Summary
Мягкий внутриматочная гипоперфузии производилось стеноза артерии с металлическими microcoils, обернутые вокруг артерий матки и яичников у крыс на эмбриональных день 17. Эта процедура производится дородовой гипоперфузии и Внутриутробное ограничение роста.
Abstract
Внутриутробная гипоперфузии/ишемии является одной из основных причин роста внутриутробного плода/ограничение, преждевременных родов и низкого веса при рождении. Большинство исследований этого явления были выполнены либо модели с тяжелой внутриматочная ишемии или модели с градиента степенью внутриматочная гипоперфузии. Ни в одном исследовании была выполнена в модели на единообразных мягкая внутриматочная гипоперфузии (MIUH). Две модели были использованы для исследований MIUH: модель, основанную на шов лигирование обе стороны артериальная аркада формируется с артерий матки и яичников, и переходные модели, основанной на отсечения двусторонних яичников артерий и аорты, имея проходимость. Эти две грызунов модели MIUH имеют некоторые ограничения, например, не все плодов подвергаются MIUH, в зависимости от их позиции в рога матки. В нашей модели MIUH сопоставимый уровень внутриматочная гипоперфузии подвергаются все плодов. MIUH был достигнут умеренный стеноз всех четырех артерий кормления матки, т.е. двусторонние матки и яичников.
Артерий стеноза было вызвано металла microcoils, обернутые вокруг питания артерий. Производство артерий стеноза с microcoils позволила нам управления, оптимизации и воспроизводить снижение кровотока с очень мало между животных изменчивости и низкой смертности, таким образом позволяя точной оценки. Когда microcoils с внутренним диаметром 0,24 мм были использованы, поток крови в плаценты и плода было слегка сократился (примерно 30% от уровня предварительной стеноза в плаценте). Потомство от нашей модели MIUH наглядно демонстрирует долгосрочные изменения в результаты теста неврологических, нейроанатомический и поведенческие.
Introduction
Младенцы с Внутриутробное ограничение роста (IUGR) (также известный как ограничение роста плода) (вес при рождении < 10-ую персентиль для гестационного возраста), преждевременных родов (родился в < 37 недель гестации), и/или низкой рождение приходится вес (< 2500 г) почти 10% всех новорожденных 2,3. Многие из этих детей представляют неврологических проблем, таких как церебральный паралич и отклонениями (внимание дефицит/гиперактивности (СДВГ) и обучения расстройства), 3,4,5. Эти условия имеют сходства и различия в их этиологии и результаты. Многофакторной этиологии IUGR, и плацентарной недостаточности, связанной с внутриутробной гипоперфузии считается наиболее распространенной причиной в не аномальные плодов 7. Этиология преждевременных многофакторного также и хориоамнионита является наиболее частой причиной 8.
Влияние мягкая внутриматочная гипоперфузии (MIUH) на развивающийся мозг является неясным. В настоящее время доступны животных модели внутриматочная гипоперфузии/ишемии главным образом связаны серьезные гипоперфузии или градиент степень гипоперфузии, с или без реперфузии 9,10,11. В клинических условиях однако, случаи MIUH считаются гораздо чаще, чем те, с участием таких суровых условиях. В настоящее время модели MIUH являются грызунов модели, связанные с перевязкой швов матки или яичников артерии и грызунов модель с участием двусторонних яичников артерий и аорты, имея проходимость 12,13, 14,,1516,17. Один из недостатков этих моделей является обширный изменчивость между плода, начиная от плода с глубоким гипоперфузии плодов с почти нетронутыми перфузии, в зависимости от положения плода в течение артериальной аркада матки и яичников артерий. Еще один недостаток этих моделей является их неспособность различать позицию каждого плода после рождения; Таким образом исследователи не могут различать тяжести внутриматочная гипоперфузии, испытываемых отдельных щенка после его рождения.
Мы разработали модель крыса MIUH с участием нескольких стеноза артерии 1. Упаковка металла микро катушки с внутренним диаметром 0,24 мм вокруг яичников и маточных артерий причины стеноза, но не непроходимость кровеносных сосудов (рис. 1). Применяя эти microcoils на проксимальной части всех артерий поставки матки, т.е. двусторонние матки и яичников, эмбриональных день 17 (эквивалент эмбриональных недель 20-25 людей 18) вызывает значительный, но мягкий снижение кровоснабжение плаценты и плода. Уменьшается в поток крови после того, как катушки применяются для всех четырех артерии, кормления матки в основном же через каждый плаценты и плода. Уровень смертности плода составляет менее 20%. Щенки рождаются через спонтанные труда 1-2 дня ранее (эмбриональных день 21-22), чем обычно. Почти все щенки рождаются экспонируется значительно низким весом 1. Серого и белого вещества объемы снизились без очевидных ткани ущерб 1. Щенков настоящее с задержкой приобретение новорожденных рефлексов, мышечная слабость, и изменены спонтанной активности 1. Эта модель имитирует клинические признаки и симптомы детей, родившихся преждевременно или с ЗВУР; Дети родился недоношенным экспонат сокращены серый и объем белого вещества с или без белого вещества травмы 6, настоящий отложено вехи неврологического развития и может представить поведенческие проблемы, такие как СДВГ 3,5; детей с ЗВУР экспонат минимальный нейроанатомический изменения и имеют повышенный риск нарушения неврологического развития например, мотор и когнитивных задержек 4,7. Преждевременные роды и IUGR являются различные условия, но два условия доля основной механизм, т.е. оскорбления незрелых мозги до полный срок гестации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденным на экспериментальных животных уход и использование Комитета национального мозгового и центр сердечно-сосудистой, Suita, Япония.
1. Подготовьте следующие животных и материалы для MIUH хирургии
- Подготовить приурочен беременных крысах Sprague-Dawley на гестационный день 17, т.е., эмбриональных день 17 (E17). Плотин среднего веса являются 307.0 ± 40.7 g (означает ± SD, n = 9).
- Подготовка металлической microcoils; внутренний диаметр 0,24 мм, изготовленные из стали с покрытием золотом.
- Подготовьте все материалы согласно таблице материалов.
2. подготовить для MIUH хирургии
- Теплая грелка при 37 ° C для размещения Крыса
- Место стерильную пеленку на грелку
- Теплый стерильного физиологического раствора при 37 ° C в ванне с водой
3. выполнить MIUH хирургии
- Выполняйте хирургических стерильных условиях. Стерилизуйте катушек, щипцы, игла с 70% этанол перед использованием. Используйте стерильные перчатки и иногда лечить путем применения этанола спрей.
- