Summary
建設と操業追跡ナノスケール蛍光ことができるリアルタイム 3 D 単一粒子追跡顕微鏡プローブ高拡散速度と低い光子カウント率をこのプロトコルの詳細
Abstract
リアルタイム三次元単一粒子 (RT-3D-SPT) を追跡するセルラ システムにおける高速、3 D プロセスに光を当てる可能性があります。各種 RT 3 D SPT は、近年に前方を置かれているがユーザーは、課題のままに低い光子カウント レートでの粒子の拡散 3 D 高速を追跡します。さらに、RT 3 D SPT セットアップが一般に複雑で実装が困難生物学的問題への広範な応用を制限します。このプロトコルは、(10 kHz) まで低光子カウント レートで 3 D ダイナミック フォトン局在追跡 (3 D DyPLoT)、高拡散速度 (最大 20 μ m2/s) の粒子を追跡する名前付き RT 3 D SPT システムを提案します。3 D DyPLoT が 2次元電気光学偏向器 (2 D EOD) を採用し、単一焦点を当てたドライブに可変音響グラデーション (タグ) レンズ レーザー 3 D で動的にスポット。最適化された位置推定アルゴリズムを組み合わせると、3 D DyPLoT を高いトラッキング スピードと高い位置推定精度単一粒子にロックできます。単一励起と単一検出パス レイアウト、3 D DyPLoT は堅牢で簡単にセットアップです。このプロトコルでは、3 D DyPLoT ステップ バイ ステップを構築する方法について説明します。まず、光のレイアウトが記述されます。次に、システムは校正、走査線 190 nm の蛍光ビーズを圧電 nanopositioner を最適化します。最後に、リアルタイム 3 D の追跡能力を示すためには、110 nm の蛍光ビーズが水で追跡されます。
Introduction
高度なイメージング技術の出現は、分子レベルまでの細胞現象のより詳しい構造を表示するウィンドウを開いています。確率論的光再構成顕微鏡 (嵐)1,2,3、光重合のローカリゼーション顕微鏡 (パーム)4,5,6,7 等、照明顕微鏡 (SIM)8,9,10,11, 構造および誘導放出の枯渇顕微鏡 (STED)12,13、 14は、生きた細胞の機能と構造に前例のない詳細を提供する回折限界を越えるまで行っています。しかし、どのようにこれらのシステムの動作を完全理解構造情報と同様に、動的な情報が必要です。上記の超解像の方法は、空間分解能、時間分解能、ダイナミックなプロセスを検出できる時間の精度を制限することの間のトレードオフを含みます。空間精度と時間分解能の両方が RT 3 D SPT15,16,17,18,19,20を提供する方法 21,22,23,24,25,26,27,28,29。ここでは、我々 は区別を描く伝統的な 3 D SPT30と spt 上 RT-3D 伝統的な 3 D SPT が単に必要です (どちらか落射蛍光顕微鏡や共焦点の顕微鏡を使用して得ることができる 3次元画像データの時系列右の構成を与えられた)。伝統的な 3 D-SPT で粒子の座標は、軌道を作成する、各画像のスタックで粒子を検索し、連続ボリュームの場所を連結によってデータ収集後決定されます。これらのメソッドは、究極の時間分解能は体積のイメージング速度によって決定されます。共焦点顕微鏡は、これは簡単に数十秒秒のスケールで。落射蛍光メソッドは、前記軸位置情報を抽出することができますので、光路は操作され、時間の分解能は、カメラの露出や読み出し時間によって制限されます。これらの epifluorescent メソッドは、軸方向の情報を収集できる範囲に限られている、デザインと適応光学は 10 μ m またはより多くの31,32これらの範囲を拡張するフーリエ面相の最近の進歩のマスクが,33,34。
対照的に、RT 3 D SPT では、3 D 画像のスタックを取得し、事実の後の粒子を見つけることに依存しません。代わりに、単一ポイント探知器を介してリアルタイムの位置情報を抽出し、効果的にフィードバックが適用される高速圧電ステージを使用して対物レンズの焦点容積の粒子を「ロック」。これにより限られた粒子の位置の連続測定、だけでどのように多くの光子を収集することができます。また、このメソッドは、長い範囲に移動すると、粒子のスペクトルの尋問をできます。RT 3 D SPT 有効ナノスケール物質、粒子は継続的に検出、大型レーザー加工力を必要とせずリアルタイムまたは光で測定前記のフォース フリー光学トラップに似ている作品を強制します。考えると RT 3 D SPT 高速拡散オブジェクト (最大 20 μ m2/s)25,29低光子カウント レート20,29、3 つの次元での継続的な尋問のための手段を提供します 35、それの細胞内輸送、ligand 受容器のバインディング、および単一粒子の細胞のダイナミクスなど高速または一時的な生物学的プロセスにウィンドウを提供する必要があります。しかし、このポイントに RT 3 D SPT のアプリケーションはこの技術を進めるために働くグループの一握りに制限されています。
