Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En protokol til Real-time 3D enkelt partikel Tracking

Published: January 3, 2018 doi: 10.3791/56711
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Duke University

Summary

Denne protokol detaljer opførelse og drift af en real-time 3D enkelt partikel tracking mikroskop i stand til at spore nanoskala fluorescerende sonder ved høj diffuserende hastighed og lav foton count priser.

Abstract

Real-time tredimensionale enkelt partikel tracking (RT-3D-SPT) har potentiale til at kaste lys over hurtig, 3D processer i cellulære systemer. Selvom forskellige RT-3D-SPT metoder har været fremlagt i de seneste år, stadig sporing af høj hastighed 3D spreder partikler til lav foton count priser en udfordring. Derudover er RT-3D-SPT opsætninger generelt komplekse og vanskelige at gennemføre, begrænse deres udbredte anvendelse til biologiske problemer. Denne protokol præsenterer en RT-3D-SPT system opkaldt 3D dynamisk Photon lokalisering Tracking (3D-DyPLoT), som kan spore partikler med høj diffuserende hastighed (op til 20 µm2/s) til lav foton count priser (ned til 10 kHz). 3D-DyPLoT beskæftiger en 2D elektro-optisk deflektor (2D-EOD) og en afstemmelige akustiske gradient (TAG) linse til at drive en enkelt fokuseret laser spot dynamisk i 3D. Kombineret med en optimeret position estimering algoritme, kan 3D-DyPLoT låse på én partikler med høj sporing hastighed og høj lokalisering præcision. Enkelt excitation og enkelt registrering sti layout er 3D-DyPLoT robust og let at sætte op. Denne protokol beskriver hvor hen til opbygge 3D-DyPLoT trin for trin. Først, den optiske layout er beskrevet. Næste, systemet er kalibreret og optimeret af raster scanning en 190 nm fluorescerende perle med den piezoelektriske nanopositioner. Endelig, for at vise real-time 3D inddeling evne, 110 nm fluorescerende perler er sporet i vand.

Introduction

Fremkomsten af avanceret billedbehandling teknikker har åbnet et vindue for at se mere detaljerede struktur af cellulære fænomener, hele vejen ned til det molekylære niveau. Metoder såsom stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM)1,2,3, foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM)4,5,6,7 , struktureret belysning mikroskopi (SIM)8,9,10,11, og stimuleret emission udtynding mikroskopi (STED)12,13, 14 er gået langt ud over diffraktion grænsen til at levere hidtil usete detaljer i struktur og funktion af levende celler. Dog kræver fuld forståelse af hvordan systemerne opføre sig dynamisk information samt strukturelle oplysninger. Super-opløsning metoder ovenfor indebærer en afvejning mellem rumlige og tidsmæssige opløsning, begrænse den tidsmæssige præcision som dynamiske processer kan blive aftestede. En metode, der giver både højt rumlige præcision og tidsmæssige opløsning er RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Her, vi skelne mellem traditionelle 3D-SPT30 og RT-3D-sømløse rør traditionelt 3D-SPT blot kræver en tidsserie af tre-dimensionelle billeddata (som kan erhverves enten ved hjælp af en Konfokal mikroskop eller et epifluorescensmikroskop givet de rigtige konfiguration). I traditionel 3D-SPT fastsættes koordinaterne af partiklen efter indsamling af data ved at finde partiklen i hver billedstak og sammenskriver steder i successive diskenheder til at oprette en bane. For disse metoder bestemmes den ultimative tidsmæssige opløsning af den volumetriske imaging sats. For Konfokal mikroskoper er dette uden sammenligning på skala fra sekunder til snesevis af sekunder. For epifluorescensmikroskop metoder, hvori den optiske transmissionslængde manipuleres således at den aksiale placeringsoplysninger kan udtrækkes, er den tidsmæssige opløsning begrænset af kamera eksponering eller udlæsning tid. Disse epifluorescerende metoder er begrænset i rækken over som aksial oplysninger kan indsamles, selv om de seneste fremskridt i Fourier flyet fase masker design og adaptiv optik udvidelse af disse intervaller til 10 µm eller flere31,32 , 33 , 34.

