Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Протокол для слежения в реальном времени 3D одной частицы

Published: January 3, 2018 doi: 10.3791/56711
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Duke University

Summary

Этот протокол детали, строительства и эксплуатации микроскопом отслеживания в реальном времени 3D одной частицы, способных отслеживания наноразмерных флуоресцентных зондов на высоких скоростях диффузионные и низкой Фотон количество ставок.

Abstract

Реальном времени трехмерных одной частицы, отслеживание (RT-3D-SPT) имеет потенциал, чтобы пролить свет на быстрый, 3D процессы в клеточных системах. Хотя различные методы RT-3D-ДПМ были выдвинуты в последние годы, отслеживание высокой скорости 3D диффундирующих частиц при низкой Фотон количество ставок остается проблемой. Кроме того RT-3D-SPT установках, как правило, сложной и трудно осуществить, ограничивая их широкое применение в биологических проблем. Этот протокол представляет собой систему RT-3D-SPT, названный 3D динамических Фотон локализации слежения (3D-DyPLoT), который может отслеживать частиц с высоким диффузионными скорость (до 20 мкм2/s) скоростью всего низкой Фотон (до 10 кГц). 3D-DyPLoT использует 2D дефлектора Электро Оптика (2D-ПС) и перестраиваемый акустическая градиента (TAG) объектив ехать один сосредоточены лазерного пятно динамически в 3D. В сочетании с оптимизированной позиции алгоритм оценки, можно заблокировать 3D-DyPLoT на одной частицы с высокой скорость и точность высокая локализация. Благодаря одной возбуждения и одного обнаружения пути макет 3D-DyPLoT, надежные и легко установить. Этот протокол описывает, как построить 3D-DyPLoT шаг за шагом. Во-первых оптических макет описывается. Далее система калибруется и оптимизированные растровых сканирование 190 Нм флуоресцентные бисера с пьезоэлектрический nanopositioner. Наконец для демонстрации в реальном времени 3D отслеживания способности, 110 Нм флуоресцентные бусины отслеживаются в воде.

Introduction

Появление передовые методы обработки изображений открыл окно, чтобы увидеть более подробную структуру клеточных явлений, все, вплоть до молекулярном уровне. Методы, такие как стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм)1,2,3, Фото активированный локализации микроскопии (PALM)4,5,6,7 , структурированные освещения микроскопии (SIM)8,9,10,11и стимулировали выбросов истощения микроскопии (интереса)12,13, 14 далеко вышли за рамки дифракционный предел доставлять беспрецедентным деталь в структуру и функции живых клеток. Однако полное понимание, каким образом эти системы ведут себя требует динамическую информацию, а также структурную информацию. Перечисленные выше методы суперразрешением включают компромисс между пространственным разрешением и временное разрешение, ограничивая временная точность, с которой может быть исследован динамических процессов. Метод, который обеспечивает высокоточное пространственное и временное разрешение является RT-3D-SPT15,16,,1718,19,20, 21,,2223,24,25,26,27,,2829. Здесь, мы провести различие между традиционными 3D-SPT30 и RT-3D-мсете традиционное 3D-SPT просто требует временных рядов данных трехмерного изображения (которое может быть приобретено либо с помощью Конфокальный микроскоп или помощью эпифлуоресцентного микроскопа учитывая правильную конфигурацию). В традиционных 3D-SPT координаты частицы определяются после сбора данных путем нахождения частицы в каждом стека изображений и сцеплением места в последующих томах для создания траектории. Для этих методов конечная временное разрешение определяется уровень объемных изображений. Конфокальные микроскопы это легко на шкале секунд до десятков секунд. Для эпифлуоресцентного методов, в котором оптического пути управляется так, что можно извлечь сведения о расположении осевая, временное разрешение ограничено время экспозиции или индикация камеры. Эти методы epifluorescent ограничены в диапазоне, над которой осевой информация может собираться, хотя недавний прогресс в фазе плоскости Фурье маски дизайн и адаптивной оптики расширяет эти диапазоны 10 мкм или более31,32 , 33 , 34.

В отличие от RT-3D-ДПМ не полагаться на получения стека 3D изображений и частиц после факта. Вместо этого в реальном времени местоположение информация извлекается через одну точку детекторы и обратной связи применяется к эффективно «блокировка» частицы в фокуса тома объектива с помощью высокоскоростных пьезоэлектрический стадии. Это позволяет непрерывное измерение частиц позиции ограничены только, сколько фотонов может быть собрана. Кроме того этот метод позволяет спектральных допроса частицы, как она движется на больших расстояниях. RT-3D-ДПМ в силу работ сродни усили свободно оптические ловушки для наноразмерных объектов, которой частицы непрерывно исследован и измеряется в режиме реального времени без необходимости для больших лазерных держав или оптическим сил. Учитывая, что RT-3D-SPT предоставляет средства для непрерывного допроса быстро диффузионное объектов (до 20 мкм2/s) в трех измерениях на низкой Фотон фото цены20,29,25,29 35, он должен обеспечить окно в быстрый или переходные биологические процессы внутриклеточной грузовой транспорт, Связывание лиганда рецепторов и внеклеточного динамику одного вирионы. Однако к этой точке, применение RT-3D-SPT была ограничена горсть групп, работающих для продвижения этой технологии.

Один барьер является сложность оптических макет требует RT-3D-SPT методами, которые разнообразны. Для большинства методов оптической обратной связи обеспечивается пьезоэлектрический стадии. Как делает небольшие движения частицы в X, Y, или Z, индикацию от одной точки детекторы преобразуются в ошибки функции и кормили на высокоскоростной пьезоэлектрический nanopositioner, который в свою очередь, перемещает образец эффективно противодействовать движения частиц, Блокировка на месте относительно объектива. Для измерения малых позиционные движений в X, Y и Z, несколько детекторов (4 или 5 в зависимости от реализации)15,18,21 или несколько пятен возбуждения (2-4, ниже которого может применяться, если блокировки в усилитель используется для извлечения X и Y позиции с помощью вращающейся лазерного пятна)25,28 применяются. Дублирование этих несколько точек обнаружения и выбросов делают системы трудно согласовать и поддерживать.

Здесь мы представляем высокоскоростной 3D-SPT, к морю целевого метода с упрощенной оптического дизайна под названием 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT использует 2D-ПС и тег объектив36,,3738 для динамического перемещения пятно сфокусированного лазерного через объективные фокуса тома на высокой скорости (50 кГц XY, 70 кГц Z). Сочетая лазерный фокус позиции и время прибытия Фотон позволяет 3D позиция частицы необходимо быстро получить даже при низкой Фотон количество ставок. 2D-EOD диски лазерный фокус в Рыцарский тур шаблон39 квадратных размером 1 x 1 мкм в плоскости X-Y и тег объектив лазерный фокус перемещается в осевом направлении с кругом 2-4 мкм. Позиция 3D частицы получается с оптимизированной позиции оценки алгоритм29,40 в 3D. Контроль за 3D динамически движущихся лазерного пятна, фотон считая от лавинный фотодиод (APD), расчет позиции реального времени частицы, пьезоэлектрический стадии обратной связи и записи данных выполняются на массив поля программируемый Гейт (FPGA).В этом протоколе мы описывают как построить микроскопом 3D-DyPLoT, шаг за шагом, включая оптическое выравнивание, калибровка с фиксированной частиц и наконец свободной частицы отслеживания. В качестве демонстрации 110 Нм флуоресцентные бусины были отслежены непрерывно в воде минут за один раз.

Метод, описанный здесь является идеальным выбором для любого приложения, где желательно постоянно следить за быстро движущихся флуоресцентного зонда в низкой освещенности, включая вирусы, наночастиц и везикулы, например endosomes. В отличие от предыдущих методов есть только один возбуждения и одного обнаружения пути, делая простой выравнивание и техническое обслуживание. Кроме того большой обнаружения области позволяет этот Микроскоп легко забрать быстро диффундирующих частиц, в то время как способность отслеживать сигнал низкого уровня (до 10 кГц) делает этот метод идеально подходит для низкой освещенности приложений29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Установка расположение и выравнивание