1 つの障壁は、RT 3 D SPT メソッドは、変化に必要な光のレイアウトの複雑さです。ほとんどのメソッドは、光フィードバックは圧電ステージによって提供されます。粒子は小さな動きの X、Y、または Z、シングル ポイント探知器からの読み出しエラー関数に変換され、供給として圧電 nanopositioner を高速で回す移動粒子の運動を効果的に対抗するためにサンプル対物レンズの相対的な場所にそれをロックします。X で小の位置の動きを測定する Y、および Z、複数検出器 (4 または 5 の実装に応じて)15,18,21または複数の励起スポット (2-4、低いどの場合も適用できます、ロックイン アンプを使用して、X を抽出して Y 位置回転レーザー スポット)25,28が適用されます。これら複数の検出、発光スポットの重複、システムの配置および保守が困難。
ここで、3 D DyPLoT29と呼ばれる簡略化された光学設計と高速ターゲット ロックの 3 D SPT 法を提案する.3 D DyPLoT は、高レート (50 kHz XY ・ Z 70 kHz) で客観的焦点音量を介し集光レーザー スポットを動的に移動する 2 D EOD とタグ レンズ36,37,38を使用します。レーザー焦点位置と光子の到着時間を組み合わせることにより、低光子カウント レートでも急速に得られる粒子の 3 D 位置。騎士のツアー パターン39 X Y 平面に 1 x 1 μ m の正方形のサイズでの 2D EOD ドライブのレーザーの焦点とタグ レンズは 2-4 μ m の範囲で軸方向にレーザーの焦点を移動します。3 D 粒子の位置は、最適化された位置推定アルゴリズム29,40 3 D で取得されます。3 D 動的に動いてレーザー スポット、フォトンカウンティング アバランシェ フォト ダイオード (APD)、実時間粒子位置の計算、圧電ステージ フィードバック、およびデータ記録からのコントロールは、フィールド プログラマブル ゲート アレイ (FPGA) で行われます。このプロトコルでは、ステップバイ ステップで、固定粒子を用いたキャリブレーション光学アライメントを含む 3 D DyPLoT 顕微鏡を構築する方法について説明し、最後に無料の粒子追跡。例として 110 nm 蛍光ビーズで追跡された継続的に水の分を一度に。
記載方法は、それがウイルス、ナノ粒子、エンドソームなど小胞など、低光レベルでの高速移動の蛍光プローブを継続的に監視する望まれる任意のアプリケーションに最適です。以前の方法と対照をなして単一励起とアラインメントや保守を簡単に作る、単一検出経路のみがあります。また、大規模な検知エリアはこの顕微鏡を簡単に拾う (10 kHz) まで低信号レベルで追跡する機能は、このメソッドは低光アプリケーション29に最適すぐに粒子を拡散できます。
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Protocol
1 のレイアウトおよび配置をセットアップします。
- インストールおよび追跡励起のコリメーション レーザーします。
- 自作のマウントを使用して光学テーブルにレーザーを貼付します。マウントは、取り付けレーザー ヘッドおよび光学テーブルの穴が付いたシンプルなアルミ板です。レーザーは、安定性と放熱のため金属製のマウントにしっかりと固定する必要があります。この作品は、特定の蛍光体に合うか実験する波長を選択できますが照明 (図 1)、488 nm 固体レーザを使用してください。重要な要因は 2 つのデフレクタ間波長板によって主に決定される 2D EOD の作業範囲をレーザー波長に合わせて (図 1: W2)。488 nm レーザーは効果的に、緑または黄色蛍光蛋白質 (GFP/YFP)、生きているセル実験における一般的な蛍光タグであるを刺激できます。
- レーザー ビーム高さと誘電体ミラーのペアを使用して方向を調整 (図 1: M). レーザー光は光学テーブルに平行かどうかを確認し、適切な高さに調整します。
注: 高さは顕微鏡プラットフォームに基づいて選択する必要があります。それ明示的には述べていませんが、このプロトコルで使われるそれ以降のすべてのミラーのこの高さを維持しなければなりません。 - コリメート レンズのペアを持つビーム (図 1: L1 と L2)。レンズの焦点距離は、2 D EOD の絞りでクリップされるレーザ スポットを避けるために慎重に選択必要があります。クリッピングは 2D EOD を通過した後レーザー ビーム形状の変化によって明白であります。コリメーションここの品質との相違は 2D EOD たわみ性を悪化する収差のレンズによって増幅されるため非常に重要です。理想的には、少なくとも 20 m のポイントにビームの集束によってビームをコリメートします。
- ピンホールを配置 (図 1: PH) 最初のコリメーション レンズの焦点に適切なサイズの (図 1: L1)。
- 適切なサイズのピンホールを選択します。ピンホールの大きさは、以下の計算に基づいて選択できます。
レーザーの波長λはfは最初のレンズの焦点距離、 Dは入射ビーム径。 - 3D 変換ステージ上ピンホールをマウントし、最初のコリメーション レンズの焦点を正確に配置できるようにします。
- ピンホールの位置を調整します。ピンホール後レーザー パワー メーターを置き、電源メーター読み出しを最大化するために XYZ のピンホールの位置を調整します。回折リングを観察すると、手前に 2 D EOD アイリス ブロックします。
- 適切なサイズのピンホールを選択します。ピンホールの大きさは、以下の計算に基づいて選択できます。
- グラントムソン偏光板のインストール
- グラントムソン偏光板を置く (図 1: GP) 第二のコリメーション レンズ後 (図 1: L2) レーザー光の偏光をきれいにします。パワーメータを最大転送を見つけるに偏光板を回転させます。
- EODs のインストール
- 2 EODs を使用 (図 1: EOD1 & EOD2) X および Y の方向のレーザーをそらすために。ヨー、ピッチ、および各 EOD の高さを調整することによってレーザ伝送を最大化します。
- 互いに各デフ側に製造元から提供されるアライメント マーカーを使用して 2 つの EODs を合わせます。
- EOD の出力を検査する 2 D EOD のコント ローラーにテスト パターンを適用されます。下記 FPGA または関数発生器によって提供される簡単な正弦波でナイトツアー (図 2) を指定できます。ベスト パフォーマンスのため各偏向で偏向は圧電 nanopositioner の X または Y 方向に平行する必要があります。この方向は、トランス ミッション軸デフレクタの角度の方向によって決まります。たわみ方向を回転すると、2 D EOD を移動せず、ピエゾ nanopositioner 軸にたわみ軸を揃える 2 D EOD 後鳩プリズムを配置します。
- 半波長板のインストール
- 半波長板を配置 (図 1: W1) グラントムソン偏光板の間 (図 1: GP) と着信のレーザーに合わせて 2 D EOD 2D EOD のたわみ軸と偏光のビームします。2 D EOD 後長焦点レンズ (300 mm) を配置し、レーザーの焦点に sCMOS カメラを配置します。次に、騎士のツアー (図 2) 以下を生成する 2次元 EOD を入れます。半波長板を回してカメラの均等に正方形レーザ分布が観察されます。
- レンズのペアと中継レンズ組み合わせを費やすはりのインストール
- レンズのペアを配置 (図 1: L3 と L4) 対物レンズの背面の開口部に合わせてビームを展開する 2 D EOD 後 (図 1: OL) とレンズの別のペア (図 1: L5 と L6) に対物レンズに焦点面を中継します。必ずタグ レンズは、後の手順でそれらの間インストールされますとレンズのこれらの 2 つのペアの間の十分な余裕を確保してください。
- ダイクロイック フィルター、10/90 ビームスプリッター、フォーカシング レンズ、APD、対物レンズと蛍光発光フィルター検出経路を完了するインストールします。
- ダイクロイック フィルターをインストール (図 1: DC) 対物レンズに向かってレーザーを反映します。長いレンズの筒の上下に 2 つの菖蒲を使用する対物レンズの中心をまっすぐ通過するレーザーを合わせます。
- 10/90 ビームスプリッターをインストール (図 1: BS) によって光の 10% が、イメージング用 sCMOS カメラ (後述) と追跡のための APD を通過の 90% によって反映されます。
- APD を合わせます。対物レンズで観察にレーザーを集中します。Coverslip からリフレクションを使用して、目的の焦点で観察を置くと APD 読み出しの強度をチェックすべてダウン ストリーム要素を揃えます。ビームスプリッター後、レンズを中心に APD をインストール (図 1: L7) 3 D 変換段階で APD が続きます。目標からのレーザー反射レンズの中心を通るようなレンズを配置します。
- レンズの 2 つのペアのタグ レンズ (図 1間: L4 と L5) として前に言及し、図 1に示す。タグ センター レンズを垂直に通過するビームをヨー、ピッチ、高さおよび横の位置を調整します。
2. 試料調製。
- 固定粒子の作製
- 190 nm の蛍光ビーズを希釈 〜 5 × 108ビーズ/mL の PBS の。圧電ステージのサンプル ホルダーに coverslip とマウントに 400 μ L ビーズ ソリューションを追加 (ビーズの量は、試料ホルダーに依存; ここで使用されるサンプル ホルダーの商工会議所の直径は 18 mm)。ここで使用されるビーズ、PBS によって発生する上、入金する粒子。
- 無料の移動粒子の作製
- 希釈する 110 nm の蛍光ビーズ 〜 5 × 108ビーズ/mL の DI 水で。観察に 400 μ L ビーズ ソリューションを追加し、圧電ステージのサンプル ホルダーにマウントします。
3. トラッキング パラメーターを最適化します。
- ラスター スキャン固定粒子
- 顕微鏡に固定粒子サンプルを置きます。
- レーザー、マイクロポジショナー コント ローラー、ピエゾ nanopositioner コント ローラー、タグ レンズ コント ローラーおよび EOD コント ローラーを入れます。順序が重要ではないことに注意してください。閉ループにおける圧電 nanopositioner を実行します。
- ラスター スキャン プログラムを使用してカスタム スキャン ソフトウェア (図 S3、著者からの要求時に利用可能なソフトウェア)、騎士のツアー (図 2) で 2 D EOD をドライブ、APD からカウントを収集し、ドライブの圧電 XYZ のサンプルnanopositioner、位置計算 (図 S2) を実行するとします。ステップ サイズは 40 nm、スキャン範囲は 2 μ m。
- 目的のフォーカス、coverslip に配置、蛍光発光フィルターを削除し、マイクロポジショナーの Z 位置の機能として信号強度を最大化する、coverslip からレーザーの反射を使用します。後焦点面にサンプルを置くこと、蛍光発光フィルターを配置戻る。
- スキャナー用のプログラムを開きます。'開始'、'終了'、および 'ステップ' で数値を入力して、スキャン範囲とステップ サイズを設定します。最初大規模なスキャン範囲と粒子 (例えば、200 nm ステップ サイズ 10 × 10 μ m 幅) を検索する手順のサイズを設定します。粒子を検出、スキャン範囲を縮小、ステップ サイズ (例えば、100 nm ステップ サイズの 2 x 2 μ m 範囲) を減らします。蛍光フォーカスを見つけるために 3D ラスター スキャンを実行するには、'scan' をクリックします。
- タグ レンズの設定 (図 3を参照してください)
- タグ レンズ制御ソフトウェアをクリックします。順番を '接続'、'電源を入れます'] をクリックします。
- トリガー信号の出力の位相を変更するには、出力トリガー モードを変更する必要は。まずモードを 'RGB' から 'Multiplane' を変更し、それを戻します。今フェーズがすることができます (図 3 b) を変更します。
- 0 °、90 °、270 ° に出力の位相を設定します。経験的に動作するようにこれらの 3 つが見つかった位相空間をカバーする 3 つのフェーズを使用できますが (図 3 c)。
- 68,500 Hz の周波数設定を選択します。
- 最適な周波数を見つけることそれは周波数の検索範囲を変更する必要があります。'詳細'、'設定' をクリックします。変更、' Max。Freq(Hz)' 列の 0 には 70,000 Hz から 71,500 Hz の。これは、どのような周波数範囲が適切に調整できます。クリックして '校正を保存'、'Exit 校正' (図 3)。
- 新しいキャリブレーションを有効にするために、別の周波数 (たとえば、189,150 Hz) に共鳴を切り替え、68,500 Hz 周波数設定 (図 3e) に切り替えた。
- 35% に徐々 に振幅を変更します。「共鳴をロック」をクリックします。周波数がロックされている 'のロックを解除共鳴' (図 3 e) をクリックします。タグ レンズは今を使用する準備ができてです。
- F. 入力 x、y のスキャン範囲の調整、図 4 eで示すように、実際の位置に等しい位置推定に推定で使用されるパラメーターを変更して移動に XYZ のサンプルをスキャンする z 'scan' をクリック ボタン、粒子移動のレーザー スポット。粒子の位置レーザー フォーカスを介してスキャン位置推定ループ (図 S1) によって決定される推定のパーティクルの位置と一致します。推定位置と実際の位置 (図 4 d) との関係は、推定位置の画像 (図 4 階) から抽出できます。位置が同意しない場合は、位置推定ループ (図 S1) で使用されているレーザーの位置 (kc) の値を調整します。
- タグ レンズを揃える
- タグ レンズ コント ローラーがオフの場合、ラスター スキャン タグ レンズをインストールする前に、インストールのタグ レンズは同じに見える必要があります後を撮影した (後述) 粒子画像です。次に、位置やタグ レンズ (図 4) の角度を調整する z nanopositioner の目的を移動することによって走査蛍光粒子 Z スタックを実行します。Z 方向、Z 位置 (図 4 d) の関数として粒子の XY 位置に変更がないとき達成される XY 平面に粒子画像のドリフトがないタグ レンズの位置を調整します。追跡システムはタグ レンズの配置後に使用する準備ができています。
- SCMOS 粒子監視用カメラの設置
- 彼らは追跡されている間に粒子を可視化する sCMOS カメラを取り付けます。追跡システムのすべてのコンポーネントのインストールおよび最適化完了後にのみ、sCMOS をインストールします。
4 自由にナノ粒子を拡散リアルタイム 3 D トラッキング
- 無料入れて、110 nm は、顕微鏡の粒子サンプルを移動します。
- レーザー、マイクロ位置決めコント ローラー、ピエゾ nanopositioner コント ローラー、タグ レンズ コント ローラーおよび EOD コント ローラーを入れます。オープン ループで圧電 nanopositioner を実行します。3.2 の手順に従ってタグ レンズ ソフトウェアを設定します。
- 開き、追跡ソフトウェア (著者からの要求時に使用可能) を実行します。セクション 3 で発見された最適化された値に位置推定パラメーターを設定します。
- 目的のフォーカス、coverslip に配置、蛍光発光フィルターを削除し、マイクロポジショナーの Z 位置の機能として信号強度を最大化する、coverslip からレーザーの反射を使用します。Coverslip を見つけた後、coverslip からソリューションにレーザーを集中する焦点位置 15 μ m を増加します。場所は、蛍光発光フィルターをバックアップします。
- 積分制御定数を設定します。低値から開始して、パーティクルの位置読み出しの振動を見ることができるまで、ゆっくりと増やして、積分制御定数を設定できます。振動が観測されて、一度振動を引き起こす値の 80% に不可欠なコントロールの定数を設定します。典型的な値は、'積分ゲイン' XY の 0.012 と z '積分ゲイン' 0.004 前後になる予定します。
- 'トラックしきい値' と 'トラック最小' 追跡しきい値を設定し、'検索'、' 自動トラック ' をクリックして追跡実験を開始します。終端トラッキングのしきい値がバック グラウンド レベルよりわずかに高い設定し、トラッキングをトリガーのしきい値は背景に比べて約 2 倍。ここでは、追跡のトリガーのしきい値は 3 kHz で、軌道を終了するためのしきい値は、1.5 kHz。
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Representative Results
固定粒子 (図 4) をスキャンと自由に拡散 110 nm 蛍光粒子追跡 (図 5) 上記のプロトコルを次に行った。同時にパーティクルの計算をする各ポイントでのスキャン位置を推定しながら圧電 nanopositioner と箱の光子を移動することによって粒子のスキャンを行ったでも強度 (図 4 a) の正方形で示し、推定位置 x で 1 × 1 × 2 μ m の範囲にわたって粒子の実際の位置との線形関係を示すスキャン画像 y、および z の方向 (図 4 b-f)。
リアルタイム追跡を示すためには、110 nm 蛍光粒子は水の 3 D DyPLoT (図 5 a, b) によって追跡されました。平均二乗変位 (MSD) 解析は、一般的な線形動作ブラウン運動 (図 5 c) の特性を示しています。30 軌跡の MSD 分析で示した平均流体力学的直径 110 nm (図 5 d) 蛍光ナノ粒子追跡されているサイズのメーカー仕様とよく一致。さらに、映画 1 リアルタイム圧電 nanopositioner の読み出しと自由に拡散 110 nm の蛍光粒子の 2 分長い軌道の sCMOS 画像を同期します。
高速で追跡することができるだけでなく、高精度と低速移動するパーティクルをローカライズできます。図 6a-dは、3 D DyPLoT システムの高速追跡、17.6、26.4、53.4 の精度を示すため使用として同じフィードバック パラメーターを用いた固定粒子への応用を示しています nm の X、Y、および Z、それぞれ 10 の光子計数率5。図 6 e-h 10、効果的に精度の速度を交換し、6.5、8.3、および 10.5 の精度の低下をフィードバック制御の下で精度を示しています nm の X、Y、および Z それぞれ。
図 1。3 D トラッキング システムの概略図。2 D EOD (EOD1 & EOD2) とタグ レンズ (タグ) はそれぞれ XY ・ Z 方向に沿ってレーザーを偏向させます。APD (APD) を使用して、FPGA (FPGA) に送信される蛍光の光子を収集します。FPGA は、位置計算アルゴリズム、フォトンカウンティング、2 D EOD の制御と同様、コントロール、圧電 nanopositioner (时: NSxyとNZz) の読み出しに使用されます。他のコンポーネントの図にラベル: ミラー (M);レンズ (L #);ピンホール (PH);グラントムソン偏光板 (GP);半波長板 (W1);ダイクロイック フィルター (DC);対物レンズ (OL、100 X ナ = 1.49);蛍光発光フィルター (F);ビームスプリッター (BS);マイクロポジショナー ステージ (MSxy);Z マイクロポジショナー ステージ (アムロ)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。3 D DyPLoT で実装された騎士のツアーの座標します。1 軸と第 2 軸は 2D EOD の適切な配置によって X または Y 軸に沿って整列する必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。タグ レンズ ソフトウェア設定します。詳細についてはセクション 4.2 タグ レンズの設定を参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。粒子のスキャンと位置推定します。2D EOD 1 × 1 μ m のレーザーを運転 (a) 走査像 190 nm の蛍光ビーズは、騎士のツアー パターンを正方形します。蛍光強度は色で示されます。ユニット: kHz。(b) x の推定k、2 D EOD の中心を基準として粒子の位置をマイクロ メートルでスキャンします。B c、およびdの色は、推定位置を示します。単位: μ m. ykマイクロ メートルでの推定 (c)。(d) zk、タグ レンズの軸の中心と相対的な粒子の位置の推定をマイクロメータでスキャンします。(e) 推定粒子位置 ykステージの関数として位置 (c) からグリッド全体平均。位置推定アルゴリズム (yk) から得られる推定粒子の位置が実際の位置と同意するに注意してください。(f) 推定粒子位置 zkステージの関数として位置 (d) からグリッド全体平均。位置推定の 1 × 1 × 2 μ m 範囲内で粒子の実際の位置と線形の関係を示しています X、Y、および Z の方向。位置推定アルゴリズム (zk) から得られる推定粒子の位置が実際の位置と同意するに注意してください。推定位置粒子の実際の位置と線形の関係を示しています、1 × 1 × 2 μ m の範囲内で X、Y、および Z 方向。白いスケール バー (、-c) 表す 500 nm で、(d) 黒スケール バーを表します 2 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 5。3 D DyPLOT が付いている水で 110 nm の蛍光粒子を追跡します。水で自由に拡散 110 nm 蛍光ナノ粒子の 3 D 軌道が (、)。(b) (、) の軌道を時間の関数としての蛍光強度。(c) (、) の軌道の MSD。青い線は測定の MSD 赤の点線はベスト ・ フィット直線回帰からです。110 の平均流体力学的直径を示す 30 の軌道 (d) MSD 分析 nm、追跡されている蛍光ナノ粒子のサイズとよく一致します。粒子の直径は、ストークス-アインシュタインの関係を使用して計算しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。固定粒子追跡の精度です。(、) A の固定粒子は別カウント レートで 3 D DyPLoT によって追跡されます。精度は、(b) 17.6 nm X、y、(c) 26.4 nm と 100 kHz の放出量で Z で 53.4 (d) nm です。(e) 反応が遅いプロセス、フィードバック制御をプロービング時定数 (K私) は、精度を高めるため 10 の要因によって減らすことが。この減らされたフィードバック制御の下で、精度は X (f) 6.5 nm、Y、(g) 8.3 nm と 100 kHz の放出量で z (h) 10.5 nm です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
S1 を図します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
S2 を図します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
S3 を図します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
3 D の単一粒子追跡方法の多くの品種は、近年浮上している堅牢なリアルタイムで追跡の簡単なセットアップと低い光子カウント料金で高速三次元拡散はまだ重要な生物学への応用を制限の挑戦問題。3 D DyPLoT メソッドは、いくつかの方法でこれらの課題をこのプロトコルのアドレスで説明します。まず、励起と検出経路はシンプルで堅牢な合わせを作る他の実装に比較して大幅簡素化します。第二に、移動レーザー スポットと位置推定アルゴリズムより安定したフィードバックを作るフィードバック ループの位置の正確な推定値を提供します。第三に、動的に移動レーザー スポットの効果的に大規模な検出範囲 (4 μ m x 1 x 1) は、高速移動粒子の追跡のためことができます。この大規模な検知エリアが重要な理由は、「圧電 nanopositioner 組み込みの応答時間を考慮することが重要です。高速圧電ステージは、1 kHz、順番に 1 さんの 1 ms、4 μ m2/s の拡散係数と 100 nm のナノ粒子への応答時間を制限する順序の共鳴回折麗のセンターから平均 90 nm に拡散します。負わないもの検出ボリューム。平均変位のみで、真にランダムな動きは粒子焦点ボリュームを残して、現在の軌道を終了につながる、これよりもはるかに大きいステップを出展いたします。状況は、ますます大きい熱拡散手順が追跡の損失につながる小さな粒子にも悪いです。効果的に大規模な検知エリアは、追跡システムが組み込み圧電ステージの遅れを克服し、追跡機構の全体的な堅牢性を増加粒子の位置に大きな拡散ジャンプから回復のためことができます。最後に、大規模なスキャン領域は、簡単に迅速に取得する連続した軌跡と大きなデータ セットをコンパイルを可能にする、新しい粒子を拾うシステムをできます。
ユーザーは、いくつかの重要なステップがあることを念頭に置いてください。まず、2 D EOD とタグ レンズの配置が重要です。両方は、最適な精度を得るにも配置する必要があります。第二に、スキャン ステップ固定粒子の位置の推定に使用されるパラメーターをも調整する必要が (図 4を参照)。推定される粒子の位置は、レーザー スキャン範囲の中心に対応する粒子の位置を一致させてください。最後に、フィードバックの整数定数 (K私) は、慎重に、小さな値で始まるしランプ振動が観測されるまで、その値の約 80% にバックオフに調整必要があります。
目的のアプリケーションに応じて心に留めて 3 D DyPLoT についていくつか注意点があります。最適化された位置推定はブラウン運動を利用した用です、それは方向に向けて適しても。アルゴリズムは、ガウス、ない実際の粒子の位置と見なされます位置不確実性だけだから直接運動の任意の型に適用できます。永続的な直線的な動きが予想される場合、追加用語は位置推定アルゴリズムの予測項を追加できます (方程式 3 補足情報を参照してください)。
3 D DyPLoT を設定するとき、2 D EOD とタグのパラメーターの選択を注意深く検討されるべき。特に重要な 2 D EOD によってスキャンされた騎士のツアー用 bin 時間です。理想的なシナリオでは、騎士のツアーは、効率的なサンプリングが確実にタグ レンズの期間に同期するでしょう。しかし、電圧の変化をステップに 2 D EOD の応答時間を考慮する重要です。ここで使用される単位、2-3 μ s の応答時間後、目的の場所に達する前に電圧があります。20 μ s の箱に、これはコレクション時間の約 10-15% です。タグ レンズの期間に一致するように時間を短縮 〜 14 μ s 2 D EOD のタイムラグは、bin の時間の割合が上昇します。これは見積もりレーザー位置と不適切な位置の不適切な値をもたらします。
覚えておいて実験者のためのもう一つの要因は、一時的な解像度です。100 khz のデータで示すデータを収集している間、究極の時間分解能、位置計測用に使用されるデータを最終的に定義されます。場合は、粒子の位置 (図 6) として、nanopositioner の読み出しを使用すると、時間の分解能は積分制御定数の値によって異なります。たとえば、図 6 a-dに示すように積分制御段階応答は 1 の順序図 6e-h、 10 さんの順序は高速時間分解能が必要な場合のために、ms、光子-光子によって位置推定アルゴリズムの結果が光子計数率と相関します。たとえば、10 kHz の放散が得られます 100 μ 秒時間分解能と 100 kHz 放散量 10 μ 秒の時間分解能が得られます。精度次からさらに、
関係41、時空の精度が結合されています。その結果、プローブの明るさは、時空の両方の精度を指定します。
このプロトコルでは、セットアップ、レイアウト、および配置の高速リアルタイム 3 D 単一粒子追跡法 2次元 EOD および急速な粒子の位置推定を実現する集光レーザー スポットを動的に移動するタグ レンズを利用するを説明します。その後、サンプル準備およびパラメーター最適化手法について述べる。3 D DyPLoT は、高速移動と卑しい拡散パーティクルの放出をロックオンする堅牢な比較的簡単な方法を提供します。シンプルな光学レイアウト画像処理モジュールと組み合わせることがありますので、簡単に任意の既存の顕微鏡スタンド側ポートに追加することができます。このプロトコルで我々 は RT 3 D SPT の詳細は広く高速に対処するためより多くの研究者によって 3 つの次元の生物学的プロセスを実装することができます願っています。
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Disclosures
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
Acknowledgments
この作品は、によって、国立医学研究所の一般的な受賞番号 R35GM124868 の下で健康の国民の協会のデューク大学にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D Electro-optic Deflector | ConOptics | M310A | 2 required |
| Power supply for EOD | ConOptics | 412 | Converts FPGA ouput to high voltage for EOD |
| TAG Lens | TAG Optics | TAG 2.0 | Used to deflect laser along axial direction |
| XY piezoelectric nanopositioner | MadCity Labs | Nano-PDQ275HS | Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in |
| Z piezoelectric nanoposiitoner | MadCity Labs | Nano-OP65HS | Used to move the objective lens to follow the diffusing particle |
| Micropositioner | MadCity Labs | MicroDrive | Used to coarsely position sample and evaluate |
| Objective Lens | Zeiss | PlanApo | High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss |
| sCMOS camera | PCO | pco.edge 4.2 | Used to monitor the particle's position |
| APD | Excelitas | SPCM-ARQH-15 | Lower dark counts beneficial |
| Field programmable gate array | National Instruments | NI-7852r | |
| Software | National Instruments | LabVIEW | |
| Tracking excitation laser | JDSU | FCD488-30 | |
| Lens | ThorLabs | AC254-150-A-ML | L1 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L2 |
| Pinhole | ThorLabs | P75S | PH |
| Glan-Thompson Polarizer | ThorLabs | GTH5-A | GT |
| Half-wave plate | ThorLabs | WPH05M-488 | WP |
| Lens | ThorLabs | AC254-75-A-ML | L3 |
| Lens | ThorLabs | AC254-250-A-ML | L4 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L5 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L6 |
| Dichroic Mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | DC |
| Fluorescence Emission Filter | Chroma | D535/40m | F |
| 10/90 beamsplitter | Chroma | 21012 | BS |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| 190 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/9942 | |
| 110 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/10617 | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-545A | |
| Powermeter | Thorlabs | PM100D | |
| CMOS | Thorlabs | DCC1545M | |
| Iris | Thorlabs | SM1D12D | |
| Microscope | Mad City Labs | RM21 |
References
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