Derimod stole RT-3D-sømløse rør ikke på erhverve en 3D billedstak og finde partikler efter kendsgerning. I stedet, real-time placeringsoplysninger udvindes via singlepoint detektorer og feedback er anvendt til effektivt "låse" partiklen af fokale omfanget af formålet objektivet ved hjælp af en highspeed piezoelektriske fase. Dette giver mulighed for kontinuerlig måling af den partikel holdning begrænset kun af hvor mange fotoner kan afhentes. Desuden, denne metode gør det spektral forhør af partiklen, som den bevæger sig over lange afstande. RT-3D-sømløse rør i realiteten fungerer som en kraft-fri optisk fælde for nanoskala objekter, hvori partiklen er løbende aftestede og målt i realtid uden behovet for stor laser beføjelser eller optisk styrker. Eftersom at RT-3D-sømløse rør giver mulighed for kontinuerlig forhør af hurtigt diffuserende objekter (op til 20 µm2/s)25,29 i tre dimensioner på lav foton count satser20,29, 35, bør det give et vindue ind hurtigt eller forbigående biologiske processer såsom intracellulære fragt transport, ligand-receptor binding og ekstracellulære dynamikken i enkelt virioner. Men til dette punkt, anvendelsen af RT-3D-SPT har været begrænset til håndfuld af grupper, der arbejder for at fremme denne teknologi.

En hindring er kompleksiteten af den optiske layout kræves af RT-3D-SPT metoder, der er varieret. For de fleste metoder, er den optiske feedback fra en piezoelektriske fase. Som partikel gør små bevægelser i X, Y eller Z, udlæsninger fra enkelt punkt detektorer er konverteret til fejl funktioner og fodret på højhastighedstog til en piezoelektriske nanopositioner, som i slå flytter prøve at modvirke den partikel bevægelse, effektivt låse det på plads i forhold til de objektive linse. Til at måle små positionelle bevægelser i X, Y og Z, enten flere detektorer (4 eller 5 afhængigt af gennemførelsen)15,18,21 eller flere excitation steder (2-4, nederst som kan anvendes, hvis en lock-in forstærker bruges til at udtrække X og Y position ved hjælp af en roterende laser spot)25,28 anvendes. Overlapningen af disse flere påvisning og emission steder besværliggør systemerne til at justere og vedligeholde.

Heri, præsenterer vi en højhastigheds target-låst 3D-SPT metode med en forenklet optisk design kaldes 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT bruger en 2D-EOD og et TAG linse36,37,38 dynamisk flytte en fokuseret laser spot gennem den objektive fokale volumen ved en høj (50 kHz XY, 70 kHz Z). Kombinere laser fokus position og photon ankomsttid gør det muligt for den partikel 3D position opnås hurtigt selv ved lav foton count priser. 2D-EOD drev laser fokus i en ridder tour mønster39 med en kvadratisk størrelse på 1 x 1 µm i X-Y plane og TAG objektivet flytter laser fokus i aksial retning med et udvalg af 2-4 µm. 3D partikel position er opnået med en optimeret position estimering algoritme29,40 i 3D. Kontrol af den 3D dynamisk flytte laser spot, foton optælling fra lavine fotodiode (APD), real-time partikel holdning beregning, piezoelektriske fase feedback og dataregistrering udføres på et felt programmerbare gate array (FPGA).I denne protokol, vi beskriver, hvordan man opbygger en 3D-DyPLoT mikroskop trinvise, herunder optiske justering, kalibrering med faste partikler, og endelig gratis partikel tracking. Som en demonstration, blev 110 nm fluorescerende perler sporet kontinuerligt i vand i minutter ad gangen.

Den metode beskrevet heri er et ideelt valg for enhver anvendelse, hvor det ønskes at kontinuerligt overvåge en holdbar-omflytning fluorescerende sonden ved lave lysniveauer, herunder vira, nanopartikler og blærer som endosomes. I modsætning til tidligere metoder er der kun en enkelt excitation og enkelt påvisning pathway, hvilket gør justering og vedligeholdelse ligetil. Desuden muliggør store bevægelsesdetektering område denne mikroskop til nemt at afhente hurtigt spreder partikler, mens mulighed for at spore ved lav signal niveauer (ned til 10 kHz) gør denne metode ideel til lav-lys programmer29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. opsætning af Layout og justering

  1. Installation og collimation af tracking excitation laser
    1. Anbringe laser den optiske tabel ved hjælp af et hjem-bygget mount. Mount er en simpel aluminiumplade med monteringshuller for laser hovedet og tabellen optisk. Laser skal være solidt fastgjort til en metal mount for stabilitet og varmeafledning. For dette arbejde, bruge en 488 nm solid state laser til belysning (figur 1), selvom bølgelængden kan vælges der passer til en bestemt fluorophore eller eksperimentere. En afgørende faktor er, at laser bølgelængde passe 2D-EOD arbejdsområde, som bestemmes primært af bølge plade mellem de to deflektorer (figur 1: W2). 488 nm laser kan effektivt ophidse den grøn eller gul fluorescerende protein (normal god landbrugspraksis/YFP), som er fælles fluorescerende tags i levende celle eksperimenter.
    2. Justere laser stråle højde og retning ved hjælp af et par af dielektriske spejle (figur 1: M). Sørg for laserstrålen er parallelle med den optiske tabel og justere det til en passende højde.
      Bemærk: Højden bør vælges baseret på mikroskop-platformen. Denne højde bør opretholdes for alle efterfølgende spejle bruges i denne protokol, men det ikke vil være udtrykkeligt.
    3. Collimate bjælke med et par af linser (figur 1: L1 og L2). Brændvidder linser skal vælges omhyggeligt at undgå laser stedet bliver klippet af blænde af 2D-EOD. Klipning fremgår af en ændring i den laser stråle form efter at have passeret gennem 2D-EOD. Kvaliteten af collimation her er meget vigtigt, fordi afvigelser vil blive forstærket af efterfølgende linser og nogen divergens vil forringe ydeevnen af 2D-EOD deformation. Ideelt set collimate bjælken ved at fokusere strålen til et punkt mindst 20 m væk.
  2. Placer en pinhole (figur 1: PH) af passende størrelse på fokus i den første collimation linse (figur 1: L1).
    1. Vælg en passende størrelse pinhole. Pinhole størrelse kan vælges baseret på følgende beregning:
      Equation 1
      Hvor λ er bølgelængden af laser, f er brændvidden af den første linse, og D er input lysbundtets diameter.
    2. Montere pinhole på en 3D oversættelse fase, således at det kan placeres præcist på fokus i den første collimation linse.
    3. Justere placeringen af pinhole. Placer en laser power meter efter pinhole og justere pinhole placering i XYZ at maksimere power meter udlæsning. Hvis en diffraktion ring er observeret, blokere det med en iris placeret før 2D-EOD.
  3. Installation af Glan-Thompson polarisator
    1. Sætte Glan-Thompson polarisator (figur 1: GP) efter den anden collimation linse (figur 1: L2) til at rense polariseringen af laserstrålen. Drej polarisator for at finde maksimale transmission med wattmeteret.
  4. Installation af EODs
    1. Bruge 2 EODs (figur 1: EOD1 & EOD2) til at aflede laser i X og Y retning. Maksimere laser transmission ved at justere giring, tonehøjde og højden af hver EOD.
    2. Juster de to EODs forhold til hinanden ved hjælp af justering bogmærkeværktøj producenten på den side af hvert deflektor.
    3. Anvende et testmønster til 2D-EOD-controller til at inspicere output af EOD. Dette kan enten være ridderens tour (figur 2) via FPGA beskrevet nedenfor eller en simpel sinusbølge leveres af en funktionsgenerator. Den bedste ydeevne, bør afbøjning af hver deflektor være parallel med enten X eller Y retning af piezo-nanopositioner. Denne retning er dikteret af den kantede retning af deflektorer om transmission akse. Hvis du vil rotere afbøjning retning uden at flytte 2D-EOD, skal du placere en Duen prisme efter 2D-EOD justere afbøjning akser til piezo nanopositioner akser.
  5. Installation af halv-bølge plade
    1. Placer et halvt-bølge plade (figur 1: W1) mellem Glan-Thompson polarisator (figur 1: GP) og 2D-EOD til at justere den indgående laser stråle polarisering med 2D-EOD afbøjning akser. Placer en lang brændvidde linse (300 mm) efter 2D-EOD og placere en sCMOS kamera på laser fokus. Næste, sving på 2D-EOD at generere ridderens tour beskrevet nedenfor (figur 2). Rotere halvt-bølge plade, indtil en jævnt firkantede laser distribution er observeret på kameraet.
  6. Installation af en stråle expending linse par og relæ linse par
    1. Placere et par linser (figur 1: L3 og L4) efter 2D-EOD at udvide stråle til at fylde den tilbage blænde af formålet objektivet (figur 1: OL) og et andet par af linser (figur 1: L5 og L6) til relæ brændplanet til mikroskop mål. Vær sikker på at forlade nok plads mellem disse to par af linser, som TAG linse vil være installeret mellem dem i et senere trin.
  7. Installere den dichroic filter, 10/90 stråledeler, fokus linse, APD, mål linse og fluorescens emission filter for at fuldføre registrering pathway.
    1. Installere den dichroic filter (figur 1: DC) afspejler laser mod mål linse. Juster laser til at gå lige igennem midten af formålet objektivet ved hjælp af to iris på toppen og bunden af en lang linse tube.
    2. Installere en 10/90 stråledeler (figur 1: BS) af som 10% af lyset afspejles for billeddannelse af et sCMOS kamera (beskrevet nedenfor) og 90% af passerer gennem til APD til sporing.
    3. Juster APD. Fokusere laseren på en coverslip af formålet objektivet. Bruge refleksion fra coverslip til at justere alle downstream elementer ved at sætte en coverslip på den objektive fokus og kontrollere intensiteten af APD udlæsning. Efter stråledeler, installere APD fokusering linse (figur 1: L7) efterfulgt af APD på en 3D oversættelse scene. Placere linsen sådan, at laser refleksion fra målet går gennem midten af linsen.
APD holdning kan optimeres ved at justere positionen 3D for at maksimere intensitet fra laser refleksion på coverslip. APD position er på den optimale position når et træk af detektor stilling i enhver retning reducerer intensiteten.
  • Installere en longpass fluorescens emission filter (figur 1: F) før stråledeler at fjerne den reflekterede og spredt lys.
  • Installation af TAG linse
    1. Placer TAG linsen mellem de to par af linser (mellem figur 1: L4 og L5) som nævnt før og er vist i figur 1. Justere krøje, pitch, højde og sideleje, således at strålen passerer vinkelret gennem centrum af TAG linse.

    • 2. Prøvetilberedning.

    1. Fast partikel forberedelse
      1. Fortynd 190 nm fluorescerende perler til ~ 5 × 108 perler/mL i PBS. Tilføj 400 µL perler løsning på en coverslip og mount på prøveholderen af piezoelektriske fase (volumen af perler vil afhænge af prøveholderen; diameteren af prøven indehaveren salen bruges her er 18 mm). For Perlerne anvendes her, forårsager PBS partikler til at deponere på coverslip.
    2. Gratis bevægelige partikel forberedelse
      1. Fortynd 110 nm fluorescerende perler til ~ 5 × 108 perler/mL med Deioniseret vand. Tilføj 400 µL perler løsning på en coverslip og montere på prøveholderen af piezoelektriske fase.

    3. optimere Tracking parametre

    1. Raster Skan faste partikler
      1. Sætte en fast partikel prøve på mikroskopet.
      2. Aktivere laser, micropositioner controller, piezo nanopositioner controller, TAG linse controller og EOD controller. Bemærk, at rækkefølgen ikke er kritisk. Køre piezo nanopositioner i lukkede kredsløb.
      3. Raster Skan prøven i XYZ ved hjælp af en brugerdefineret scanning softwareprogram (Figur S3, software til rådighed efter anmodning fra forfatterne), som drev 2D-EOD i en ridderens tour (figur 2), indsamler tæller fra APD, drev piezo nanopositioner, og udfører holdning beregning (Figur S2). Trin størrelse er 40 nm og scanning rækkevidde er 2 µm.
        1. For at placere coverslip i fokus for objektive, fjerne filteret fluorescens emission og bruge afspejling af laser fra coverslip til at maksimere signal intensiteten som en funktion af micropositioner Z stilling. Efter at prøven på brændplanet, placere tilbage fluorescens emission filter.
        2. Åben Scannerprogrammet. Indstille scanning vifte og trin størrelse ved at skrive antallet i 'start', 'finish' og 'skridt'. Først indstille en store scanning vifte og skridt nummer hen til lokalisere en partikel (f.eks, 10 x 10 µm sortiment med 200 nm trin størrelse). Efter at finde partiklen, krybe den scanning vifte og formindske trin størrelse (f.eks., 2 x 2 µm rækkevidde med 100 nm trin størrelse). Klik på knappen 'scanning' for at udføre en 3D raster scanning for at finde de fluorescerende fokus.
    2. TAG linse indstillinger (Se også figur 3)
      1. Klik på TAG linse kontrol software. Klik på 'connect', 'Tænd' sekventielt.
      2. For at ændre output fase af signalerne, der udløser, er det nødvendigt at ændre output udløser tilstanden. Først ændre tilstand fra 'RGB' til 'Multiplansafbalanceringsmaskiner' og derefter ændre det tilbage. Nu fasen kan være ændret (figur 3b).
      3. Indstil output fase 0 °, 90 ° og 270 °. Mens alle tre faser, som dækker den fase plads kan bruges, disse tre er fundet til at arbejde godt empirisk (figur 3 c).
      4. Vælg indstillingen 68,500 Hz frekvens.
      5. For at finde den optimale frekvens er det ofte nødvendigt at ændre Søg frekvensområde. Klik på 'Avanceret', 'indstilling'. Ændring af ' Max. Freq(Hz)' af kolonne 0 fra 70.000 Hz til 71,500 Hz. Dette kan justeres til uanset frekvensområde er passende. Klik på 'Gem kalibrering', 'Exit kalibrering' (figur 3d).
      6. For at gøre den nye kalibrering effektiv, skifte resonans til en anden frekvens (eksempelvis 189,150 Hz) og derefter skiftede tilbage til 68,500 Hz frekvens indstilling (figur 3).
      7. Ændre amplitude gradvist til 35%. Klik på 'Afløse resonans'. Når frekvensen er låst, skal du klikke på 'låse resonans"(figur 3). TAG linsen er klar til at bruge nu.
      8. Kalibrere ved at ændre de parametre, der bruges i forbindelse med vurdering for at gøre den anslåede stilling svarende til den rigtige holdning, som vist i figur 4e, f. Input de scanning vifte af x, y og z og derefter klikke på 'scan' knappen for at scanne prøven i XYZ at flytte den partikel gennem bevægelige laser stedet. Placeringen af partiklen bør som det er scannet gennem laser fokus enig med den anslåede partikel position bestemmes af position estimering loop (Figur S1). Forholdet mellem anslået position og reelle position (figur 4 d) kan udvindes fra anslået position billeder (figur 4f). Hvis holdningerne ikke er enig, justere værdierne for laser position (ck) bruges i position estimering kredsløb (Figur S1).
      9. Juster TAG linse
        1. Når TAG linse controlleren er slukket, scannet raster partikel billeder (beskrevet nedenfor) taget før du installerer TAG linse, og efter installation TAG linse skal se ens. Næste, udføre fluorescerende partikel Z stak scanning ved at flytte mål med z nanopositioner til at tune den position og vinkel af TAG linse (figur 4). Tune placeringen af TAG objektivet, indtil der er ingen drift i partikel-billeder indstilles i flyet XY langs Z-retning, der opnås, når der er ingen ændring i XY position af partiklen som en funktion af Z position (figur 4 d). Tracking-system er klar til brug efter justering af TAG linse.
    3. Installation af sCMOS kamera til overvågning af partikel
      1. Installere en sCMOS kamera for at visualisere partikler, mens de spores. Installere sCMOS kun efter alle komponenterne af tracking system er blevet installeret og optimeret.
    Indlæse en fast fluorescerende partikel prøve på mikroskopet og køre programmet tracking til at låse én partikel i den objektive fokale volumen. Installer derefter 100 mm brændvidde linse (figur 1: L8) og sCMOS. Justere sCMOS position, så billedet af partiklen er fokuseret på den mindste og mest idérige spot.