  1. Установка и коллимации отслеживания возбуждения лазер
    1. Прикрепите лазер в оптических таблицу с использованием горе построен дом. Гора является простой алюминиевой пластине с монтажными отверстиями для лазерной головкой и таблицы оптики. Лазер должны прочно прикреплены к Металлический байонет для стабильности и отвод тепла. Для этой работы используйте 488 нм твердотельный лазер для освещения (рис. 1), хотя волны могут быть выбраны с учетом конкретных Флюорофор или эксперимента. Критическим фактором является длина волны лазера подходят 2D-EOD Рабочий диапазон, который определяется прежде всего волны пластины между двумя дефлекторы (рис. 1: W2). 488 нм лазер может эффективно возбуждают зеленый или желтый флуоресцентный белок (GFP/рекламы ЯФП), которые являются общей флуоресцентные метки в живых клеток экспериментов.
    2. Отрегулируйте высоту лазерного луча и направление, используя пару диэлектрические зеркала (рис. 1: M). Убедитесь в том, что лазерный луч параллельно таблицы оптики и адаптировать его к подходящей высоты.
      Примечание: Высота должна выбираться на основе платформы микроскопа. Эта высота следует сохранить для всех последующих зеркала, используемые в настоящем Протоколе, хотя он не будет явно указано.
    3. Collimate луч с парой линз (рис. 1: L1 и L2). Фокусные расстояния объективов следует тщательно подобраны, чтобы избежать пятно лазера, отсекаются им диафрагмы 2D-ПС. Отсечение очевидным изменением в лазерный луч форму после прохождения через 2D-ПС. Качество коллимации здесь очень важно, потому что аберраций будут усилены последующих линзы и любые расхождения будут ухудшаться производительность 2D-EOD прогиб. В идеале collimate луча, сосредоточив внимание луч к точке по меньшей мере в 20 м от отеля.
  2. Место обскуры (рис. 1: PH) соответствующего размера в фокусе первый объектив коллимации (рис. 1: L1).
    1. Выбор подходящего размера обскуры. Пинхол размер может быть выбран на основании следующих вычислений:
      Equation 1
      Где λ — длина волны лазера, f — Фокусное расстояние первый объектив, и D -Диаметр входного пучка.
    2. Смонтировать обскуры на сцене 3D перевод, так что он может быть помещен точно в центре внимания первого коллимации объектива.
    3. Отрегулируйте положение обскуры. Установите лазерный измеритель мощности после обскуры и отрегулировать положение обскуры в XYZ для максимизации мощности метр считывания. Если наблюдается дифракция кольцо, заблокировать его с iris перед 2D-ПС.
  3. Установка поляризатор Глана-Томпсона
    1. Положите поляризатор Глана-Томпсона (рис. 1: GP) после второй объектив коллимации (рис. 1: L2) очистить поляризации лазерного луча. Вращайте поляризатор чтобы найти максимальную передачу с измеритель мощности.
  4. Установка ЕСПЗ
    1. Используйте 2 ЕСПЗ (рис. 1: EOD1 & EOD2) для того чтобы отклонить лазера в направлениях X и Y. Максимизируйте лазерной передачи, регулируя рыскания, шаг и высота каждого ОВБ.
    2. Совместите два ЕСПЗ отношению друг к другу, используя маркер выравнивания, предоставленный производителем на стороне каждого дефлектора.
    3. Применить шаблон тестовый контроллер 2D-ПС для проверки вывода EOD. Это может быть либо Тур рыцарский (рис. 2) через FPGA, описанные ниже, или простой синусоиды, предоставляемый функции генератора. Для лучшей производительности отклонения от каждого дефлектора должно быть параллельно либо X, либо Y направлению пьезо nanopositioner. Это направление определяется направление угловые дефлекторы о передачи оси. Чтобы повернуть направление отклонения без перемещения 2D-EOD, место голубь Призма после 2D-EOD Выровнять оси поворотной осей nanopositioner пьезо.
  5. Установка Полуволновые пластинки
    1. Место Полуволновые пластины (рис. 1: W1) между поляризатор Глана-Томпсона (рис. 1: GP) и 2D-ПС для выравнивания входящие лазерный луч поляризации с поворотной оси 2D-ПС. Поместите долго фокусным (300 мм) после 2D-ПС и sCMOS камеры на лазерный фокус. Затем включите 2D-ПС для создания Тур рыцарский, описанных ниже (Рисунок 2). Поверните пластину Полуволновые равномерно квадратных лазерной распределения наблюдается на камеру.
  6. Установка балки, затратив объектив пара и пара реле объектива
    1. Место пару линз (рис. 1: L3 и L4) после 2D-EOD расширить луча для заполнения задней диафрагмы объектива (рис. 1: OL) и еще пару линз (Рисунок 1: L5 и L6) для Эстафета фокальной плоскости цели микроскопа. Убедитесь в том оставить достаточно места между этими двумя парами линзы, как тег объектив будет устанавливаться между ними на более позднем этапе.
  7. Установите Дихроичный фильтр, splitter луча 10/90, фокусировки объектива, РПО, объектива и флуоресценции выбросов фильтр для завершения обнаружения пути.
    1. Установите Дихроичный фильтр (рис. 1: DC) для отражения лазера сторону объектива. Выравнивание лазера, чтобы идти прямо через центр объектива, с помощью двух ирисов на верхней и нижней части трубки длинный объектив.
    2. Установите splitter луча 10/90 (рис. 1: BS), которых 10% света отражается для изображений камеры sCMOS (описано ниже) и 90% проходит через к РПО для отслеживания.
    3. Совместите РПО. Фокус лазера на coverslip от объектива. Используйте отражение от coverslip для выравнивания элементов всех вниз по течению, поставив coverslip в объективных фокус и проверки интенсивности индикация РПО. После splitter луча, установить APD фокусировки объектива (рис. 1: L7) следуют APD на сцене 3D перевода. Расположите объектив, таким образом, что лазерного отражения от цели идет через центр объектива.
APD позиции могут быть оптимизированы, регулируя положение в 3D для максимальной интенсивности лазерного отражения на coverslip. APD позиция находится в оптимальное положение, когда шаг детектор позиции в любом направлении уменьшается интенсивность.
  • Установить фильтр выбросов флуоресценции longpass (рис. 1: F) перед splitter луча для удаления отраженный и рассеянного света.
  • Установка объектива тег
    1. Поместите тег объектив между двумя парами линз (между Рисунок 1: L4 и L5) как упоминалось раньше и показано на рисунке 1. Отрегулируйте рыскания, шаг, высоту и боковое положение таким образом, что луч проходит перпендикулярно через объектив тегов центр.

