ritmo cardiaco durante la procedura (Figura 1).
  8. Metti l'animale in decubito supino su una coperta termica, con le membra Tesate utilizzando nastro chirurgico associato alla tabella (Figura 1).
    1. Assicurarsi che le orecchie sono flesso all'indietro dietro la testa/parte posteriore del coniglio e in una posizione che è inferiore agli arti anteriori, poiché questo aiuta a mantenere il corretto posizionamento del torace dell'animale durante tutta la procedura.
  9. Permettere all'animale di respirare spontaneamente, mentre la somministrazione di ossigeno dalla maschera di protezione durante l'intera procedura (100%, 2-3 L/min).

Figure 1
Figura 1. Preparazione del coniglio per IMI. (A) Clip di capelli dal torace; (B) Clip capelli dalle membra; (C) collegare gli elettrodi e posizionare il coniglio con le gambe distese su una coperta termica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. percutanea contrasto IMI ecocardiografia-Guida tecnica nel coniglio

  1. Pulire e disinfettare la pelle del torace con una soluzione a base di clorexidina.
    1. Utilizzare una tecnica asettica durante tutta la procedura, secondo le migliori pratiche attuali.
    2. Quando possibile e se ragionevolmente possibile, eseguire una procedura completamente sterile, compresi, ma non limitato a, l'uso di materiale sterile, come abiti, guanti, ferite chirurgiche teli, materiale di medicazione sterile per la tabella, nonché un ultrasuono sterile copertura del trasduttore e gel per ultrasuoni sterile. Questo ridurrà al minimo il rischio di introdurre patogeni per l'animale riceve IMI ed è pratica standard in ambito clinico (ad es., durante la puntura cardiaca).
      Nota: Si consiglia di procedere sempre in linea con le norme locali e nazionali di ricerca animale applicabile all'ente locale e il paese di pratica.
  2. Applicare il gel per ultrasuoni trasmissione al torace e/o al trasduttore e con il cavo del trasduttore al collo dello sperimentatore, eseguire una scansione rapida finestra del cuore dell'animale, che è spesso utile visualizzare l'anatomia e per pianificare l'IMI.
  3. Posizionare il trasduttore manualmente presso lo spazio intercostaleth dith-6 4, 2-3 cm dalla linea parasternale destra con un angolo di incidenza di ~ 90 ° rispetto al lato destro della parete toracica (Figura 2A).
  4. Regolare la posizione del trasduttore rispetto lo spazio intercostale, nonché sua anteroposteriore e dorsoventral angolo per ottimizzare una vista modificate asse corto a livello dei muscoli papillari. Identificare in questa visualizzazione il ventricolo di destra (RV), ventricolo sinistro (LV), setto interventricolare (IVS), parete posteriore (PW), come pure anterolateral (AL) e muscoli papillare posteromedial (PM) (Figura 2B).
    1. Hanno un ampio campo di vista aumentando significativamente la profondità utilizzando il controllo appropriato sul sistema (ad esempio, pulsante, quadrante).
    2. Prestare particolare attenzione all'ottenimento di un'immagine simmetrica in questa vista, così come adeguata differenziazione dei contorni endocardial e dell'epicardio e, se necessario, regolare attraverso controlli di ottimizzazione di immagine (ad es., guadagno).
  5. Una volta che la visualizzazione ecocardiografica ottima si ottiene (Figura 2B), mantenere questa posizione per tutto il resto della procedura, mentre un secondo operatore esegue l'IMI (Vedi sotto).
    1. Tenendo il trasduttore, evitare di nascondere la tacca di orientamento del trasduttore, che dovrebbe sempre essere rivolto in avanti, permettendo così l'allineamento con l'ago nei passaggi successivi (Figura 2A, C).
  6. Con un ago 24 G attaccato ad una siringa da 1 mL, inserire l'ago vicino alla pelle del hemithorax di sinistra in posizione simmetrica del mirroring rispetto il trasduttore. Quindi, allineare manualmente l'ago con la tacca di orientamento del trasduttore con un angolo di ~ 90° (Figura 2) e far avanzare lentamente l'ago attraverso la pelle e nella cavità toracica.
    Nota: L'inserimento dell'ago percutaneo in questa posizione e l'orientamento facilita la visualizzazione dell'ago nel piano del fascio di ultrasuoni (Figura 2D, E), permettendo così il monitoraggio in tempo reale e, quando necessario, regolazione della la posizione dell'ago riguardante la regione di destinazione del miocardio (Figura 2, G, H).
  7. Con la punta nella posizione di destinazione, lentamente consegnare il injectate (fino a 0,25 mL per sito di inoculo) entro 10-30 s (Figura 2E), mentre lentamente e delicatamente ritrarre l'ago durante l'iniezione per aumentare la portata del miocardio trattati.
    1. Utilizzare InI 10% (v/v) diluito in PBS per la standardizzazione della tecnica e come un elemento tracciante in situ mentre l'acquisizione di competenza, anche quanto a confermare il successo di targeting di tutti i quattro siti IMI all'interno del miocardio da patologia lorda e istopatologia (Vedi Rappresentante risultati). Una volta ottenuta la competenza, InI potrebbe essere sostituito da un agente di contrasto di ultrasuono commerciale adatto se lo si desidera.
      Nota: Consegna del 10% (v/v) InI diluito in PBS con o senza cellule nel produce miocardio transmurale hyperechogenicity (cioè, aspetto brillante Eco) presso il sito di destinazione di iniezione (Figura 2E, F). Transitorio rallentamento o accelerazione della frequenza cardiaca, associata a contrazioni ventricolari premature (ad es., isolato, distici e terzine) sono frequentemente osservate anche dal primo contatto dell'ago con l'epicardio, nonché durante e/o poco dopo IMI. Tuttavia, nessuna aritmia pericolose sono sviluppate ed effetti avversi acuti sono osservati raramente utilizzando fino a 0,25 mL (1,25 x 106 cellule) di injectate per sito di inoculo di IMI (Vedi Rappresentante risultati e discussione).
  8. Eseguire cambiamenti sottili nell'angolo di incidenza dell'ago come necessario per completare le iniezioni di 0,25 mL di ciascuno dei quattro destinazione IMI siti (tre nella parte ventricolare di sinistra libera parete (LVFW) e una in IVS).
  9. Dopo aver completato la procedura IMI ecocardiografia-guida percutanea contrasto, valutare il ritmo cardiaco (ad es., tramite seriale ECG traccia e/o 24 h Holter ECG) ed eseguire scansioni ecocardiografiche finestra seriale per verificare l'assenza di complicazioni, fino a quando l'animale è completamente recuperato da anestesia e solo poi il trasferimento in una camera del ciclo di luce.
    1. Qui, usiamo 24 h Holter ECG per monitorare gli effetti dell'IMI con InI sul ritmo cardiaco per 24 h. Per questo, abbiamo confrontato un gruppo di 6 conigli con fenotipo normale (gruppo normale) e un gruppo di 6 conigli che hanno ricevuto la somministrazione endovenosa di doxorubicina (una cardiotossico delle antracicline droga, comunemente usata per il trattamento del cancro; Gruppo DOX) ad una dose di 2 mg/kg/settimana per 8 settimane e quindi entrambi coorti ricevuto IMI con InI.

Figure 2
Figura 2 . L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto nel coniglio. (A) posizionamento del trasduttore nel giusto hemithorax ad un angolo di ~ 90 °. (B) immagine rappresentativa di una vista di asse corto parasternale (PSSX) del cuore a livello dei muscoli papillari nel coniglio. (C) allineamento dell'ago con un angolo di ~ 90 ° rispetto la tacca di orientamento del trasduttore. (D) posizione dell'ago nel sito di destinazione in una vista PSSX del cuore (Nota che l'ago è facilmente visualizzato nel piano del fascio di ultrasuoni). (E e F) dimostrazione di hyperechogenicity presso il sito di destinazione su iniezione intramiocardica con inchiostro di India (punte di freccia evidenzia il hyperechogenicity transmurale). (G) posizione accidentale dell'ago nella camera di LV (punte di freccia evidenziare l'albero dell'ago). (H) riposizionamento dell'ago per la parete libera di LV (punte di freccia evidenziare l'albero dell'ago). RV = ventricolo destro; LV = ventricolo sinistro; IVS = setto interventricolare; PW = parete posteriore; AL = muscolo papillare anterolateral; PM = muscolo papillare posteromedial. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. post IMI analisi

  1. Eseguire l'analisi istopatologica dei campioni di tessuto del cuore dai conigli.
    1. Difficoltà tessuto per 24 h in formaldeide al 10%, seguita da disidratazione con aumento delle concentrazioni di etanolo come segue:
      • 1 x a 70% (60 min)
      • 1 x 95% ethanol/5% metanolo (60 min)
      • 1 x a 100% (60 min)
      • 1 x a 100% (90 min)
      • 1 x a 100% (120 min)
      Nota: Tutte le incubazioni di cui sopra sono condotte a temperatura ambiente (TA). Quindi, sostituire due volte con 100% xilene (1h, RT) e infine incorporare in paraffina in due passaggi (60 min, 58 ° C)25.
    2. Eseguire 4-5 µm sezioni di tessuto con un microtomo25. Montare profili sulle diapositive.
    3. Eseguire la colorazione con ematossilina-eosina e Masson tricromica metodi25,26,27.
  2. In sezioni di tessuto trapiantati cuori, eseguire esame immuno-istochimico per rilevare le cellule HEK-293 EGFP(+) (ad es., utilizzando il metodo (ABC) complesso avidina-biotina), brevemente:
    1. De-cera sezioni di 4-5 µm spessore cuore 100% xilene (10 min, a RT). Reidratare il tessuto mediante lavaggio con la diminuzione della soluzioni di concentrazione di etanolo (2x in 100% (2 min); 2x in 95% (2 min); 1x in 70% (2min); 1 x in 50% (2 min); 1x in 30% (2 min); 1 x ddH2O (2 min)) a TA.
    2. Eseguire l'inibizione della perossidasi endogena coprendo le sezioni con 100 µ l del 3% H2O2 diluito in metanolo (preparato con 5 mL di soluzione di riserva del 30% di H2O2e l'aggiunta di metanolo fino ad un volume totale di 50 mL) ( Incubare 30 min, RT) e poi lavare per immersione con Tris buffered saline (TBS; pH 7,6).
    3. Eseguire antigene smascheramento tramite trattamento enzimatico, coprendo le sezioni con 100 µ l di 0,1% Pronase (preparato con 0,01 g Pronase diluito in 10 mL di TBS) (Incubare 12 min, RT), poi lavare con TBS (5 min, RT).
    4. Incubare in soluzione (siero di capra normale al 10% in TBS) di blocco utilizzando 100 µ l per far scorrere (30 min, RT) e lavare con TBS (5 min, RT).
    5. Incubare con proteine fluorescenti pollo anti-verde (GFP) come anticorpo primario (1: 500 in TBS) (1h e 30 ° C) e lavare con TBS (5 min, RT).
    6. Incubare con anticorpo secondario biotinilato capra-anti-pollo IgG (1: 250 in TBS) (1h e 30 ° C) e poi lavare con TBS (5 min, RT).
    7. Incubare con complesso avidina-biotina (20 min, 30 ° C) e quindi l'etichetta utilizzando tetrahydrochloride 3,30-diaminobenzidina (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Infine, disidratare mediante lavaggio con aumento delle concentrazioni di etanolo (1x nel 30% (2 min); 1 x in 50% (2 min); 1x in 70% (2min); 2x in 95% (2 min); 2x in 100% (2 min)) a RT, controcolorazione sezioni utilizzando il metodo di ematossilina-eosina25e poi montare coperchio diapositive. Sono positivi, negativi, così come controlli di isotipo.
      Nota: Il protocollo breve descritto sopra non è inteso per l'uso di immunohistochemistry generali; ottimizzazione per il tessuto di interesse e condizioni è necessario.

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Representative Results

IMI di ecocardiografia-guida percutanea contrasto con InI:

Utilizzando il protocollo descritto sopra, e una volta che il posizionamento ottimale della punta dell'ago è stato confermato dall'ecocardiografia e l'iniezione ha avviato, il hyperechogenicity transmurale è stato osservato durante la consegna di InI (10% v/v in PBS) (Figura 2E) , così come poco dopo l'IMI alla regione di destinazione (Figura 2F). Quando IMI è stata immediatamente seguita da eutanasia e rimosso il cuore, depositi di InI erano facilmente visibili all'esame esterno del cuore (Figura 3A). Inoltre, sezioni del tessuto cuore, ad esempio, sezione asse corto a livello dei muscoli papillari (Figura 3B), ha rivelato i depositi di transmurale di InI colorante al sito di iniezione, dimostrando in tal modo la consegna efficace e di successo di per iniettato nel miocardio utilizzando questa tecnica. Della nota, il hyperechogenicity transmurale osservata in vivo durante IMI (Figura 2E, F), hanno correlato bene con depositi transmurale di InI negli esemplari ex vivo (Figura 3A, B). Questo è chiaramente dimostrato che InI ha proprietà dual nella cornice dell'IMI: come un agente di contrasto di ultrasuono in vivo , come pure un ex situ vivoin tracciante. Entrambe queste proprietà fanno InI un agente di contrasto di ultrasuono molto versatile e poco costoso, specialmente per la formazione durante l'acquisizione di competenza in questa tecnica. Quindi, le proprietà echogenic di InI consentono a monitorare IMI ad es., determinare il successo IMI contro accidentale intra-alloggiamento o iniezione spazio pericardico e, quando necessario, data la capacità di formazione immagine in tempo reale degli ultrasuoni, di rendere correzioni dell'ago tenere traccia in tempo reale (Figura 2, H). D'altra parte, le funzionalità di analisi in situ di InI sono di valore da individuare per l'iniettato negli esemplari ex vivo del miocardio destinazione.

IMI di ecocardiografia-guida percutanea contrasto con cellule HEK-293 InI ed EGFP(+):

Prima dell'IMI, successo trasfezione di cellule HEK-293 EGFP(+) è stata confermata da microscopia di fluorescenza durante condizioni di coltura in vitro (Figura 3). Il successo della fornitura di cellule HEK-293 EGFP(+) nel miocardio è stata dimostrata tramite analisi immunoistochimica delle sezioni di tessuto di cuore dove InI depositi sono stati osservati. Così, utilizzando il metodo complesso avidina-biotina (Vedi punto 4.2), le cellule HEK-293 EGFP(+) abbondanti sono state identificate all'interno del miocardio intervallato da depositi InI (Figura 3D). Depositi di InI sono stati ancora osservati 24 h dopo IMI nei campioni di tessuto del miocardio da conigli che hanno ricevuto InI in combinazione con le cellule HEK-293 EGFP(+) (Figura 3E) o InI da solo (Figura 3F). Di nota, è stata osservata una risposta infiammatoria acuta a questo punto del tempo, con un predominante neutrophilic si infiltra in, nei campioni provenienti da animali che ricevono cellule HEK-293 EGFP(+) (Figura 3E), suggerendo così rifiuto cellulare acuto. D'altra parte, i macrofagi sono stati osservati in animali che ricevono InI (Figura 3F).

Figure 3
Figura 3 . In situ valutazione macroscopica ed istopatologica e tracciatura di injectate. (A) dimostrazione della presenza di injectate su esame esterno di un cuore asportata seguendo IMI con InI (punte di freccia, evidenziare i siti di iniezione). (B) dimostrazione della distribuzione transmurale di injectate seguito IMI con InI in una sezione trasversa del cuore a livello dei muscoli papillari (frecce blue evidenziare transmurale InI deposito; freccia bianca mette in evidenza un deposito visibile di InI a IVS). (C) Autofluorescence in vitro delle cellule HEK-293 EGFP(+) utilizzando la microscopia a fluorescenza. (D–F) Analisi istopatologica dei siti di iniezione. Le cellule EGFP(+) sono visibilmente intervallate da InI depositi all'interno del miocardio a 0 h (D) e 24 h (E) post IMI (punte di freccia blu evidenziare celle EGFP(+); frecce rosse evidenziano la presenza di neutrofili). Depositi di InI sparpagliati all'interno del miocardio a 24 h (F) seguendo IMI con InI da solo (frecce blu evidenziano la presenza di macrofagi). RV = ventricolo destro; LV = ventricolo sinistro; IVS = setto interventricolare; IMI = iniezione intramiocardica; InI = inchiostro di India. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dopo aver eseguito oltre 60 percutanea contrasto ecocardiografia-guida IMI procedure fino ad oggi, crediamo che con grande attenzione al dettaglio e la buona gestione degli animali e la cura, la procedura è generalmente ben tollerata, e complicazioni acute sono molto rare e generalmente di lieve entità. In generale, negli animali che subiscono l'IMI, l'osservazione più frequente durante e subito dopo la procedura è transitoria accelerazione o decelerazione della frequenza cardiaca, associato con complessi ventricolari prematuri isolati (PVC) (Figura 4A). Così, monitoraggio 24 ore ECG Holter di animali che hanno ricevuto InI da solo via IMI, ha rivelato che l'aritmia più frequente rilevato (numero totale di episodi entro 24 h) era isolato in PVC, anche se un numero maggiore di episodi sono stato rilevato in animali che sono stati precedentemente trattati con DOX per 8 settimane (Figura 5A). PVC in distici e terzine sembrano essere meno frequenti (Figura 4B, C e figura 5B, C), anche se triplette sono significativamente meno frequenti nei trattati con DOX rispetto a conigli normali non trattati (Figura 5). D'altra parte, la tachicardia ventricolare non-sustained (NSVT) è stata osservata più frequentemente in animali normali (Figura 4 e Figura 5). Significativamente, mentre la frequenza cardiaca media non era differente fra DOX e gruppi normali dopo la ricezione del IMI con InI (Figura 5E), la deviazione standard del normale intervallo di R-R (SDNN), è stata ridotta significativamente (< 100 ms) nel gruppo di DOX ( Figura 5F). Il SDNN è una misura non lineare di stato di salute del cuore, e quindi questo risultato indica che il gruppo DOX ha alterazioni globale nel suo stato cardiaco fisiologico.

Figure 4
Nella figura 4. Aritmia ventricolare osservata durante il monitoraggio Holter di 24 ore nei conigli che hanno ricevuto IMI con InI. Le immagini mostrate sono immagini ottenute dalla tachograms di Holter ECG visualizzati sullo schermo durante l'analisi non in linea e illustrano esempi rappresentativi dei più comuni tipi di aritmie trovate durante 24 ore di monitoraggio. (A) isolati in PVC. (B) in PVC in distici. (C) PVC in terzine. (D) NSVT. PVC = contrazioni ventricolari premature; NSVT = tachicardia ventricolare non-sustained. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . Eventi aritmici rilevati dal monitoraggio di 24 ore ECG Holter in seguito IMI con InI in conigli. Numero totale di isolato PVC (A), PVC in distici (B), PVC in terzine, (C) e NSVT (D), in conigli non trattati (normale + IMI) contro trattati con doxorubicina (3 mg/kg/settimana per 6 settimane) conigli (DOX + IMI), dopo IMI con InI. Dire la frequenza cardiaca (E) e SDNN (F), in conigli da normale e DOX + IMI IMI gruppi dopo IMI con InI. I dati sono espressi come media ± SEM. * indica p < 0,05; e # indica p < 0.01, confrontando normale + IMI versus DOX + IMI gruppi di t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'obiettivo primario era quello di sviluppare una tecnica mini-invasiva che poteva essere utilizzata per la fornitura di cellule staminali nel miocardio di conigli (un grande dimensione modello animale preclinico)17,18, traendo vantaggio dell'uso di un relativamente poco costoso imaging sistema prontamente disponibile in molte cliniche e centri di ricerca. Qui, ci mostrano che, utilizzando un sistema di ecocardiografia clinica, e aiutato da InI, un agente ampiamente disponibile, con funzionalità di analisi in situ ed echogenic proprietà, riuscito contrasto percutanea ecocardiografia-guida IMI è molto efficace nella fornitura per iniettato a regioni di destinazione del coniglio cuore. Per quanto sappiamo, questa è la prima descrizione di un contrasto percutanea ecocardiografia-guida IMI e cella consegna in un modello animale di grandi dimensioni come il coniglio18,19. Mentre InI è stato utilizzato in precedenza negli studi per la localizzazione in situ di per iniettato all'interno di tessuti7,28, questo è a nostra conoscenza, la prima descrizione delle proprietà dual di questo agente come di in vivo agente di contrasto di ultrasuono e come un tracciante in situ di injectate ex vivo. Infatti, miscele complesse di agenti di contrasto e in situ rintracciare le sostanze precedentemente sono stati descritti in studi murini volti a realizzare una injectates nel miocardio29. Tuttavia, dato la proprietà echogenic di InI e le sue capacità di analisi in situ , questa sostanza potrebbe essere molto utile durante l'acquisizione di competenza mentre in fase di formazione con questa tecnica.

Conferma della consegna di injectate contenente entrambi InI anche come cellule HEK-293 EGFP(+) usando immunohistochemistry dimostra l'applicabilità di questa tecnica di ricerca preclinica volta a terapia con cellule staminali. Un IMI di InI in combinazione con EGFP(+) HEK-293 ha provocato una risposta infiammatoria acuta con una predominante neutrophilic si infiltra in, suggerendo una risposta di rifiuto cellulare acuto (entro 24 h) per le cellule xenogeniche. Questa risposta probabilmente non è sorprendente in un animale immunocompetenti. D'altra parte, un IMI con InI da solo anche ha suscitato una risposta infiammatoria acuta (entro 24h) nel tessuto del miocardio trattato, che hanno esibito un macrofago predominante si infiltra in. Questo è in linea con l'osservazione di infiammazione acuta descritto in precedenti studi seguendo IMI sotto visione diretta in un torace aperto procedura4,30,31,32,33. Infiammazione acuta è stato osservato anche dopo l'iniezione di soluzione salina o soluzioni di PBS nel miocardio34,35e persino nei muscoli gastrocnemio di ratto36, e pertanto questa risposta è stata attribuito alla lesione del tessuto diretto piuttosto che per il injectate di per sé. 30 , 31 , 32 , 34 , 35 , 36 infatti, la società internazionale per ricerca traslazionale cardiovascolare riconosce l'avvenimento comune di infiammazione nella cornice dell'IMI, ma non esiste un consenso sul fatto che o non misura per ridurre questo processo durante la tempo di peri-procedurale sono utili (per esempio, corticosteroidi per via endovenosa (I.V.))37. Anche se l'infiammazione in questo studio ha potuto essere attribuita anche alla diretta lesione del tessuto, i risultati indicano anche che InI come un corpo estraneo deve anche svolgere un ruolo in questo processo, ha fornito un numero di macrofagi sembrano essere phagocytizing InI (Figura 3F). Un'analisi approfondita degli effetti funzionali di questa infiammazione acuta secondaria a IMI all'interno del cuore, o se questi possono essere migliorati tramite somministrazione di farmaci profilattici quali i corticosteroidi è oltre la portata di questo manoscritto. Tuttavia, percutanea contrasto ecocardiografia-guidata IMI alle quattro regioni di destinazione del miocardio, con un volume di injectate fino a 0,25 ml (1,25 x 106 cellule) per ogni sito IMI, è stato molto ben tollerato nel coniglio.

Con oltre 60 procedure effettuate fino ad oggi, e dopo è stata realizzata la competenza, la mortalità secondaria alla procedura era molto bassa. Ad esempio, non morti si sono presentate in due coorti descritte al punto 3.9 (gruppi normali e DOX) dopo IMI. Infatti, ad oggi dopo 67 IMI procedure eseguite come parte di un programma di ricerca in corso, abbiamo avuto solo due decessi direttamente correlati alla procedura (2,9% di mortalità). In uno di questi, la presenza di un hemopericardium è stata dimostrata nell'esame post-mortem , mentre l'altro ha sviluppato segni neurologici clinici, coerenti con ischemia cerebrale acuta secondaria ad un evento cardioembolico, richiedendo così un Humane end-point. Questo tasso di mortalità (2,9%) è notevolmente inferiore a quello riportato da Lu et al. (11%)8 e Mu et al (27%)38, in conigli che ricevuto IMI sotto visione diretta in una procedura aperta sul petto. Quindi, consideriamo la procedura descritta nello studio corrente per essere sicuro, e che stiamo usando questa tecnica negli studi in corso per valutare la terapia a base di cellule staminali in un modello del coniglio di AICM con promettenti risultati39,40.

Ci sono parecchi punti critici per il successo percutanei contrasto ecocardiografia-guida IMI. Innanzitutto, assicurarsi che una vista di parasternale asse corto a livello dei muscoli papillari si ottiene con chiara delineazione dei contorni endocardial e dell'epicardio. Successivamente, verificare che la punta dell'ago è all'interno del campo visivo in ogni momento una volta che questo è entrato la cavità toracica e del miocardio per impedire il recapito accidentale nella spazio pericardico o camera di LV. Quindi, assicurarsi di mantenere al minimo il numero di passaggi attraverso la cavità toracica e nel pericardio ed il miocardio, poiché questo potrebbe aumentare la probabilità di trauma locale (ad es., lacerazione) a queste strutture e il conseguente rischio di hemopericardium. Per questo, pur mantenendo l'ago nella cavità toracica (e per alcuni siti di destinazione, allo stesso punto di entrata nel pericardio viscerale (ad es., parete laterale)), accuratamente eseguire cambiamenti sottili nell'angolo di incidenza dell'ago. Infine, usi sempre un ago che ha un chiaro e facile passaggio attraverso la pelle nella cavità toracica, evitando in tal modo smussature ago smussato da entrare il miocardio e causando danni significativi.

La procedura descritta nel presente documento, non solo permette la consegna affidabile e di successo di injectate in diversi siti di destinazione all'interno del miocardio, ma permette anche la correzione della traiettoria dell'ago in tempo reale, evitando così accidentale intrachamber parto ( Figura 2, H). Mentre chiuso petto IMI procedure sono state descritte in precedenza in topi, ci sono diverse limitazioni inerenti a questo modello animale piccolo. Queste limitazioni includono il numero di regioni di destinazione del miocardio favorevole alla terapia e il basso volume/numero di celle che può essere iniettato a destinazione sito29,41. Inoltre, consegna esatta della per iniettato è spesso una preoccupazione, con un tasso di successo vicino al 60-70%42, e pertanto l'uso di sistemi a ultrasuoni meno ampiamente disponibili ad alta frequenza è richiesta solitamente29,41, 42. Questi impianti sono equipaggiati con sensori di allineamento lineare che inoltre hanno limiti intrinseci di imaging (ad es., riverbero è un artefatto frequente)14. Un'altra limitazione di piccoli modelli di roditori quali topi e ratti, è loro intrinseche differenze nel sistema di trasporto di Ca+ 2 ed elettrofisiologia cellulare, che differisce da quello degli esseri umani e di grandi dimensioni modelli animali come cani, maiali e conigli 15,16,43. Tutte queste limitazioni spesso creano difficoltà nel tradurre i risultati in questi modelli in clinica senza previa conferma in un modello animale di grandi dimensioni.

Attento monitoraggio dell'animale nel periodo peri-procedurale è obbligatoria secondo le linee guida contemporanee per la cura degli animali da laboratorio. Come mostrato qui, questo potrebbe essere fatto da ecocardiografia seriale finestra scansioni e tracciati ECG, almeno fino a quando l'animale è sveglio dall'anestesia. Gli effetti acuti dell'IMI sul ritmo cardiaco anche possono essere monitorati da 24 h Holter ECG ed sono nostra pratica standard. Di nota, le aritmie più frequenti sono state isolate in PVC, che sono relativamente benigne in natura, e che erano più comuni negli animali che sono stati trattati con doxorubicina prima dell'IMI con InI (Vedi Figura 4A e 5A figura). Altre aritmie che erano relativamente meno frequenti includono: PVC in distici; PVC in terzine; così come NSVT (Vedi Figura 4B–D e figura 5B–D). Tuttavia, sono stati osservati senza aritmia minacciosa di vita come la tachicardia ventricolare. Di nota, abbiamo anche trovato che alcune manifestazioni cardiotossiche nel gruppo DOX potrebbero essere rilevate mediante ECG Holter Monitoraggio, utilizzando variabili di frequenza-dominio di tempo della variabilità della frequenza cardiaca (HRV) come SDNN. Così, una ridotta SDNN (Figura 5E, F), una misura lineare di stato di salute del cuore, è stata osservata nel gruppo DOX rispetto al gruppo normale. Questo è il primo rapporto di HRV ridotta, come dimostrato da una ridotta SDNN, nel contesto di un coniglio modello del AICM, che è in linea con l'osservazione che ridotto SDNN è un potente fattore predittivo indipendente di morte cardiaca in pazienti con HFrEF44 ,45,46. Le alterazioni in SDNN nel gruppo DOX sono probabilmente non relative alla procedura IMI stessa; Tuttavia, la conferma di questi risultati in conigli che ricevono la doxorubicina, come pure gli animali normali che non ricevono l'IMI, è richiesta. Se SDNN ridotta in HFrEF potrebbe anche essere migliorato e quindi utilizzato come una misura sostitutiva del beneficio della terapia con cellule staminali basata, resta da valutare, e sarà al centro della ricerca futura.

Sono stati esplorati diversi itinerari di consegna delle cellule nel cuore, tra cui endovenoso, intracoronary e consegna intramiocardico; Tuttavia, il percorso intramiocardico come utilizzato nel presente documento, ha costantemente dimostrato il massimo livello di cella conservazione tariffe1,2,3,4,5,37. Non valutiamo tasso di ritenzione delle cellule negli studi presentati qui, come la metodologia utilizzata non è robusto e abbastanza specifico per quantificare questo in vivo o ex vivo, che è una limitazione di questo studio. Invece, abbiamo usato le cellule HEK-293 EGFP(+) le cui caratteristiche fenotipiche ci ha permesso di distinguere facilmente la presenza di queste cellule all'interno del miocardio, indicando così successo intramiocardico consegna. Tuttavia, lo scopo principale era di sviluppare una tecnica mini-invasiva per cui potremmo effettuare consegna IMI e cellulare nel miocardio di un modello di grande dimensione, preclinico di cardiomiopatia non ischemica. Come dimostrato nella Figura 2 e Figura 3, questo è stato compiuto per la prima volta da percutanea contrasto ecocardiografia-guida IMI. Ulteriori studi sono necessari per valutare il tasso di ritenzione delle cellule così come i potenziali effetti benefici delle cellule staminali consegnati nel miocardio utilizzando la procedura descritta nel presente documento; questi studi sono attualmente in corso. Recentemente abbiamo comunicato risultati promettenti per quanto riguarda gli effetti funzionali39,40.

Rispetto all'IMI in una procedura aperta sul petto, un contrasto percutaneo guidata da ecocardiografia IMI in un modello preclinico grande come descritto in questo studio, è molto meno invasivo nella natura con rapido recupero dell'animale seguendo la procedura e, come accennato in precedenza, ha anche la più bassa mortalità tasso8,38. È un altro approccio all'IMI IMI basati su catetere, che inoltre è stato testato in modelli preclinici e parecchi piccoli test clinici (per una rassegna, Vedi Sheng et al.) 47. con questo approccio, un catetere è avanzato nella cavità di LV e quindi posizionato in siti di destinazione all'interno l'endocardio. Questi siti di destinazione sono che sia identificato prima della procedura, ad esempio, usando la formazione immagine a risonanza magnetica cardiaca (CMR) di contrasto48, o durante la procedura, per esempio, dal tracciato endocardial elettromeccanico (EEM), per chiaramente differenziare il miocardio vitale prima dell'iniezione49. Quest'ultimo approccio è meno invasiva rispetto per aprire il forziere IMI sotto vista diretta, che è un chiaro vantaggio. Anche, poiché IHD negli esseri umani ha una distribuzione irregolare, EEM aiuta a dirigere la terapia specificamente ai siti vitali del miocardio, che è particolarmente importante nella regolazione dell'IHD. Tuttavia, un grave inconveniente è l'induzione di aritmie ventricolari, che sono una caratteristica comune di tutti gli approcci di IMI. Altri svantaggi includono il lungo tempo procedura, fornendo che EEM è una tecnica altamente esigente che richiede una formazione ampia e un conseguente rischio di perforazione cardiaca. Al contrario, percutanea contrasto ecocardiografia-guidata IMI come descritto in questo studio, è tecnicamente meno esigenti di IMI basati su catetere e, una volta ottenuta la competenza, può essere eseguita in modo sicuro all'interno di 25 min dopo l'anestesia. Allo stesso modo, poiché solo una breve parte dell'ago è avanzata nel miocardio, c'è un minor rischio di perforazione cardiaca, anche se lacerazione cardiaca è ancora possibile.

In conclusione, la percutanea contrasto ecocardiografia-guida IMI tecnica descritta in questo studio in un modello animale di grandi dimensioni, come ad esempio il coniglio16,43, è sicuro, ben tollerato ed efficace nel fornire il injectate nella cuore. Quindi, costituisce una strategia promettente per test di ipotesi preclinici degli effetti delle terapie cardiache rigenerativa in cardiomiopatia non ischemica (ad es., AICM), compresi, ma non limitatamente a, basata su cellule staminali terapia.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz e Manuel Molina per eccellente supporto fornito durante la raccolta dei dati e Carlos Bueno per fornire le cellule HEK-293 EGFP(+). Questo lavoro è stato supportato in parte dal: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Spagna (JT) (concessione numero: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de I + D + I 2008-2011 (Grant no. RD12/0019/0001) (JMM), co-finanziato con fondi strutturali dell'Unione europea (FESR) (JMM); e, l'Università di Reading, Regno Unito (AG, GB) (finanziamento centrale). I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HD11 XE Ultrasound System Philips 10670267 Echocardiography system.
S12-4 Philips B01YgG 4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) Parket laboratories Inc N 01-08
Vasovet 24G Braun REF 381212  over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe Braun 9161406V
Imalgene (Ketamine) Merial RN 9767 Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine) Esteve CN 570686.3 Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1 Faber-Castel 16 33 99 India (China) Ink
Holter Syneflash Ela medical SF0003044S 24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor® Ambu (NUMED) VLC-00-S Holter ECG electrodes.
Microtome Leica Biosystems RM2155
Microscope Olimpus CO11
ABC Vector Elite Vector Laboratories PK-6200 Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody Invitrogen A10262 Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody Vector Laboratories BA-9010 Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) DAKO (Agilent) S3000
Fluorescence Microscope Carl Zeiss
MicroImaging		 Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG Elamedical Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  Fisher Scientific 11965084
10% fetal calf serum (FCS) Fisher Scientific 11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific 25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Fisher Scientific 31985070
Hygromycin B Calbiochem (MERCK) 400051
Xylene (histological) Fisher Scientific X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) Sigma H1009
Pronase Fisher Scientific 53-702-250KU

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Medicina problema 131 modello animale cardiomiopatia terapia cellulare l'ecocardiografia di contrasto iniezione intramiocardica insufficienza cardiaca
L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto e consegna delle cellule in un modello preclinico grande
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Giraldo, A., Talavera López,… More

Giraldo, A., Talavera López, J., Fernandez-Del-Palacio, M. J., García-Nicolás, O., Seva, J., Brooks, G., Moraleda, J. M. Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model. J. Vis. Exp. (131), e56699, doi:10.3791/56699 (2018).

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