    4. real-time 3D inddeling af frit spreder nanopartikler

    1. Læg 110 nm gratis flytte partikel prøve på mikroskopet.
    2. Aktivere laser, mikro-positioner controller, piezo nanopositioner controller, TAG linse controller og EOD controller. Køre piezo nanopositioner i open loop. Indstille TAG linse software Ifølge trin 3.2.
    3. Åbne og køre tracking software (kan bestilles fra forfatterne). Indstil position estimering parametre til deres optimeret værdier, som blev fundet i afsnit 3.
    4. For at placere coverslip i fokus for objektive, fjerne filteret fluorescens emission og bruge afspejling af laser fra coverslip til at maksimere signal intensiteten som en funktion af micropositioner Z stilling. Efter at finde coverslip, øge fokus position 15 µm til at fokusere laseren fra coverslip og ind i løsningen. Sted tilbage fluorescens emission filter.
    5. Indstille integreret kontrol konstanter. Integreret kontrol konstanter kan indstilles, startende fra en lav værdi og langsomt stigende indtil svingninger kan ses i den partikel holdning udlæsninger. Når svingninger overholdes, skal du indstille integreret kontrol konstanter til 80% af den værdi, der forårsager svingningerne. Typiske værdier vil være omkring 0,012 XY integreret gevinst og 0,004 for Z "integreret gevinst".
    6. Angive sporing tærskler i 'Track Threshold' og 'Track Minimum' og starte sporing eksperiment ved at klikke på 'Søg' og 'Auto Track'. Tærsklen for terminering tracking ligger lidt højere end baggrundsniveauet og tærsklen for udløsning af tracking er omkring to gange højere end baggrunden. Her, tærsklen for udløsning af tracking er 3 kHz og tærsklen for slutter bane er 1.5 kHz.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Fast partikel scanning (figur 4) og frit sprede 110 nm fluorescerende partikel tracking (figur 5) blev udført efter den ovennævnte protokol. Partikel scanning blev udført ved at flytte de piezoelektriske nanopositioner og bin fotoner, mens samtidig beregner partiklen anslået position på hvert punkt i scanningen. Scanning billedet viser en square selv intensitet (figur 4a) og de anslåede positioner viser en lineær sammenhæng med den partikel virkelige stilling over et 1 × 1 × 2 µm interval i x, y og z retning (figur 4b-f).

    For at vise real-time tracking, blev 110 nm fluorescerende partikler sporet i vand af 3D-DyPLoT (figur 5a, b). Middelværdi deplacement (MSD) analyse viser en typisk lineær adfærd karakteristisk for Brownske bevægelser (figur 5 c). MSD analyse af 30 baner viste en gennemsnitlig hydrodynamiske diameter på 110 nm, i god aftale med fabrikanter specifikation for størrelsen af de fluorescerende nanopartikler spores (fig. 5 d). Derudover Movie 1 viser real-time piezoelektriske nanopositioner readouts og synkroniseret sCMOS billeder til en 2 min lange bane af et frit sprede 110 nm fluorescerende partikel.

    Ud over at kunne spore med høj hastighed, kan være lokaliseret langsom bevægelse partikler med høj præcision. Figur 6a - d viser anvendelsen af 3D-DyPLoT system til faste partikler ved hjælp af de samme feedback parametre som brugte for høj hastighed sporing, viser en præcision på 17,6, 26.4 og 53,4 nm i X, Y og Z, henholdsvis med foton count sats af 105. Figur 6e - h viser præcision under feedback kontrol reduceret med en faktor 10, effektivt bytte hastighed for præcision og udstiller en præcision på 6.5, 8.3 og 10.5 nm i X, Y og Z, henholdsvis.

    Figure 1
    Figur 1. Skematisk af 3D sporingssystem. 2D-EOD (EOD1 & EOD2) og TAG linse (TAG) aflede laser langs XY og Z retninger, henholdsvis. APD (APD) bruges til at indsamle fluorescens fotoner, som sendes til FPGA (FPGA). FPGA bruges til position beregning algoritme, foton optælling, kontrol af 2D-EOD samt kontrol og udlæsning af piezoelektriske nanopositioner (NSxy og gled). Andre komponenter, der er markeret i figur: spejle (M); linser (L #); pinhole (PH); Glan-Thompson polarisator (GP); halvt-bølge plade (W1); dichroic filter (DC); mål linse (OL, 100 X NA = 1,49); Fluorescens emission filter (F); Beam splitter (BS); XY micropositioner fase (MSxy); Z micropositioner fase (MSz). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 2
    Figur 2. Koordinater for ridderens tour implementeret i 3D-DyPLoT. Akse 1 og akse 2 skal justeres langs X- eller Y-aksen af korrekt justering af 2D-EOD. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3. TAG linse Softwareindstill. Se afsnit 4.2 TAG linse indstillinger for flere oplysninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 4
    Figur 4. Partikel scanning og position estimering. (a) Scanning billede af 190 nm fluorescerende perler med 2D-EOD kørsel laser i et 1 × 1 µm square ridderens tour mønster. Fluorescens intensitet er angivet ved farve. Enhed: kHz. (b) vurdering af xk, partikels placering i forhold til centrum af 2D-EOD Skan i mikrometer. Farve i b, cog d betegner den anslåede holdning. Enhed: µm. (c) vurdering af yk i mikrometer. (d) skøn over zk, partikels placering i forhold til aksial centrum af TAG linsen Skan i mikrometer. (e) anslået partikel holdning yk som funktion af stadiet position i gennemsnit over hele nettet fra (c). Bemærk, at den anslåede partikel holdning erhvervet fra position estimering algoritme (yk) enig i den rigtige position. (f) anslået partikel holdning zk som funktion af stadiet position i gennemsnit over hele nettet fra (d). Den anslåede holdning viser en lineær sammenhæng med partikels virkelige stilling over 1 × 1 × 2 µm interval i X, Y og Z retning. Bemærk, at den anslåede partikel holdning erhvervet fra position estimering algoritme (zk) enig i den rigtige position. Den anslåede holdning viser en lineær sammenhæng med partikels virkelige stilling over et 1 × 1 × 2 µm interval i X, Y, og Z-retning. Den hvide skala barer i (en-c) repræsenterer 500 nm og sort skalalinjen i (d) repræsenterer 2 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 5
    Figur 5.Sporing 110 nm fluorescerende partikler i vandet med 3D-DyPLOT. (en) 3D bane af et frit sprede 110 nm fluorescerende nanopartikel i vand. (b) fluorescerende intensitet som en funktion af tid for bane i (et). (c) MSD bane i (et). Den blå linje er den målte MSD, mens den stiplede røde linje er bedste pasform linje fra lineær regression. (d) MSD analyse af 30 baner, viser en gennemsnitlig hydrodynamiske diameter på 110 nm, i god aftale med størrelsen af den fluorescerende nanopartikler spores. Diameteren af partiklerne blev beregnet ved hjælp af relationen Stokes-Einstein. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 6
    Figur 6. Præcision af fast partikel sporing. (en) A fast partikel er sporet af 3D-DyPLoT til forskellige antal priser. Præcisionen er (b) 17,6 nm i X, (c) 26.4 nm i Y, og (d) 53,4 nm i Z med en emission hastighed på 100 kHz. (e) når sondering langsommere processer, feedback kontrol konstant (Kjeg) kan blive reduceret med en faktor på 10 for at øge præcisionen. Under denne reduceret feedback kontrol er præcisionen (f) 6.5 nm i X og (g) 8.3 nm i Y (h) 10.5 nm i Z med en emission hastighed på 100 kHz. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur S1. Venligst klik her for at downloade denne fil.