    • 2. Пробоподготовка.

    1. Подготовка основных частиц
      1. Разбавить 190 Нм флуоресцентные бусины в ~ 5 × 108 шариков/мл в PBS. Добавить 400 мкл бусины раствор на coverslip и горе на держателя образца пьезоэлектрический этапа (объем бусины будет зависеть от держателя образца; диаметр камеры держатель образца, используемый здесь составляет 18 мм). Для бусины, используемый здесь PBS вызывает частиц для депозита на coverslip.
    2. Бесплатная подготовка движущихся частиц
      1. Разбавить 110 Нм флуоресцентные бусины в ~ 5 × 108 шариков/мл ди водой. Добавить 400 мкл бусины раствор на coverslip и смонтируйте на держателя образца пьезоэлектрический этапа.

    3. оптимизировать параметры отслеживания

    1. Сканирования растровых фиксированной частиц
      1. Поместите образец фиксированной частиц на микроскопе.
      2. Включите лазер, micropositioner контроллер, пьезо nanopositioner контроллер, тег объектив контроллер и контроллер EOD. Обратите внимание, что порядок не является критическим. Запустите nanopositioner пьезо в замкнутом цикле.
      3. Растровые сканирования образца в XYZ, с помощью настраиваемого сканирования программы (Рисунок S3, программное обеспечение, по запросу от авторов), которая управляет 2D-ПС в Тур рыцарский (рис. 2), собирает показания счетчиков из РПО, диски пьезо nanopositioner и выполняет расчет позиции (Рисунок S2). Размер шага составляет 40 Нм и диапазон сканирования составляет 2 мкм.
        1. Поставить coverslip в центре внимания цели, удалите фильтр выбросов флуоресценции и использовать отражение лазера от coverslip для максимальной интенсивности сигнала в зависимости от позиции Z micropositioner. После размещения образца в фокальной плоскости, поместите обратно фильтр выбросов флуоресценции.
        2. Откройте программу сканирования. Установите диапазон сканирования и размер шага, введя число в «Пуск», «готово» и «шаг». Сначала установите большой диапазон сканирования и размер шага для обнаружения частиц (например, 10 x 10 мкм диапазона с размер шага 200 Нм). После нахождения частицы, уменьшить диапазон сканирования и уменьшить размер шага (например, 2 x 2 мкм диапазона с 100 размер шага Нм). Нажмите кнопку «scan» для выполнения сканирования 3D растровых найти флуоресцентные фокус.
    2. Параметры тегов объектива (см. также рис. 3)
      1. Нажмите на тег объектив контроля программного обеспечения. Нажмите кнопку «connect», «власть на» последовательно.
      2. Чтобы изменить этапа вывода сигналов триггер, необходимо изменить триггер режим вывода. Сначала измените режим от «RGB», «Многоплановые» и затем изменить его обратно. Теперь этапа может быть изменен (рис. 3b).
      3. Задайте выходной фазы 0 °, 90 °, и 270 °. Хотя может быть использован любой три фазы, которые охватывают фазового пространства, эти три находятся работать хорошо эмпирически (рис. 3 c).
      4. Выберите параметр частоты 68500 Гц.
      5. Чтобы найти оптимальная частота часто бывает необходимо изменить частотный диапазон поиска. Нажмите кнопку «Дополнительно», «настройки». Изменить ' Макс. FREQ(Hz)' столбца 0 от 70 000 Гц до 71,500 Гц. Это может быть изменено в любой частотный диапазон подходит. Нажмите «Сохранить калибровки», «выход калибровки» (рис. 3d).
      6. Чтобы сделать новую калибровку эффективным, переключитесь на другую частоту (например, 189,150 Гц) резонанс и затем перешел обратно на настройки частоты 68500 Гц (Рисунок 3e).
      7. Постепенно измените амплитуды на 35%. Нажмите кнопку «Блокировка резонанс». После того, как частота заблокирован, нажмите кнопку «Разблокировать резонанс» (Рисунок 3e). Объектив тегов готов к использованию в настоящее время.
      8. Для калибровки, изменять параметры, которые используются для оценки сделать ожидаемое положение равным реальное положение, как показано на рисунке 4e, f. входной диапазон сканирования из x, y, и z, а затем нажмите кнопку «Просмотр» кнопку для сканирования образца в XYZ для перемещения частиц через движущихся пятно лазера. Позиция частицы как сканируется через лазерный фокус должен согласен с позицией оценкам частиц, определяется позиция цикла оценки (Рисунок S1). Отношения между ожидаемое положение и реальное положение (рис. 4 d) могут быть извлечены из ожидаемое положение изображения (Рисунок 4f). Если позиции не согласны, отрегулируйте значения положения лазер (ck) используется в цикле оценки позиции (Рисунок S1).
      9. Совместите тег объектив
        1. Когда тег объектив контроллер выключен, растр отсканированные изображения частиц (описанные ниже) перед установкой тег объектив и после установки тегов объектив должен выглядеть одинаково. Далее выполните флуоресцентные частицы Z стека, сканирование, перемещая цель с z nanopositioner для настройки позиция и угол объектива TAG (рис. 4). Настройте положение ТЕГА объектива до тех пор, пока существует без дрейфа частиц изображения в плоскости XY вдоль оси Z, которая достигается тогда, когда нет никаких изменений в позиции XY частицы в зависимости от позиции Z (рис. 4 d). Система отслеживания готов к использованию после выравнивания тег объектива.
    3. Установка sCMOS камеры для мониторинга частиц
      1. Установите sCMOS камеру для визуализации частиц, в то время как они отслеживаются. Установите sCMOS, только после того, как установлены все компоненты системы слежения и оптимизированы.
    Загрузить образец фиксированной флуоресцентные частицы на Микроскоп и запустите программу отслеживания для блокировки одной частицы в объективных фокуса тома. Затем, установите объектив фокусное расстояние 100 мм (рис. 1: L8) и sCMOS. Отрегулируйте положение sCMOS, так что изображение частицы фокусируется на маленький и яркий место.

    4. в реальном времени 3D отслеживания свободно диффундирующих наночастиц

    1. Положите 110 Нм бесплатно перемещение частиц образца на микроскопе.
    2. Включите лазер, микро позиционер контроллера, пьезо nanopositioner контроллер, тег объектив контроллера и EOD контроллер. Запустите nanopositioner пьезо в открытом цикле. Установите программное обеспечение объектив тег согласно шаг 3.2.
    3. Открыть и запустить программное обеспечение отслеживания (доступно по запросу от авторов). Задайте положение параметров оценки их оптимизированные значения, которые были найдены в разделе 3.
    4. Поставить coverslip в центре внимания цели, удалите фильтр выбросов флуоресценции и использовать отражение лазера от coverslip для максимальной интенсивности сигнала в зависимости от позиции Z micropositioner. После нахождения coverslip, увеличьте фокус позиция 15 мкм лазера от coverslip и в решение сосредоточиться. Поместите обратно фильтр выбросов флуоресценции.
    5. Задайте константы составной элемент управления. Можно задать константы составной элемент управления, начиная с низкой стоимостью и постепенно увеличивается до тех пор, пока колебания можно увидеть в индикацию позиция частицы. После того, как колебания наблюдаются, задайте константы составной элемент управления для 80% от стоимости, вызывая колебания. Типичные значения будет около 0,012 корыстной XY «неотъемлемой» и 0,004 для Z «составной выгоды».
    6. Установить пороговые значения отслеживания в «Трек порог» и «Минимум трек» и начать отслеживание эксперимент, нажав кнопку «Поиск» и «Авто трек». Порог для прекращения отслеживания устанавливается несколько выше, чем уровень фона и порог срабатывания отслеживания примерно в два раза выше, чем фон. Здесь порог срабатывания отслеживания 3 кГц и порог для прекращения траектории составляет 1,5 кГц.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Фиксированной частиц, сканирование (Рисунок 4) и свободно диффундирующих 110 Нм флуоресцентные частицы отслеживания (рис. 5) были проведены после выше протокол. Частица сканирования была выполнена путем перемещения пьезоэлектрический nanopositioner и Бен фотоны, хотя одновременно расчета частиц оценивается положение в каждой точке сканирования. Сканирования изображение показывает квадрат даже интенсивности (рис. 4a) и оценкам позиции Показать линейную связь с реальной позиции частиц в диапазоне 1 × 1 × 2 мкм в x, y и z направлении (рис. 4В–f).

    Чтобы продемонстрировать слежение в реальном времени, 110 Нм флуоресцентные частицы были отслежены в воде, 3D-DyPLoT (Рисунок 5a, b). Среднеквадратическая перемещения (MSD) анализ показывает типичный линейное поведение характерные броуновского движения (рис. 5 c). MSD анализ 30 траекторий показал средний гидродинамических диаметр 110 Нм, в хорошем согласии с производителей спецификации для размера флуоресцентные наночастиц отслеживается (рис. 5 d). Кроме того фильм 1 показывает в реальном времени пьезоэлектрический nanopositioner индикацию и синхронизированы sCMOS изображений для 2 мин долго траектории свободно диффундирующих 110 Нм флуоресцентные частицы.

    Помимо того, что возможность отслеживать с высокой скоростью, медленно движущихся частиц могут быть локализованы с высокой точностью. Рисунок 6a - d показывает применение системы 3D-DyPLoT для фиксированной частицы, используя те же параметры обратной связи используется для высокой скорости слежения, показывая точность 17,6, 26,4 и 53,4 Нм в X, Y и Z, соответственно с скорости отсчётов фотонного 105. Рисунок 6e - h показывает точности под контролем обратной связи, сокращены на коэффициент 10, эффективно меняя скорость для точности и экспонирования точность 6.5, 8.3 и 10,5 Нм в X, Y и Z соответственно.

    Figure 1
    Рисунок 1. Схема системы отслеживания 3D. 2D-EOD (EOD1 & EOD2) и объектив тегов (TAG) отвлечь лазер вдоль направления XY и Z соответственно. APD (РПО) используется для сбора флуоресценции фотоны, которые отправляются в ПЛИС (FPGA). FPGA используется алгоритм вычисления позиции, фотон подсчета, контроль над 2D-ПС, а также управления и индикации пьезоэлектрический nanopositioner (NSxy и NZz). Другие компоненты помечены на рисунке: зеркала (М); линзы (L #); отверстие (PH); Поляризатор Глана-Томпсона (GP); Полуволновые плита (W1); Дихроичный фильтр (DC); объектив (OL, 100 X NA = 1,49); флуоресценции выбросов фильтр (F); splitter луча (BS); Ху этап micropositioner (MSxy); Z этап micropositioner (МСЗ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 2
    Рисунок 2. Координаты для Тур рыцарский выполнены в 3D-DyPLoT. 1 и 2 оси должны быть выровнены вдоль оси X или Y по надлежащему применению 2D-ПС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 3
    Рисунок 3. Программное обеспечение параметры тегов объектив. Смотрите раздел 4.2 тег объектив настройки для получения дополнительной информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 4
    Рисунок 4. Сканирование и позиции оценки частиц. (a) сканирование изображения 190 Нм люминесцентные бусины с 2D-EOD вождения лазер в 1 × 1 мкм квадратных Рыцарский тур шаблон. Интенсивность флуоресценции обозначается цветом. Единица: кГц. (b) Оценка xk, позиция частицы относительно центра 2D-EOD сканирования в микрометрах. Цвет в b, cи d обозначает предполагаемое положение. Единица измерения: мкм. (c) Оценкаk y в микрометрах. (d) Оценка zk, позиция частицы относительно осевой центр объектива ТЕГА сканирование в микрометрах. (e) Ориентировочная частиц позиция yk в зависимости от стадии позиции усредненное по всей сетки (c). Обратите внимание, что позиции оценкам частицы, полученные от алгоритма оценки позиции (y-k) соглашается с реальной позиции. (f) Ориентировочная частиц позиции zk в зависимости от стадии позиции усреднены за всю сетку из (d). Ожидаемое положение показывает линейную связь с реальной позиции частицы в диапазоне 1 × 1 × 2 мкм в направлении X, Y и Z. Обратите внимание, что позиции оценкам частицы, полученные от алгоритма оценки позиции (zk) соглашается с реальной позиции. Ожидаемое положение показывает линейную связь с реальным позиция частицы в диапазоне 1 × 1 × 2 мкм в X, Y и Z-направлении. Белые шкалы баров в (–c) представляют собой 500 Нм и черная шкала бар в (d) представляет 2 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 5
    Рисунок 5.Отслеживание 110 Нм флуоресцентные частицы в воде с 3D-DyPLOT. () 3D траектории свободно диффундирующих 110 Нм флуоресцентные наночастиц в воде. (b) интенсивности флуоресценции как функцию от времени для траектории в (). (c) MSD траектории в (). Синяя линия то измеренная MSD пунктирная красная линия является лучшим подходят линии линейной регрессии. (d) MSD анализ 30 траекторий, показаны среднее гидродинамических диаметром 110 Нм, хорошо согласуется с размером флуоресцентные наночастиц отслеживается. Диаметр частиц была рассчитана с использованием отношения Стокса-Эйнштейна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 6
    Рисунок 6. Точность фиксированной частицы отслеживания. () A фиксированной частиц отслеживается 3D-DyPLoT темпами различных игр. Точность является Нм (b) 17,6 X, (c) 26.4 Нм в Y и (d) 53.4 Нм в Z по курсу выбросов 100 кГц. Константа (.e) когда зондирующего медленных процессов, управления обратной связи (Kя) может быть уменьшена фактор 10 для повышения точности. Под контролем этого снижения обратной связи точность является (f) 6,5 Нм в X, (g) 8.3 Нм в Y и (h) 10,5 Нм в Z по курсу выбросов 100 кГц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Рисунок S1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

    Рисунок S2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

    Рисунок S3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

    Дополнительная информация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Хотя в последние годы возникли много разновидностей 3D одной частицы, методы отслеживания, надежные слежение в реальном времени 3D высокая скорость диффузии ставкам всего низкой фотонов с простой установки по-прежнему вызов, который ограничивает его применение в отношении важных биологических проблемы. Метод 3D-DyPLoT описано в этот протокол адреса этих задач несколькими способами. Во-первых возбуждения и обнаружения пути упрощены, значительно по сравнению с другими реализациями, делая выравнивание, простой и надежный. Во-вторых движущихся лазерного пятна и алгоритм оценки положения обеспечивают точную позицию сметы для обратной, делая более стабильной обратной связи. В-третьих дальность обнаружения эффективно большой (1 x 1 x 4 мкм) динамически движущихся лазерного пятна позволяет для отслеживания быстро движущихся частиц. Чтобы увидеть, почему этот район большой обнаружения является критическим, важно учитывать время отклика встроенный Пьезоэлектрический nanopositioner. Высокая скорость пьезоэлектрический этапы имеют резонансы порядка 1 кГц, ограничивая время отклика порядка 1 г-жа в 1 мс, 100 Нм наночастиц с коэффициентом диффузии 4 мкм2/s, будет диффузный на среднем 90 Нм от центра дифракции li объем mited обнаружения. Это только среднее смещение и действительно случайные движения будет экспонат шаги гораздо больше, чем это, ведущие к частиц, оставляя фокуса тома и заканчивая нынешней траектории. Ситуация еще хуже для мелких частиц, где все большей тепловой диффузионного ступени ведут к потере отслеживания. Области эффективного большой обнаружения позволяет для системы отслеживания, чтобы преодолеть отставание встроенный Пьезоэлектрический стадии и оправиться от больших диффузионное прыжки в позиции частицы, повышение общей надежности механизма отслеживания. Наконец большая область позволяет системе легко подобрать новые частицы, позволяя подряд траектории быстро приобретается и больших наборов данных компиляции.

    Пользователь должен иметь в виду, что есть некоторые важные шаги. Во-первых выравнивание 2D-ПС и тег линзы являются критическими. Оба должны быть хорошо скоординированы для получения оптимальной точностью. Во-вторых, параметры, которые используются для оценки позиции в фиксированной частиц, сканирование шаг должен быть хорошо калиброванные (см. Рисунок 4). Позиция по оценкам частицы должны соответствовать позиции частицы, соответствующий центр лазерного сканирования диапазона. Наконец обратной связи интегральных констант (Kя) должен быть настроен тщательно, начиная с небольшого значения ramping вверх, пока наблюдаются колебания, а затем отступать к около 80% от этой стоимости.

    Есть несколько предостережений о 3D-DyPLoT иметь в виду в зависимости от требуемого приложения. В то время как оптимизированный позиции оценки предназначен для использования с броуновского движения, это также хорошо подходит к направленного движения. Алгоритм может применяться непосредственно к любому типу движения так как это только позиция неопределенность, которая предполагается гауссовским, не реальных частиц позиции. Для случаев, где ожидается стойкие линейные, могут добавляться дополнительный срок в срок прогнозирования в алгоритме оценки позиции (см. уравнение 3 в Дополнительной информации).

    Выбор параметров для 2D-ПС и тег следует тщательно рассматривать при создании 3D-DyPLoT. Особое значение имеет бин время, используемые для Тур рыцарский сканироваться 2D-ПС. В идеальном варианте Тур рыцарский будут синхронизированы для периода тег объектива для обеспечения эффективного отбора проб. Однако важно рассматривать время отклика 2D-EOD шаг изменения напряжения. Для блока, используемая здесь есть 2-3 время отклика МКС после напряжения применяется, прежде чем будет достигнуто нужное место. В 20 µs бин время это около 10-15% от времени сбора. Сокращение времени, так что он соответствует ТЕГУ объектив период ~ 14 МКС увеличивает долю времени бин, который является время запаздывания 2D-ПС. Это приводит к неверные значения позиции лазерного и неправильные позиции сметы.

    Еще одним фактором для экспериментатора иметь в виду является временным разрешением. В то время как данные, показанные здесь собираются на скорость передачи данных 100 кГц, конечная временное разрешение определяется в конечном счете, данные используются для измерения позиции. Если индикация nanopositioner используется в качестве частицы положение (рис. 6), временное разрешение будет зависеть от значения константы составной элемент управления. Например, для элемента неотъемлемой, показано на рисунке 6А–d, ответ стадии составляет порядка 1 мс, то время как для Рисунок 6e–h, она составляет порядка 10 г-жа если быстрее временное разрешение, то Фотон по Фотон результат работы алгоритма оценки позиции будет коррелируют с скорости отсчётов фотонного. Например коэффициент выбросов 10 кГц дает 100 МКС временное разрешение и частота 100 кГц выбросов дает 10 мкс временное разрешение. Кроме того, поскольку точность ниже Equation 2 отношения41, пространственных и временных точность соединены. В результате яркость зонд определяет пространственных и временных точности.

    В этом протоколе мы описали установки, расположение и выравнивание высокой скорости в реальном времени 3D одной частицы отслеживания метод, который использует 2D-ПС и тег объектив для динамического перемещения пятно сфокусированного лазерного для достижения быстрых частиц позиции оценки. Мы затем описал методы оптимизации подготовки и параметров выборки. 3D-DyPLoT обеспечивает надежный и относительно простой способ блокируемого быстро движущихся и смирен испуская диффузионное частиц. Простой макет оптических позволяет легко добавлять на стороне порт любых существующих Микроскоп стенда так, что она может быть объединена с тепловизионных модулей. Этот протокол мы надеемся, что RT-3D-ДПМ может быть более широко реализуется более следователей для решения быстро, три размерные биологических процессов.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

    Acknowledgments

    Эта работа была поддержку путем национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под номером премии R35GM124868 и Университет Дьюка.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    2D Electro-optic Deflector  ConOptics M310A 2 required
    Power supply for EOD ConOptics 412 Converts FPGA ouput to high voltage for EOD
    TAG  Lens TAG Optics TAG 2.0 Used to deflect laser along axial direction
    XY piezoelectric nanopositioner MadCity Labs Nano-PDQ275HS Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in 
    Z piezoelectric nanoposiitoner MadCity Labs Nano-OP65HS Used to move the objective lens to follow the diffusing particle
    Micropositioner MadCity Labs MicroDrive Used to coarsely position sample and evaluate
    Objective Lens Zeiss PlanApo High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
    sCMOS camera PCO pco.edge 4.2 Used to monitor the particle's position
    APD Excelitas SPCM-ARQH-15 Lower dark counts beneficial
    Field programmable gate array National Instruments NI-7852r
    Software National Instruments LabVIEW
    Tracking excitation laser JDSU FCD488-30
    Lens ThorLabs AC254-150-A-ML L1
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L2
    Pinhole ThorLabs P75S PH
    Glan-Thompson Polarizer ThorLabs GTH5-A GT
    Half-wave plate ThorLabs WPH05M-488 WP
    Lens ThorLabs AC254-75-A-ML L3
    Lens ThorLabs AC254-250-A-ML L4
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L5
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L6
    Dichroic Mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc DC
    Fluorescence Emission Filter Chroma D535/40m F
    10/90 beamsplitter Chroma 21012 BS
    PBS Sigma D8537
    190 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/9942
    110 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/10617
    Coverslip Fisher Scientific 12-545A
    Powermeter Thorlabs PM100D
    CMOS Thorlabs DCC1545M
    Iris Thorlabs SM1D12D
    Microscope Mad City Labs RM21

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
    2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
    3. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
    4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
    5. Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
    6. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
    7. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).
    8. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).
    9. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).
    10. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
    11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
    12. Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
    13. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
    14. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
    15. Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
    16. Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).
    17. Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
    18. Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
    19. Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).
    20. Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
    21. Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
    22. Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
    23. McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
    24. McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
    25. McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
    26. Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
    27. Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
    28. Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
    29. Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
    30. Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
    31. Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
    32. Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).
    33. Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
    34. Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
    35. Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606 (2017).
    36. Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
    37. Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
    38. Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
    39. Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
    40. Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
    41. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).

    Tags

    Биоинженерия выпуск 131 одной частицы отслеживания оптической микроскопии флуоресценции систем тепловидения оптические ловушки оптика 3D отслеживания отслеживание в реальном времени частицы
    Протокол для слежения в реальном времени 3D одной частицы
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hou, S., Welsher, K. A Protocol for… More

    Hou, S., Welsher, K. A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking. J. Vis. Exp. (131), e56711, doi:10.3791/56711 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter