Summary
Este detalhes de protocolo a construção e operação de um microscópio de rastreamento em tempo real 3D única partícula capaz de rastreamento nanoescala fluorescente sondas em alta velocidade difusiva e taxas de contagem de fótons de baixa.
Abstract
Partícula de única tridimensional em tempo real (RT-3D-SPT) de rastreamento tem o potencial de lançar luz sobre os processos rápidos, 3D em sistemas celulares. Apesar de vários métodos de RT-3D-SPT têm sido apresentados nos últimos anos, alta velocidade de rastreamento 3D difusão de partículas em taxas de contagem de fótons de baixa continua a ser um desafio. Além disso, as configurações de RT-3D-SPT são geralmente complexos e difíceis de implementar, limitando sua aplicação generalizada de problemas biológicos. Este protocolo apresenta um sistema de RT-3D-SPT chamado 3D dinâmica fóton localização de rastreamento (3D-DyPLoT), que pode acompanhar a partículas com alta velocidade difusiva (até 20 µm2/s) em taxas de contagem de fótons de baixa (abaixo de 10 kHz). 3D-DyPLoT emprega um defletor de electro-óptica 2D (2D-EOD) e uma lente gradiente acústico sintonizável (TAG) para conduzir um único foco laser ponto dinamicamente em 3D. Combinada com um algoritmo de estimativa de posição otimizada, 3D-DyPLoT pode travar em partículas única com acompanhamento de alta velocidade e localização de alta precisão. Devido à sua excitação única e layout de caminho único deteção, 3D-DyPLoT é robusto e fácil de configurar. Este protocolo discute como construir 3D-DyPLoT passo a passo. Primeiro, o layout óptico é descrito. Em seguida, o sistema é calibrado e otimizado por raster um grânulo de fluorescente 190 nm com o nanopositioner piezoeléctrica de digitalização. Finalmente, para demonstrar o 3D em tempo real, capacidade de rastreamento, grânulos de fluorescente 110 nm são controlados em água.
Introduction
O surgimento de técnicas avançadas de imagem abriu uma janela para ver a estrutura cada vez mais detalhada de fenômenos celulares, todo o caminho até o nível molecular. Métodos como reconstrução óptica estocástico microscopia (Tempestade)1,2,3, localização de foto-ativado microscopia (PALM)4,5,6,7 , estruturada iluminação microscopia (SIM)8,9,10,11e estimulou a emissão depleção microscopia (STED)12,13, 14 tem ido muito além do limite de difração para entregar detalhe sem precedentes na estrutura e função das células vivas. No entanto, completo entendimento de como esses sistemas se comportam requer informações dinâmicas, bem como informações estruturais. Os métodos de super-resolução listados acima envolvem um trade-off entre resolução espacial e resolução temporal, limitando a precisão temporal com os quais processos dinâmicos podem ser sondados. Um método que fornece alta precisão espacial e resolução temporal é RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,,27,28,29. Aqui, podemos estabelecer uma distinção entre 3D-SPT tradicional30 e RT-3D-TSC tradicional 3D-SPT requer simplesmente uma séries de dados de imagem tridimensional (que podem ser adquiridos ou usando um microscópio confocal ou um microscópio de epifluorescência dada a configuração certa). 3D-SPT tradicional, as coordenadas da partícula são determinadas após a coleta de dados localizando a partícula em cada pilha de imagem e concatenando os locais em sucessivos volumes para criar uma trajetória. Para esses métodos, a resolução temporal final é determinada pela taxa de imagem volumétrica. Para microscópios confocal, isto é facilmente a escala de segundos para dezenas de segundos. Para métodos de epifluorescência, onde o caminho óptico é manipulado para que as informações de localização axial podem ser extraídas, a resolução temporal é limitada pelo tempo de exposição ou leitura a câmera. Esses métodos de epifluorescente são limitados no intervalo durante o qual axiais informações podem ser coletadas, embora recentes progressos na fase de avião de Fourier máscaras design e óptica adaptativa está ampliando esses intervalos de 10 µm ou mais31,32 , 33 , 34.
Em contraste, RT-3D-SPT não se baseia na aquisição de uma pilha de imagem 3D e encontrar partículas após o fato. Em vez disso, informações de localização em tempo real são extraídas através de detectores de ponto único e gabarito é aplicado para efetivamente "bloquear" a partícula no volume focal da lente objetiva, através do uso de um palco piezoelétrico de alta velocidade. Isto permite a medição contínua da posição da partícula limitada somente por quantos fótons podem ser coletados. Além disso, esse método permite interrogatório espectral da partícula, enquanto se move ao longo de intervalos de tempo. RT-3D-SPT em vigor as forças funciona semelhante a uma armadilha óptica força-livre para objetos de nanoescala, no qual a partícula é continuamente analisada e medida em tempo real sem a necessidade de poderes grandes do laser ou óptico. Dado que o RT-3D-SPT fornece um meio para interrogatório contínuo de objetos rápido difusiva (até 20 µm2/s)25,29 em três dimensões no fóton baixa contagem taxas20,29, 35, ele deve fornecer uma janela em processos biológicos rápidos ou transitórios como transporte intracelular, ligação ao ligante-receptor e a dinâmica extracelular dos virions único. No entanto, a este ponto, a aplicação do RT-3D-SPT tem sido limitada a um punhado de grupos de trabalho para o avanço desta tecnologia.
Uma barreira é a complexidade do layout óptico exigido por métodos de RT-3D-SPT, que são variados. Para a maioria dos métodos, o gabarito ótico é fornecido por um estágio piezoelétrico. Como os partícula faz pequenos movimentos em X, Y, ou Z, leituras de ponto único detectores são convertidos para funções de erro e alimentados em alta velocidade para um nanopositioner piezoeléctrica, que em sua vez move a amostra para neutralizar o movimento da partícula, efetivamente bloqueando-a no lugar em relação a lente objetiva. Para medir pequenos movimentos posicionais em X, Y e Z, vários pontos de excitação ou de múltiplos detectores (4 ou 5 dependendo da implementação)15,18,21 (2-4, o mais baixo do que pode ser aplicado se um bloqueio-em amplificador é usado para extrair o X e Y posição usando um giro laser ponto)25,28 são aplicadas. A sobreposição desses múltiplos pontos de deteção e emissão de dificultar os sistemas alinhar e manter.
Neste documento, apresentamos um método 3D-SPT-mira de alta velocidade com um design óptico simplificado chamado 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT usa um 2D-EOD e um TAG lente36,37,38 para mover dinamicamente um ponto laser focalizado através do volume focal objectivo em uma taxa elevada (50 kHz XY, 70 kHz Z). Combinando a posição do foco do laser e o tempo de chegada do fóton permite que a posição da partícula 3D rapidamente obtidos até no taxas de contagem de fótons de baixa. A 2D-EOD dirige o foco do laser em turnê padrão39 com um tamanho quadrado de 1 x 1 µm no plano X-Y de um cavaleiro e a lente de TAG move o foco do laser no sentido axial, com um intervalo de 2-4 µm. A posição da partícula 3D é obtida com uma estimativa de posição otimizado algoritmo29,40 em 3D. O controle do 3D dinamicamente movente do laser ponto, fotão contando do fotodiodo avalanche (APD), cálculo de posição de partículas em tempo real, gabarito estágio piezoelétrico e gravação de dados são executadas em uma disposição de porta programável do campo (FPGA).Neste protocolo, descrevemos como construir um microscópio 3D-DyPLoT passo a passo, incluindo alinhamento óptico, calibração com partículas fixas e finalmente livre de rastreamento de partículas. Como demonstração, grânulos de fluorescente 110 nm foram rastreados continuamente na água por minutos a uma hora.
O método descrito aqui é uma escolha ideal para qualquer aplicação onde se deseja monitorar continuamente uma sonda fluorescente velozes em níveis baixos de luz, incluindo vírus, nanopartículas e vesículas como endossomos. Em contraste com os métodos anteriores, há apenas uma única excitação e caminho único deteção, fazendo o alinhamento e manutenção simples. Além disso, a área grande de detecção permite que este microscópio facilmente buscar difundir rapidamente partículas, enquanto a capacidade de controlar o nível de sinal baixo (até 10KHz) faz com que este método ideal para aplicações de baixa luminosidade,29.
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Protocol
1. configuração de Layout e alinhamento
- Instalação e colimação de excitação o rastreamento a laser
- Apor o laser à tabela óptico usando um monte de casa construída. A montagem é uma placa de alumínio simples com furos para a cabeça do laser e óptica mesa de montagem. O laser deve ser firmemente presa para um monte de metal para a estabilidade e a dissipação de calor. Para este trabalho, use um 488 nm laser de estado sólido para iluminação (Figura 1), embora o comprimento de onda pode ser selecionado para atender um determinado fluoróforo ou experimentar. Um fator crítico é que o comprimento de onda do laser se encaixam a escala de trabalho 2D-EOD, que é determinada principalmente pela placa de onda entre os dois defletores (Figura 1: W2). O laser de 488 nm efetivamente pode excitar a verde ou amarela proteína fluorescente (GFP/YFP), que são comuns etiquetas fluorescentes em experimentos de células vivas.
- Ajustar a altura do feixe de laser e direção usando um par de espelhos dieléctricos (Figura 1: M). Certifique-se de que o feixe de laser é paralelo à tabela óptica e ajustá-lo a uma altura adequada.
Nota: A altura deve ser escolhida com base na plataforma do microscópio. Esta altura deve ser mantida para todos os espelhos subsequentes utilizados neste protocolo, embora isso não vai ser declarado explicitamente. - Desbloqueem o feixe com um par de lentes (Figura 1: L1 e L2). As distâncias focais das lentes deve ser escolhidas com cuidado para evitar o ponto do laser sendo cortado pela abertura da 2D-EOD. Recorte é evidente por uma mudança na forma feixe do laser após a passagem com a 2D-EOD. A qualidade da colimação aqui é muito importante porque as aberrações vão ser amplificadas por lentes subsequentes e qualquer divergência deteriora o desempenho da deflexão 2D-EOD. Idealmente, Desbloqueem o feixe, centrando-se o raio de um ponto de pelo menos 20 metros de distância.
- Coloque uma pinhole (Figura 1: PH) de tamanho apropriado no foco da primeira lente de colimação (Figura 1: L1).
- Escolha um tamanho adequado pinhole. O tamanho do pinhole pode ser escolhido com base no seguinte cálculo:
Onde λ é o comprimento de onda do laser, f é a distância focal da lente primeira, e D é o diâmetro do feixe de entrada. - Monte o pinhole num palco 3D tradução para que ele pode ser colocado precisamente no foco da primeira lente de colimação.
- Ajuste a posição do pinhole. Coloque um medidor de energia do laser após o pinhole e ajustar a posição de pinhole na XYZ para maximizar a leitura do medidor de energia. Se for observado um anel de difração, bloqueá-lo com uma íris colocada antes a 2D-EOD.
- Escolha um tamanho adequado pinhole. O tamanho do pinhole pode ser escolhido com base no seguinte cálculo:
- Instalação do polarizador de Glan-Thompson
- Colocar o polarizador de Glan-Thompson (Figura 1: GP) após a segunda lente de colimação (Figura 1: L2) para limpar a polarização do feixe de laser. Gire o polarizador para encontrar a máxima de transmissão com o medidor de energia.
- Instalação de EODs
- Use 2 EODs (Figura 1: EOD1 & EOD2) para desviar o laser nas direções X e Y. Maximize a transmissão do laser, ajustando a guinada, o passo e a altura de cada EOD.
- Alinhe os dois EODs em relação uns aos outros usando o marcador de alinhamento fornecido pelo fabricante do lado de cada defletor.
- Aplica um teste padrão para o controlador da EOD-2D para inspecionar a saída da EOD. Isso pode ser visita do cavaleiro (Figura 2) via o FPGA descrito abaixo ou uma onda de seno simples fornecida por um gerador de função. Para o melhor desempenho, a deflexão por cada defletor deve ser paralela à direção X ou Y de nanopositioner o piezo. Neste sentido é ditado pela direção angular dos defletores sobre o eixo de transmissão. Para girar a direção de deflexão sem mover a 2D-EOD, coloque um prisma pomba após a EOD-2D para alinhar os eixos de deflexão para os eixos de nanopositioner piezo.
- Instalação da placa de meia onda
- Coloque uma placa de meia onda (Figura 1: W1) entre o polarizador de Glan-Thompson (Figura 1: GP) e a EOD-2D para ajustar o laser entrado feixe de polarização com os eixos de deflexão da 2D-EOD. Coloque uma lente longa focal (300 mm) após a 2D-EOD e uma câmera de sCMOS no foco do laser. Em seguida, ligue o EOD-2D para gerar visita do cavaleiro descrita a seguir (Figura 2). Gire a placa de meia onda até uma distribuição uniformemente quadrado do laser é observada na câmera.
- Instalação de um feixe de gastar lente par e par de lente do relé
- Colocar um par de lentes (Figura 1: L3 e L4) após a EOD-2D para expandir o feixe para preencher a abertura traseira da lente objetiva (Figura 1: OL) e outro par de lentes (Figura 1: L5 e L6) para relé do plano focal para o objectivo de microscópio. Não se esqueça de deixar espaço suficiente entre estes dois pares de lentes, como a lente de TAG será instalada entre eles em uma etapa posterior.
- Instale o filtro dicroico, divisor de feixe 10/90, com foco, lente, APD, objectiva e filtro de emissão de fluorescência para completar o percurso da deteção.
- Instale o filtro dicroico (Figura 1: DC) para refletir o laser em direção da lente objetiva. Ajustar o laser para ir em linha reta através do centro da lente objetiva usando duas íris na parte superior e inferior de um tubo de lente longa.
- Instalar um divisor de feixe 10/90 (Figura 1: BS) por que 10% da luz é refletida para geração de imagens por uma câmera de sCMOS (descritas abaixo) e 90% de passes através da APD para rastreamento.
- Alinhe a APD. Concentre-se o laser sobre uma lamela pela lente objetiva. Use o reflexo da lamela para alinhar elementos tudo a jusante, colocando uma lamela no foco objetivo e verificar a intensidade da leitura do APD. Depois o divisor de feixe, instalar a APD lente de focalização (Figura 1: L7) seguido da APD em uma cena 3D tradução. Colocar a lente forma a reflexão do laser do objectivo atravessa o centro da lente.
- Colocar a TAG lente entre os dois pares de lentes (entre Figura 1: L4 e L5) como mencionado antes e mostrado na Figura 1. Ajuste a guinada, densidade, altura e posição lateral de forma a que o feixe passa perpendicularmente através das lentes do centro da TAG.
2... preparação da amostra.
- Preparação de partículas fixas
- Diluir a 190 grânulos fluorescentes de nm para ~ 5 × 108 grânulos/mL em PBS. Adicionar solução de grânulos 400 µ l sobre uma lamela e montagem no suporte da amostra da fase piezoeléctrico (o volume de contas dependerá do porta-amostras; o diâmetro da câmara de titular de amostra usado aqui é de 18 mm). Para os grânulos usados aqui, PBS faz com que as partículas depositar na lamela.
- Preparação de partículas em movimento livre
- Diluir a 110 grânulos fluorescentes de nm para ~ 5 × 108 grânulos/mL com água. Adicionar 400 µ l de solução de grânulos no sentido uma lamela e monte no porta-amostras da fase piezoelétrico.
3. otimizar parâmetros de controle
- Raster scan partículas fixas
- Colocar uma amostra de partículas fixas no microscópio.
- Liga o laser, micropositioner controlador, piezo nanopositioner controlador, controlador de lente de TAG e controlador de EOD. Observe que a ordem não é crítica. Execute o nanopositioner piezo em circuito fechado.
- Raster scan a amostra em XYZ usando um personalizado varredura programa de software (Figura S3, software disponível mediante solicitação dos autores), que dirige a 2D-EOD em uma visita cavaleiro (Figura 2), recolhe contagens da APD, dirige o piezo nanopositioner e realiza o cálculo de posição (Figura S2). O tamanho do passo é 40 nm e o intervalo de varredura é de 2 µm.
- Para colocar a lamela no foco do objectivo, retire o filtro de emissão de fluorescência e usar a reflexão do laser da lamela para maximizar a intensidade do sinal em função da posição Z da micropositioner. Depois de colocar a amostra no plano focal, coloque de volta o filtro de emissão de fluorescência.
- Abra o programa de digitalização. Defina o intervalo de varredura e o tamanho do passo, digitando o número em 'start', 'Concluir' e 'passo'. Primeiro defina um grande intervalo de varredura e o tamanho do passo para localizar uma partícula (por exemplo, 10 x 10 µm escala com tamanho de passo 200 nm). Depois de encontrar a partícula, o intervalo de varredura de encolher e diminuir o tamanho do passo (por exemplo, 2 x 2 µm escala com tamanho de passo de 100 nm). Clique no botão de 'digitalizar' para executar uma varredura de quadriculação 3D para encontrar o foco fluorescente.
- Configurações de lente de marca (ver também Figura 3)
- Clique sobre o software de controle de lente de TAG. Clique em 'conectar', 'alimentação ligada' sequencialmente.
- Para alterar a fase de saída dos sinais de gatilho, é necessário alterar o modo de gatilho de saída. Primeiro, altere o modo de 'RGB' para 'Multiplane' e depois mudar de volta. Agora a fase pode ser alterado (Figura 3b).
- Defina a fase de saída a ser 0 °, 90 ° e 270 °. Enquanto podem ser usadas qualquer três fases que cobrem o espaço de fase, estes três são encontrados para trabalhar bem empiricamente (Figura 3C).
- Selecione a configuração de frequência de 68.500 Hz.
- Para encontrar a frequência ideal é muitas vezes necessário alterar o intervalo de pesquisa de frequência. Clique em 'avançadas', 'configuração'. Alterar o ' Max. Freq(Hz)' da coluna 0 de 70.000 Hz Hz 71.500. Isto pode ser ajustado para qualquer faixa de frequência é apropriada. Clique em 'Salvar calibração', 'Exit calibração' (Figura 3d).
- Para tornar a nova calibração eficaz, alternar a ressonância para outra frequência (por exemplo, 189.150 Hz) e então volta para a configuração de frequência de 68.500 Hz (Figura 3e).
- Mude gradualmente a amplitude de 35%. Clique em 'Bloquear ressonância'. Após a frequência estiver bloqueada, clique em 'Desbloquear ressonância' (Figura 3e). A lente de TAG está pronta para usar agora.
- Para calibrar, alterar os parâmetros que são usados na estimativa para tornar a posição estimada igual à posição real, como mostrado na Figura 4e, f. entrada do intervalo de varredura de x, y, e z e, em seguida, clique o 'scan' botão para digitalizar a amostra em XYZ para mover o partícula através o ponto do laser em movimento. A posição da partícula como digitalização através do foco do laser deve concordar com a posição de partícula estimada determinada pelo loop de estimativa de posição (Figura S1). A relação entre a posição estimada e a verdadeira posição (Figura 4D) pode ser extraída imagens posição estimada (Figura 4f). Se as posições não concordar, ajuste os valores de posição do laser (ck) usado no loop de estimativa de posição (Figura S1).
- Alinhar a lente de TAG
- Quando o controlador de lente TAG está desligado, o raster imagens de partícula (descritas abaixo) tiradas antes de instalar o lente de TAG e depois instalando lente TAG deve olhar idêntico digitalizadas. Em seguida, execute a pilha de partícula fluorescente Z digitalização movendo o objectivo com o nanopositioner de z para ajustar a posição e o ângulo da lente de TAG (Figura 4). Ajuste a posição da lente TAG até que não haja nenhum desvio nas imagens de partícula no plano XY na direção Z, que é alcançada quando não há alteração na posição XY da partícula em função da posição Z (Figura 4D). O sistema de rastreamento é pronto para uso após o alinhamento da lente TAG.
- Instalação da câmera de sCMOS para o monitoramento de partículas
- Instale uma câmera sCMOS para visualizar as partículas enquanto eles estão sendo controlados. Instale o sCMOS somente depois que todos os componentes do sistema de rastreamento foram instalados e otimizados.
4. em tempo real 3D Tracking de difundir livremente nanopartículas
- Coloque o 110 nm livre movendo-se a amostra de partículas no microscópio.
- Liga do laser, posicionador micro controlador, piezo nanopositioner controller, controlador de lente de TAG e controlador de EOD. Execute o nanopositioner piezo em malha aberta. Defina o TAG lente software conforme item 3.2.
- Abrir e executar o software de rastreamento (disponível mediante solicitação dos autores). Defina a posição de parâmetros de avaliação para seus valores otimizados, que foram encontrados na secção 3.
- Para colocar a lamela no foco do objectivo, retire o filtro de emissão de fluorescência e usar a reflexão do laser da lamela para maximizar a intensidade do sinal em função da posição Z da micropositioner. Depois de encontrar a lamela, aumente o foco posição 15 µm para focalizar o laser longe a lamela e para a solução. Coloque de volta o filtro de emissão de fluorescência.
- Defina as constantes de controle integral. As constantes de controle integral podem ser definidas, começando com um valor baixo e lentamente aumentando até oscilações podem ser vistas em leituras de posição da partícula. Uma vez que as oscilações são observadas, defina as constantes de controle integral para 80% do valor causando as oscilações. Valores típicos será em torno de 0,012 para o 'ganho integral' de XY e 0,004 para o Z 'ganho integral'.
- Definir os limiares de rastreamento em 'Limite de faixa' e 'Mínimo faixa' e começar o experimento de controle, clicando em 'Search' e 'Auto Track'. O limiar para o rastreamento de terminação é definido ligeiramente superior ao nível de plano de fundo e o limiar para desencadeamento de rastreamento é cerca de duas vezes superior ao fundo. Aqui, o limiar para desencadeamento de rastreamento é de 3 kHz e o limiar para acabar com a trajetória é 1,5 kHz.
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Representative Results
Partícula fixa digitalização (Figura 4) e difunde livremente 110 nm fluorescente partícula de controle (Figura 5) foram realizados seguindo o protocolo acima. A digitalização de partícula foi realizada movendo os fótons nanopositioner e bin piezoelétricos enquanto simultaneamente cálculo da partícula calcula a posição em cada ponto no scan. A imagem de varredura mostra um quadrado de intensidade mesmo (figura 4a) e as posições estimadas mostram uma relação linear com a posição da partícula real sobre uma 1 × 1 × 2 µm escala em x, y e z direção (figura 4b–f).
Para demonstrar o acompanhamento em tempo real, as partículas fluorescentes de 110 nm foram rastreadas na água por 3D-DyPLoT (Figura 5a, b). A análise de deslocamento (MSD) quadrada mostra um típico comportamento linear característico do movimento browniano (Figura 5C). Análise MSD de 30 trajetórias mostrou um diâmetro médio de hidrodinâmico de 110 nm, bom de acordo com a especificação de fabricantes para o tamanho das nanopartículas fluorescentes sendo controladas (Figura 5D). Além disso, 1 filme mostra as leituras em tempo real nanopositioner piezoelétrico e sincronizado sCMOS imagens para uma 2 min longa trajetória de uma partícula fluorescente livremente difusores de 110 nm.
Além de ser capaz de rastrear com alta velocidade, as partículas em movimento lentas podem ser localizadas com alta precisão. Figura 6a - d mostra a aplicação do sistema 3D-DyPLoT às partículas fixas usando os mesmos parâmetros do gabarito utilizado para a alta velocidade de rastreamento, mostrando uma precisão de 17,6 e 26,4 53,4 nm em X, Y e Z, respectivamente, com taxa de contagem de fótons de 105. Figura 6e - h mostra a precisão sob controle de gabarito reduzido por um fator de 10, efetivamente trocar de velocidade para precisão e exibindo uma precisão de 6.5 e 8.3 10.5 nm em X, Y e Z, respectivamente.
Figura 1. Esquemático do sistema de rastreamento de 3D. A 2D-EOD (EOD1 & EOD2) e a lente de TAG (TAG) desviar o laser junto as direções XY e Z, respectivamente. A APD (APD) é usado para coletar fótons de fluorescência, que são enviados para o FPGA (FPGA). FPGA é usado para o algoritmo de cálculo de posição, contagem de fótons, controle da 2D-EOD, bem como controle e leitura de nanopositioner piezoelétrico (NSxy e NZz). Outros componentes rotulados na figura: espelhos (M); lentes (L #); pinhole (PH); Polarizador de Glan-Thompson (GP); placa de meia onda (W1); filtro dicroico (DC); lente objetiva (OL, 100 X at = 1,49); filtro de emissão de fluorescência (F); divisor de feixe (BS); Fase de micropositioner XY (MSxy); Fase de micropositioner Z (MSz). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. As coordenadas para a visita do cavaleiro implementada em 3D-DyPLoT. Eixo 1 e eixo 2 devem ser alinhadas ao longo do eixo X ou Y por alinhamento adequado da 2D-EOD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Configurações de software TAG lente. Consulte a seção 4.2 TAG lente definições para obter mais informações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Estimativa de varredura e posição das partículas. (a) imagem de digitalização de 190 fluorescente nm grânulos com 2D-EOD dirigindo o laser em um 1 × 1 µm quadrado padrão de turnê do cavaleiro. Intensidade da fluorescência é denotada pela cor. Unidade: kHz. (b) estimativa de xk, a posição da partícula em relação ao centro da 2D-EOD scan em micrômetros. A cor em b, ce d denota a posição estimada. Unidade: µm. (c) estimativa de yk em micrômetros. (d) estimativa de zk, a posição da partícula em relação ao centro axial da lente TAG scan em micrômetros. (e) estimado partícula posição yk em função da fase de posição média ao longo de toda a grade de (c). Observe que a posição da partícula estimado adquirida a partir do algoritmo de estimativa de posição (yk) concorda com a posição real. (f) estimado partícula posição zk em função da fase de posição média ao longo de toda a grade de (d). A posição estimada mostra uma relação linear com a posição real da partícula sobre 1 × 1 × 2 µm escala na direção X, Y e Z. Observe que a posição da partícula estimado adquirida a partir do algoritmo de estimativa de posição (zk) concorda com a posição real. A posição estimada mostra uma relação linear com a posição real da partícula sobre uma 1 × 1 × 2 µm escala em X, Y e Z de direção. A escala branco bares em (um–c) representam 500 nm e a barra de escala preta em (d) representa 2 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5.Rastreamento de 110 nm fluorescente as partículas na água com 3D-DyPLOT. (um) 3D trajetória de uma difusão livremente 110 nm fluorescente nanopartículas na água. (b) intensidade fluorescente em função do tempo para a trajetória em (um). (c) MSD da trajetória em (um). A linha azul é o MSD medido enquanto a linha vermelha pontilhada é a melhor linha de ajuste de regressão linear. (d), MSD análise de 30 trajetórias, mostrando um diâmetro médio de hidrodinâmico de 110 nm, bom de acordo com o tamanho das nanopartículas fluorescentes sendo controladas. O diâmetro das partículas foi calculado usando a relação de Stokes-Einstein. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Precisão da partícula fixa rastreamento. (um) A partícula fixa é controlada por 3D-DyPLoT a taxas diferentes de contagem. A precisão é nm (b) 17,6 em X e (c) 26,4 nm em Y (d) 53,4 nm em Z a uma taxa de emissão de 100 kHz. (e) quando a sondagem de processos mais lentos, o controle de gabarito constante (Keu) pode ser reduzido por um fator de 10 para aumentar a precisão. Sob esse controle de gabarito reduzido, a precisão é (f) 6.5 nm em X (g) 8.3 nm em Y e (h), 10.5 nm em Z a uma taxa de emissão de 100 kHz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura S1. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura S2. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura S3. Clique aqui para baixar este arquivo.
Informações complementares. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Embora muitas variedades de 3D única partícula métodos de rastreamento têm surgido nos últimos anos, robusto acompanhamento em tempo real de difusão 3D de alta velocidade em taxas de contagem de fótons de baixa com uma configuração simples ainda é um desafio, o que limita sua aplicação biológica importante problemas. O método 3D-DyPLoT descrito em endereços este protocolo estes desafios de várias maneiras. Em primeiro lugar, as vias de excitação e deteção são simplificadas muito comparado a outras implementações fazendo alinhamento simples e robusto. Em segundo lugar, o movimento laser ponto e algoritmo de estimativa de posição fornecem estimativas de posição exata para o circuito de retroalimentação, fazendo com que o feedback mais estável. Em terceiro lugar, o intervalo de detecção efetivamente grandes (1 x 1 x 4 µm) do local do laser dinamicamente em movimento permite rastreamento de partículas em movimento rápidos. Para ver por que esta área da deteção grande é fundamental, é importante considerar o tempo de resposta intrínseca do nanopositioner piezoelétrico. Estágios piezoelétrico de alta velocidade têm ressonâncias na ordem de 1 kHz, limitando o tempo de resposta para ser da ordem de 1 ms. em 1 ms, uma 100 nm nanopartículas com um coeficiente de difusão de 4 µm2/s, será difusa em média 90 nm do centro da difração-li volume de deteção mited. Este é apenas o deslocamento médio e verdadeiramente aleatório movimento irá expor a passos muito maiores do que isso, levando à partícula deixando o volume focal e terminando a trajetória atual. A situação é ainda pior para partículas menores, onde cada vez maiores passos difusiva térmicos levam à perda de controle. A área efetivamente grandes de detecção permite que o sistema de rastreamento superar a defasagem fase piezoelétrico intrínseca e recuperar-se de grandes saltos difusiva na posição da partícula, aumentando a robustez geral do mecanismo de acompanhamento. Finalmente, a área de scan amplo permite que o sistema facilmente pegar novas partículas, permitindo trajetórias consecutivas para ser rapidamente adquiriu e grandes conjuntos de dados compilados.
O usuário deve ter em mente que existem algumas etapas críticas. Primeiro, o alinhamento de ambos a 2D-EOD e a lente de TAG são críticos. Ambos devem ser bem alinhados para obter a melhor precisão. Em segundo lugar, os parâmetros que são usados na estimativa posição na digitalização passo fixo de partículas devem ser bem calibrados (ver Figura 4). A posição da partícula estimado deve coincidir com a posição da partícula correspondente ao centro da gama de varredura a laser. Finalmente, as constantes integrante do gabarito (Keu) devem ser ajustadas cuidadosamente, começando com um valor pequeno e depois ÓLICAS até oscilações são observadas, em seguida, recuar para cerca de 80% desse valor.
Existem algumas advertências sobre 3D-DyPLoT para manter em mente dependendo da aplicação desejada. Enquanto a estimativa de posição otimizada é projetada para uso com o movimento Browniano, é também adequado para movimento direcional. O algoritmo pode ser aplicado diretamente a qualquer tipo de movimento uma vez que é apenas a incerteza da posição que se presume para ser Gaussian, não a posição da partícula real. Para casos onde persistente movimento linear é esperado, um termo adicional pode ser adicionado ao termo previsão no algoritmo de estimativa de posição (ver equação 3 nas Informações complementares).
A seleção dos parâmetros para o 2D-EOD e a etiqueta deve ser cuidadosamente ponderada, ao configurar o 3D-DyPLoT. De particular importância é o bin tempo utilizado para a visita do cavaleiro verificada pelo 2D-EOD. Em um cenário ideal, excursão do cavaleiro iria ser sincronizado para o período da lente TAG para garantir a amostragem eficiente. No entanto, é fundamental considerar o tempo de resposta da EOD-2D para mudanças na tensão de passo. Para a unidade usada aqui, há um tempo de resposta 2-3 µs após a tensão é aplicada antes do ponto desejado é atingido. Hora 20 µs bin, isto é cerca de 10-15% do tempo a coleção. Reduzindo o tempo para que coincide com o período de lente de TAG de ~ 14 µs aumenta a fração do tempo bin, que é o tempo de latência da 2D-EOD. Isto leva a valores incorretos do laser sobre a posição e posição incorreta estimativas.
Outro fator para o experimentador manter em mente é a resolução temporal. Enquanto os dados mostrados aqui são coletados em uma taxa de dados de 100 kHz, a resolução temporal final é definida em última análise, pelo qual os dados são usados para a medição de posição. Se a leitura do nanopositioner é usada como a posição da partícula (Figura 6), a resolução temporal dependerá do valor da constante controle integral. Por exemplo, para o controle integral, mostrada na Figura 6a–,d, a resposta de fase é da ordem de 1 ms, enquanto que para Figura 6e–h, é da ordem de 10 ms. se mais rápida a resolução temporal é desejada, em seguida, o fóton por fóton resultado do algoritmo de estimação de posição será correlacionar com a taxa de contagem de fótons. Por exemplo, uma taxa de emissão de 10 kHz produz 100 µs resolução temporal e uma taxa de emissão de 100 kHz produz uma resolução temporal de 10 µs. Além disso, desde a precisão segue um 
relação41, a precisão espacial e temporal são acoplados. Como resultado, o brilho da sonda determina tanto a precisão espacial e temporal.
Neste protocolo, descrevemos a configuração, layout e alinhamento de partícula única 3D em tempo real, alta velocidade, método que utiliza uma lente de TAG para mover dinamicamente um ponto laser focalizado para obter a estimativa de posição da partícula rápida e 2D-EOD de rastreamento. Em seguida, descrevemos métodos de otimização de preparação e parâmetro de amostra. 3D-DyPLoT fornece um método robusto e relativamente simples de bloqueio para mover-se rápido e humilde, emitindo partículas difusiva. O layout simples óptico permite facilmente adicionado para porta lateral de qualquer stand microscópio existente para que ele pode ser combinado com módulos de imagem. Com este protocolo, esperamos que o RT-3D-SPT pode ser que mais amplamente implementado pelos investigadores mais para resolver rápido, três processos biológicos dimensionais.
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Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, dos institutos nacionais de saúde, sob número de prêmio R35GM124868 e pela Duke University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D Electro-optic Deflector | ConOptics | M310A | 2 required |
| Power supply for EOD | ConOptics | 412 | Converts FPGA ouput to high voltage for EOD |
| TAG Lens | TAG Optics | TAG 2.0 | Used to deflect laser along axial direction |
| XY piezoelectric nanopositioner | MadCity Labs | Nano-PDQ275HS | Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in |
| Z piezoelectric nanoposiitoner | MadCity Labs | Nano-OP65HS | Used to move the objective lens to follow the diffusing particle |
| Micropositioner | MadCity Labs | MicroDrive | Used to coarsely position sample and evaluate |
| Objective Lens | Zeiss | PlanApo | High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss |
| sCMOS camera | PCO | pco.edge 4.2 | Used to monitor the particle's position |
| APD | Excelitas | SPCM-ARQH-15 | Lower dark counts beneficial |
| Field programmable gate array | National Instruments | NI-7852r | |
| Software | National Instruments | LabVIEW | |
| Tracking excitation laser | JDSU | FCD488-30 | |
| Lens | ThorLabs | AC254-150-A-ML | L1 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L2 |
| Pinhole | ThorLabs | P75S | PH |
| Glan-Thompson Polarizer | ThorLabs | GTH5-A | GT |
| Half-wave plate | ThorLabs | WPH05M-488 | WP |
| Lens | ThorLabs | AC254-75-A-ML | L3 |
| Lens | ThorLabs | AC254-250-A-ML | L4 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L5 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L6 |
| Dichroic Mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | DC |
| Fluorescence Emission Filter | Chroma | D535/40m | F |
| 10/90 beamsplitter | Chroma | 21012 | BS |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| 190 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/9942 | |
| 110 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/10617 | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-545A | |
| Powermeter | Thorlabs | PM100D | |
| CMOS | Thorlabs | DCC1545M | |
| Iris | Thorlabs | SM1D12D | |
| Microscope | Mad City Labs | RM21 |
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