    Figur S2. Venligst klik her for at downloade denne fil.

    Figur S3. Venligst klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende oplysninger. Venligst klik her for at downloade denne fil.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Selv om mange sorter af 3D enkelt partikel sporingsmetoder er dukket op i de seneste år, er robust real-time tracking af høj hastighed 3D diffusion til lav foton count priser med en simpel opsætning stadig en udfordring, hvilket begrænser dets anvendelse til vigtige biologiske problemer. 3D-DyPLoT metode beskrevet i denne protokoladresser disse udfordringer på flere måder. Først, excitation og påvisning veje forenkles betydeligt i forhold til andre implementeringer gør justering, enkel og robust. For det andet, den bevægelige laser spot og position estimering algoritme give nøjagtige position skøn for feedback loop, at gøre feedbacken mere stabil. For det tredje er det effektivt store registreringsområde (1 x 1 x 4 µm) af dynamisk bevægelse laser stedet giver mulighed for sporing af hurtigt bevægende partikler. For at se, hvorfor denne store bevægelsesdetektering område er kritisk, er det vigtigt at overveje den piezoelektriske nanopositioner iboende responstid. Høj hastighed piezoelektriske faser har resonanser størrelsesordenen 1 kHz, begrænse responstid være størrelsesordenen 1 ms. i 1 ms, en 100 nm nanopartikel med diffusion koefficienten 4 µm2/s, vil diffuse på gennemsnitlig 90 nm fra midten af diffraktion-li mited påvisning volumen. Dette er kun den gennemsnitlige forskydning og ægte tilfældige bevægelse vil udstille trin meget større end dette fører til partikel forlader den fokale volumen og slutter den aktuelle bane. Situationen er endnu værre for mindre partikler, hvor stadig større termisk diffuserende trin fører til tab af sporing. Effektivt store bevægelsesdetektering område giver mulighed for tracking-system til at overvinde iboende piezoelektriske fase lag og inddrive fra store diffuserende hopper i positionen partikel stigende sporingsmekanismen samlede robusthed. Endelig, det store scanningsområdet, kan nemt hente nye partikler, giver mulighed for på hinanden følgende baner skal erhverves hurtigt og store datasæt kompileret.

    Brugeren bør holde for øje, at der er nogle afgørende skridt. Første justering af både 2D-EOD og TAG linsen er kritisk. Begge skal være godt afstemt for at opnå optimal præcision. For det andet de parametre, der bruges i position estimering i fast partikel scanning trin skal være godt kalibreret (Se figur 4). Den anslåede partikel holdning bør matche partikel position svarer til midten af rækken laser scanning. Endelig bør feedback integreret konstanterne (Kjeg) være tunet omhyggeligt, starter med en lille værdi og derefter ramping indtil svingninger overholdes, så opbakning fra omkring 80% af denne værdi.

    Der er et par forbehold om 3D-DyPLoT til at huske alt efter det ønskede program. Mens optimeret position estimering er designet til brug med Brownske bevægelser, er det også velegnet til retningsbestemt bevægelse. Algoritmen kan anvendes direkte til enhver form for motion, da det er kun den holdning usikkerhed, der antages for at være Gaussisk, ikke den virkelige partikel holdning. I tilfælde hvor der forventes vedvarende lineær bevægelse, en yderligere sigt kan føjes til forudsigelse udtrykket i position estimering algoritme (Se ligning 3 i Supplerende oplysninger).

    Udvælgelsen af parametre for 2D-EOD og TAG bør overvejes nøje, når du opretter 3D-DyPLoT. Særlig vigtigt er den bin tid brugt til ridderens tour scannet af 2D-EOD. I en ideel scenario, ville ridderens tour synkroniseres til perioden af TAG linsen til at sikre effektiv prøveudtagning. Men det er kritisk at overveje responstiden for 2D-EOD at træde ændringer i spænding. For den enhed, der anvendes her, er der en 2-3 µs responstid efter spændingen er anvendt før den ønskede sted er nået. På 20 µs bin tid er dette omkring 10-15% af afhentningstidspunkt. At reducere tid, således at det matcher TAG linse periode af ~ 14 µs øger brøkdel af den bin tid, som er den mellemliggende tid på 2D-EOD. Dette fører til forkerte værdier af laser position og forkert position skøn.

    En anden faktor for eksperimentatoren at huske er tidsmæssige opløsning. Mens der indsamles data vist her på en 100 kHz datahastighed, er den ultimative tidsmæssige opløsning defineret i sidste ende som data bruges til position måling. Hvis udlæsning af nanopositioner bruges som partikel position (figur 6), vil den tidsmæssige opløsning afhænge af værdien af konstanten integreret kontrol. For eksempel, for integreret bekæmpelse vist i figur 6a-d, fase reaktion er på rækkefølgen 1 ms, mens for figur 6e-h, det er på rækkefølgen af 10 ms. evt hurtigere tidsmæssige opløsning, så de photon af photon resultatet af position estimering algoritme vil korrelerer med foton count sats. For eksempel, en 10 kHz emission sats giver 100 µs tidsmæssige opløsning og en 100 kHz emission sats giver en 10 µs tidsmæssige opløsning. Derudover siden præcision følger en Equation 2 forholdet41, den rumlige og tidsmæssige præcision er kombineret. Som et resultat, bestemmer lysstyrken af sonden både den rumlige og tidsmæssige præcision.

    I denne protokol beskrevne vi opsætning, layout og justering af en høj hastighed real-time 3D enkelt partikel sporing metode, som benytter et 2D-EOD og TAG linse til dynamisk flytte en fokuseret laser spot til at opnå hurtig partikel position estimering. Vi beskrev derefter prøve forberedelse og parameter optimering metoder. 3D-DyPLoT giver en robust og relativt enkel metode at lock-on til hurtig bevægelse og kærlig udsender diffuserende partikler. Det enkle optiske layout gør det muligt at nemt tilføjes på side-port af enhver eksisterende mikroskopholderen således at det kan kombineres med billedbehandling moduler. Med denne protokol håber vi, at RT-3D-SPT kan være mere bredt implementeret af flere efterforskere at løse hurtigt, tre-dimensionelle biologiske processer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgments

    Dette arbejde blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under award nummer R35GM124868 og ved Duke University.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    2D Electro-optic Deflector  ConOptics M310A 2 required
    Power supply for EOD ConOptics 412 Converts FPGA ouput to high voltage for EOD
    TAG  Lens TAG Optics TAG 2.0 Used to deflect laser along axial direction
    XY piezoelectric nanopositioner MadCity Labs Nano-PDQ275HS Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in 
    Z piezoelectric nanoposiitoner MadCity Labs Nano-OP65HS Used to move the objective lens to follow the diffusing particle
    Micropositioner MadCity Labs MicroDrive Used to coarsely position sample and evaluate
    Objective Lens Zeiss PlanApo High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
    sCMOS camera PCO pco.edge 4.2 Used to monitor the particle's position
    APD Excelitas SPCM-ARQH-15 Lower dark counts beneficial
    Field programmable gate array National Instruments NI-7852r
    Software National Instruments LabVIEW
    Tracking excitation laser JDSU FCD488-30
    Lens ThorLabs AC254-150-A-ML L1
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L2
    Pinhole ThorLabs P75S PH
    Glan-Thompson Polarizer ThorLabs GTH5-A GT
    Half-wave plate ThorLabs WPH05M-488 WP
    Lens ThorLabs AC254-75-A-ML L3
    Lens ThorLabs AC254-250-A-ML L4
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L5
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L6
    Dichroic Mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc DC
    Fluorescence Emission Filter Chroma D535/40m F
    10/90 beamsplitter Chroma 21012 BS
    PBS Sigma D8537
    190 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/9942
    110 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/10617
    Coverslip Fisher Scientific 12-545A
    Powermeter Thorlabs PM100D
    CMOS Thorlabs DCC1545M
    Iris Thorlabs SM1D12D
    Microscope Mad City Labs RM21

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
    2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
    3. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
    4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
    5. Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
    6. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
    7. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).
    8. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).
    9. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).
    10. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
    11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
    12. Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
    13. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
    14. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
    15. Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
    16. Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).
    17. Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
    18. Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
    19. Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).
    20. Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
    21. Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
    22. Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
    23. McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
    24. McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
    25. McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
    26. Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
    27. Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
    28. Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
    29. Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
    30. Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
    31. Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
    32. Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).
    33. Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
    34. Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
    35. Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606 (2017).
    36. Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
    37. Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
    38. Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
    39. Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
    40. Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
    41. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).

    Tags

    Bioteknologi sag 131 enkelt partikel tracking Optisk mikroskopi fluorescens Billeddannende systemer optisk fælder optik 3D tracking real-time partikel tracking
    En protokol til Real-time 3D enkelt partikel Tracking
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hou, S., Welsher, K. A Protocol for… More

    Hou, S., Welsher, K. A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking. J. Vis. Exp. (131), e56711, doi:10.3791/56711 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter