Summary
Mild intrauterin hypoperfusion producerades av njurartärstenos med metall microcoils virad runt uterin och ovarial artärerna hos råttor på embryonala dag 17. Detta förfarande producerade prenatal hypoperfusion och intrauterin tillväxt begränsning.
Abstract
Intrauterin hypoperfusion/ischemi är en av de viktigaste orsakerna till intrauterin/fostrets tillväxt begränsning, prematur förlossning och låg födelsevikt. De flesta studier av detta fenomen har utförts i antingen modeller med svår intrauterin ischemi eller modeller med gradient grad av intrauterin hypoperfusion. Ingen studie har utförts i en modell på enhetliga mild intrauterin hypoperfusion (MIUH). Två modeller har använts för studier av MIUH: en modell baserad på suturen ligering av endera sidan av arteriell arcade bildade med uterin och ovarial artärerna och en övergående modell baserat på klippning bilaterala cystor artärer och aorta med patency. Dessa två gnagare modeller av MIUH har vissa begränsningar, t.ex. inte alla foster utsätts för MIUH, beroende på deras position i livmoderns horn. I vår MIUH modell utsätts alla foster för en jämförbar nivå av intrauterin hypoperfusion. MIUH uppnåddes genom mild stenos av alla fyra artärer utfodring livmodern, dvs bilaterala uterin och ovarial artärerna.
Arteriell stenos förmåddes av metall microcoils virad runt utfodring artärerna. Producera arteriell stenos med microcoils som tillät oss att styra, optimera och reproducera minskat blodflöde med mycket liten variabilitet och en låg dödlighet, vilket möjliggör noggrann utvärdering. När microcoils med en inre diameter på 0,24 mm användes, blodflödet i både moderkakan och fostret var milt minskade (cirka 30% från nivån före stenos i moderkakan). Avkomma till vår MIUH modell visar tydligt långvariga förändringar i neurologiska, neuroanatomiska och beteendemässiga testresultat.
Introduction
Spädbarn med intrauterin tillväxt begränsning (Genanalys) (kallas även fostrets tillväxt begränsning) (födelse vikt < 10: e percentilen för gestationsålder), prematur förlossning (född på < 37: e graviditetsveckan) och/eller låg födelse vikt (< 2500 g) konto för nästan 10% av alla nyfödda 2,3. Många av dessa spädbarn närvarande med neurologiska problem såsom cerebral pares och utvecklingsstörningar (attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) och lärande störningar) 3,4,5. Dessa villkor har likheter och skillnader i deras etiologi och utfall. Etiologin till Genanalys är multifaktoriell och placenta insufficiens är associerad med intrauterin hypoperfusion anses vara den vanligaste orsaken i icke-avvikande foster 7. Etiologin till prematura är multifaktoriell samt korioamnionit är den vanligaste orsak 8.
Av milda intrauterin hypoperfusion (MIUH) påverkar hjärnans utveckling är oklart. För närvarande innebära tillgängliga djurmodeller av intrauterin hypoperfusion/ischemi främst antingen svår hypoperfusion eller lutning graden av hypoperfusion med eller utan reperfusion 9,10,11. I kliniska inställningar, men anses fall av MIUH vara långt mer frekventerar än de som rör sådana svåra förhållanden. De för närvarande tillgängliga modellerna av MIUH är en gnagare modell som inbegriper suturen ligering av antingen i livmodern eller äggstockarna artär och en gnagare modell som inbegriper klippning bilaterala cystor artärer och aorta med patency 12,13, 14,15,16,17. En av nackdelarna med dessa modeller är omfattande Inter fostret variabiliteten, alltifrån foster med djupgående hypoperfusion till foster med nästan intakt perfusion, beroende på fostret inom den arteriella arcade av kolesterolmetabolism position och ovariell artärer. En annan nackdel med dessa modeller är deras oförmåga att urskilja positionen för varje foster efter födseln. Därför kan inte forskare skilja svårighetsgraden av intrauterin hypoperfusion upplevs av en enskild valp efter dess födelse.
Vi har utvecklat en råtta modell av MIUH som involverar flera artär stenos 1. Inslagning metall mikro-spolar med en inre diameter på 0,24 mm runt äggstockar och livmoder artärerna orsakar stenos, men inte obstruktion, blodkärl (figur 1). Tillämpar dessa microcoils på de proximala delarna av alla artärer som försörjer livmodern, dvs bilaterala uterin och ovarial artärerna, embryonala dag 17 (motsvarande embryonala veckor 20-25 i människor 18) inducerar en betydande men mild minskning blodflödet till moderkakor och foster. Minskningarna i blodflöde efter spolar tillämpas till alla fyra artärer utfodring livmodern är till stor del desamma för varje moderkakan och fostret. Fostret dödligheten är mindre än 20%. Valparna föds via spontana arbete 1-2 dagar tidigare (embryonala dag 21-22) än normalt. Nästan alla valpar föds uppvisar betydligt låg födelsevikt vikter 1. Grå och vit substans volymer är minskade utan uppenbara vävnad skada 1. Pups presenterar med fördröjd förvärv av nyfödda reflexer, muskelsvaghet och förändrad spontan aktivitet 1. Denna modell härmar de kliniska tecken och symtom på barn födda för tidigt eller med Genanalys; barn född prematura uppvisar minskad grå och vit substans volym med eller utan vit substans skada 6, närvarande försenad milstolpar av neurologiska utveckling och kan uppvisa beteendeproblem såsom ADHD 3,5. barn med Genanalys uppvisar minimal neuroanatomiska förändringar, och har en ökad risk för försämrad neurologisk utveckling såsom motorisk och kognitiv försening 4,7. Prematura barn och Genanalys är olika förhållanden, men de två villkor som delar den grundläggande mekanismen, dvs förolämpningar till omogna hjärnor innan fullgången gestationsålder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimenten utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av den experimentella djur vård och användning kommittén av nationella Cerebral och Cardiovascular Center, Suita, Japan.
1. Förbered följande djur och material för MIUH kirurgi
- Förbereda tidsinställda dräktiga Sprague-Dawley-råttor vid graviditetsdiabetes dag 17, dvs embryonala dag 17 (E17). Dammarna genomsnittliga kroppsvikt är 307.0 ± 40,7 g (genomsnitt ± SD, n = 9).
- Förbereda metall microcoils; innerdiameter 0,24 mm, guld-belagd stål.
- Förbered allt material enligt tabell av material.
2. Förbered för MIUH kirurgi
- Värma en värmedyna vid 37 ° C för råtta placering
- Placera en steril blöja på värmedyna
- Varma steril koksaltlösning vid 37 ° C i ett vattenbad
3. utföra MIUH kirurgi
- Utföra kirurgiska ingrepp under sterilt skick. Sterilisera spolar, pincett, nål med 70% etanol innan användning. Använd sterila handskar, och ibland desinficera genom att tillämpa etanol spray.
- Placera råtta i rutan anestesi induktion. Införa 4% isofluran i rutan (ca 5 min).
- Placera råtta på en steril blöja på värmedyna i ryggläge efter djuret är grundligt sövda i rutan induktion. Kontrollera om djup anestesi genom avsaknaden av ett svar på en tå nypa. Upprätthålla 1,5-2,0% isofluran med en Kona.
- Applicera hårborttagningsprodukter skum på buken från naveln ner till regionen av bäcken bågen. Efter flera minuter, torka av hårborttagningsprodukter skummet med en pappershandduk. En rakapparat kan användas som ett substitut för hårborttagningsprodukter skummet.
- Gäller gasväv indränkt i jod desinficerande lösning till regionen avrakade huden.
- Placera en kirurgiska draperi med en rund öppning att täcka buken än området i kirurgiska snittet. Flera bitar av gasbinda kan användas som ett substitut för drapera.
- Med en kirurgisk skalpell görs ett snitt cirka 2,5 cm långa på nedre delen av magen från den övre kanten av blygdbenet rakt upp mot naveln. Sedan, gör ett snitt genom muskel lagret under.
- Placera flera bitar av steril gasbinda runt öppningen av drapera och våt gasväv med värmde saltlösning.
- Skjut båda laterala sidorna av buken försiktigt, så att en del av livmoderns horn framträder från snittet.
- Desinficera kirurgens händer med 70% etanol.
- Dra försiktigt ut hela livmodern horn från bukhålan manuellt utan att använda pincett. Med kirurgisk pincett är inte tillrådligt, eftersom de kan lätt skada ömtåliga livmodern, foster och blodkärlen genom att komprimera dem starkt och ojämnt.
- Placera den livmoderns hornen på våta gasväv.
- Utför samma procedur för andra livmoderns horn.
- Räkna antalet foster.
- Tillämpa värmde saltlösning ofta för att hålla livmodern varm och våt under hela operationen.
- Ändra blöjan när det sugit upp för mycket saltvatten. För att upprätthålla stabilitet, upprepa desinfektion handskar med 70% etanol och tips av instrumentet med jod. Det är avgörande att hålla icke-sterila fingrarna borta från steril tips av instrumentet.
- Identifiera den proximala delen av den huvudsakliga arkaden av äggstockar och livmoder artärerna under ett stereomikroskop.
Obs: Det är viktigt att skilja den huvudsakliga arcade från grenar till moderkakor. Observera att det kirurgiska ingreppet kan vara enklare när livmoderns horn är vänt. Ibland kan är tillämpa en spole på den mycket proximala delen av arkaden svårt, eftersom det ligger djupt in i bukhålan och artärerna till moderkakan ligger mycket nära den proximala delen av arcade. I det här fallet kan en spole tillämpas på en del av arcade efter första gren gafflarna. - Separata artären från venen löper parallellt med det med tången och göra utrymme mellan dem.
- Placera en bit snöre (silk suturen 4.0, 5 cm lång) under artären.
- Lyft upp båda ändarna av strängen med pincett så att artären lyfts och separerade från bräckliga venen.
- Holding i utkanten av microcoil med fin pincett i andra handen, placera en microcoil bredvid den lyfte artären (figur 2.1).
- Rotera lyfte artären med hjälp av strängen runt microcoil för att Linda microcoil runt artär. Det är lättare att rotera artären runt spolen än att rotera spolen runt artär (figur 2.2).
- Efter roterande artären ändra 3 eller 4 varv (spolar har 5 varv), siten som hålls spolen till den andra kanten. Håll i kanten av spolen som varit lindade runt artär med pincett. Ändra platsen där strängen lyfter artären till den andra sidan av spolen. Rotera artären runt spolen så att spolen helt (5 varv) sveper artären (figur 2.3, 2,4).
- Ta bort strängen.
- Utför samma procedur för de andra tre artärerna.
- Observera att tillämpa värmde koksaltlösning till livmodern är ofta avgörande. annars dödligheten bland fostren ökar och hypotermi kan vara nervskyddande.
- Försiktigt tillbaka livmoderns horn i bukhålan. Lyft kanten på bukväggen snittet med pincett kan göra proceduren enklare.
- Stich magmuskelstation och sedan stich bukhuden med sutur (silk suturen 4.0). Knyta suturen efter varje stich, d.v.s. avbrutna enstaka suturer.
- Gäller gasväv indränkt i jod desinficerande lösning på och runt kirurgiska snittet.
- Administrera den analgetiska meloxikam på 0,5 mg/kg kroppsvikt subkutant.
- Möjliggöra 30 min återhämtning i en värmde bur. Kontrollera djur om fullt vaken och flyttar runt buren, tillbaka till buren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter applicering microcoils till alla av artärerna utfodring livmodern, dvs bilaterala uterin och ovarial artärerna, utsätts alla foster för jämförbara nivåer av hypoperfusion. Tillämpningen av microcoils med en inre diameter av 0,24 mm medför mild stenos av dessa artärer, därigenom orsakar en mild minskning av blodflödet till moderkakor och foster (figur 3, cirka 30% från nivån före stenos i moderkakan, se Referens 1 för detaljer). Valpar födda från dammen visar Genanalys (tabell 1).
Dammarna verkar vara nedsatt under några dagar efter operationen. Annat än att dammarna inte presentera någon märkbar komplikationer, och återhämta sig helt i en vecka efter operationen. Dammarna är kunna leva under lång tid efter leverans (dödligheten är 0% för observation period), och till sjuksköterska pups. Spolarna förbli på samma plats.
Tabell 1. Kroppen vikter vid födseln (Postnatal dag 0, P0) och på dag som motsvarar embryonala dag 29 (E29), som var P6-8. Valpar i nr-kirurgi kontrollgruppen var född på E23, medan de i gruppen sham-kirurgi var födda 1 dag tidigare (E22); de i gruppen mild intrauterin hypoperfusion (MIUH) var född 1-2 dagar tidigare (E21-22) via spontana labor. E29 medel var därför P6 till P8 beroende på pup's graviditetsdiabetes period. (n = 8-14 i varje grupp, för varje sex och varje tidpunkt) *P < 0,01 vs. en no-kirurgi kontroll grupp samt en sham-kirurgi-grupp. Envägs ANOVA, följt av ett Tukey-Kramer test.
Figur 1. Schemat för de anatomiska arteriella systemet i livmodern. Fyra microcoils installerades runt artärerna uppströms i bilaterala äggstockar och livmoder artärerna. Prickade pilarna anger riktningen av arteriella blodflödet. Denna siffra har ändrats från den i vår föregående publikation 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Illustration av tillämpningen av en spole på en artär. 1. Lyft upp artären med en sträng. Placera en microcoil bredvid artären. 2. genom att vrida artären runt microcoil, är microcoil lindade runt artären. 3. efter roterande artären ändra 3 eller 4 varv (spolen har 5 varv), siten som hålls spolen till den andra kanten. Håll kanten av spolen tillsammans med artären med hjälp av tången. Ändra platsen där strängen lyfter artären till den andra sidan av spolen. 4. Rotera artären runt spolen så att spolen helt (5 varv) wraps artären. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. En representativ bild av en livmoder produceras med laser speckle flowmetry1. Denna bild visar minskat blodflöde i den vänstra livmoderns hornen men inte höger, efter spole stenos utfördes i vänster äggstockar och livmoder artärerna. *: platser av spole stenos i arkaden i äggstockar och livmoder artärerna; övre asterisken motsvarar den proximala delen av äggstockarna artär och lägre motsvarar den proximala delen av livmodern artär. Streckad linje anger arkaden i äggstockar och livmoder artärerna i vänster livmoderns horn. Rödaktig färg indikerar mer blodflöde, medan blåaktig färg indikerar mindre blodflöde. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den microcoil stenos av både äggstockar och livmoder artärerna i båda livmoderns horn producerar konsekvent och reproducerbart intrauterin hypoperfusion i alla moderkakor och foster. Nivån på hypoperfusion kan ändras med hjälp av microcoils med olika inre diametrar. Råttungar född från en dam som njurartärstenos har utförts med microcoils 0,24 mm i innerdiameter demonstrera Genanalys och för tidig födsel (se referens 1 för detaljer). Pups uppvisar neuroanatomiska och beteendemässiga förändringar som påminner om tecken och symtom som observerats hos prematura barn. Dessa neuroanatomiska förändringar inkluderar ventrikulära utvidgningen, förtunning av cortex och corpus callosum, och minskade hjärnans vikt men inga uppenbara cellförlust eller cystisk lesioner 1. De beteendemässiga förändringarna observerats inkluderar en försenad neonatal reflex, minskad muskelstyrka och förändrad spontan aktivitet 1.
För att studera intrauterin ischemi, är djurmodeller baserat på svår ischemi under en kort tid med reperfusion vanliga 10,11. När båda ändarna av den artär arkad bildas från äggstockar och livmoder artärerna blockeras av klippning, stoppas helt blodtillförseln till livmodern horn (inklusive moderkakor och foster). Därför måste ha kort varaktighet av klippning, eller fostren kommer att dö. I en klinisk miljö, men spekulerar vi att långvarig mild hypoperfusion kan påträffas oftare snarare än abrupt blockad av blodflödet till livmodern och dess fullständig återhämtning inom en timme.
Gnagare modeller som involverar suturen ligering av ena eller båda sidorna av arcade livmodern artären och de som rör klippning som lämnar lite inre utrymme mellan bilaterala cystor artärerna och aorta har varit de endast tillgängliga modellerna av mild förlängd intrauterin hypoperfusion 13,14,16,19,20. Dessa ligering och klippning modeller har låg reproducerbarhet, dvs, bara några foster överleva och lider hypoperfusion. När blodflödet på äggstockarna artär blockeras av suturen ligatur, fostren ligger närmast äggstockarna, dvs överst i livmoderns horn, utsätts för djupgående ischemi, medan fostren ligger närmare till livmoderhalsen och slidan utsätts för minimal eller ingen blodtryckssänkningar levererar 12.
Det finns tre viktiga steg i protokollet. Det är viktigt att identifiera den proximala delen av den huvudsakliga arcade av äggstockar och livmoder artärerna. Den viktigaste arteriella arcade har många grenar till moderkakor. Några av dessa filialen artärer är stor i diameter, och ibland är nästan lika stora som den huvudsakliga artären. Därför kan skilja pulsådern bland flera andra förgrenade artärer vara förvirrande. Observera att den huvudsakliga arteriella arcade inte är stor i diameter. Venen kör bredvid Arkaden är flera gånger större i diameter än artären. Artärer kan bli ännu smalare, på grund av förträngning i kirurgiska stimulering. Separera artären från venen kör parallellt med det är en grannlaga uppgift. Adventitia av artären är i nära kontakt med ven under större delen av arkaden. Tänk på att venen lätt blöder vid beröring av tången. Att hålla livmodern varma och våta är kritisk; annars den dam och foster kan lida av stress och uttorkning, och många foster kan gå förlorad innan leverans. Begränsning av denna spole stenos modell teknik är den långa kirurgiska varaktighet som krävs. En period av cirka 60 min krävs för att slutföra operationen genom att tillämpa fyra spolar. Denna långa kirurgiska varaktighet kan orsaka ytterligare stress att fostren och dammen.
Vi anser att den modell som presenteras i denna uppsats är den mest kliniskt relevanta och reproducerbara modell av MIUH. Denna modell tillåter bedömning av de tidsmässiga och längsgående effekterna av MIUH på Genanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av FY 2013 forskningsprogrammet utbyte mellan JSPS och CNRS, JSPS KAKENHI Grant nummer 26860858 och Narishige neurovetenskap forskningsstiftelsen. Vi tackar Drs. Mariko Harada-Shiba och Kyoko Shioya för bra diskussioner. Vi tackar Mari Furuta, Mutsumi Sakamoto, Ritsuko Maki och Dr Emi Tanaka för utmärkt tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | |||
| Isoflurane anesthesia machine | |||
| Anesthesia induction box | |||
| Heating pad | |||
| Diaper 30x40 cm | |||
| Depilatory foam or shaver | |||
| Iodine disinfectant solution | |||
| Gauze 10x20 cm | |||
| Surgical drape 45x45 cm with a round opening 5 cm in diameter | |||
| Spray bottle with ethanol for disinfection | |||
| Cotton swab | |||
| Forceps with large blunt tips | |||
| Forceps with angled fine tips | |||
| Scissors | |||
| Surgical scalpel, blade size is 27mm long (no.10, Axel, AS ONE Corporation, Osaka, Japan) | |||
| Surgical suture needle | |||
| Metal microcoils; inner diameter 0.24 mm, made from gold-coated steel (SAMINI Co. Ltd., Shizuoka, Japan) | |||
| Silk suture 4-0 | |||
| Sterile saline (0.9% sodium chloride) | |||
| Heating water bath | |||
| Plastic syringes (50ml) and needles (18G) |
References
- Ohshima, M., et al. Mild intrauterine hypoperfusion reproduces neurodevelopmental disorders observed in prematurity. Sci Rep. 6, 39377 (2016).
- Specified Report on Vital Statistics in FY2010, Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan. , Available from: http://www.mhlw.go.jp/english/database/db-hw/FY2010/live_births.html (2010).
- Anderson, P., Doyle, L. W., Victorian Infant Collaborative Study, G. Neurobehavioral outcomes of school-age children born extremely low birth weight or very preterm in the 1990s. JAMA. 289 (24), 3264-3272 (2003).
- Levine, T. A., et al. Early childhood neurodevelopment after intrauterine growth restriction: a systematic review. Pediatrics. 135 (1), 126-141 (2015).
- Sucksdorff, M., et al. Preterm Birth and Poor Fetal Growth as Risk Factors of Attention-Deficit/ Hyperactivity Disorder. Pediatrics. 136 (3), e599-e608 (2015).
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. Lancet Neurol. 8 (1), 110-124 (2009).
- Nardozza, L. M., et al. Fetal growth restriction: current knowledge. Arch Gynecol Obstet. 295 (5), 1061-1077 (2017).
- Chang, E. Preterm birth and the role of neuroprotection. Bmj. 350, g6661 (2015).
- Coq, J. O., Delcour, M., Massicotte, V. S., Baud, O., Barbe, M. F. Prenatal ischemia deteriorates white matter, brain organization, and function: implications for prematurity and cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 58, Suppl 4. 7-11 (2016).
- Jantzie, L. L., Corbett, C. J., Firl, D. J., Robinson, S. Postnatal Erythropoietin Mitigates Impaired Cerebral Cortical Development Following Subplate Loss from Prenatal Hypoxia-Ischemia. Cereb Cortex. 25 (9), 2683-2695 (2015).
- Kubo, K. I., et al. Association of impaired neuronal migration with cognitive deficits in extremely preterm infants. JCI Insight. 2 (10), (2017).
- Delcour, M., et al. Mild musculoskeletal and locomotor alterations in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Int J Dev Neurosci. 29 (6), 593-607 (2011).
- Gilbert, J. S., Babcock, S. A., Granger, J. P. Hypertension produced by reduced uterine perfusion in pregnant rats is associated with increased soluble fms-like tyrosine kinase-1 expression. Hypertension. 50 (6), 1142-1147 (2007).
- Granger, J. P., et al. Reduced uterine perfusion pressure (RUPP) model for studying cardiovascular-renal dysfunction in response to placental ischemia. Methods Mol Med. 122, 383-392 (2006).
- Mazur, M., Miller, R. H., Robinson, S. Postnatal erythropoietin treatment mitigates neural cell loss after systemic prenatal hypoxic-ischemic injury. J Neurosurg Pediatr. 6 (3), 206-221 (2010).
- Olivier, P., Baud, O., Evrard, P., Gressens, P., Verney, C. Prenatal ischemia and white matter damage in rats. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (11), 998-1006 (2005).
- Robinson, S., et al. Developmental changes induced by graded prenatal systemic hypoxic-ischemic insults in rats. Neurobiol Dis. 18 (3), 568-581 (2005).
- Rice, D., Barone, S. Jr Critical periods of vulnerability for the developing nervous system: evidence from humans and animal models. Environ Health Perspect. 108, Suppl 3. 511-533 (2000).
- Basilious, A., Yager, J., Fehlings, M. G. Neurological outcomes of animal models of uterine artery ligation and relevance to human intrauterine growth restriction: a systematic review. Dev Med Child Neurol. 57 (5), 420-430 (2015).
- Delcour, M., et al. Neuroanatomical, sensorimotor and cognitive deficits in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Brain Pathol. 22 (1), 1-16 (2012).
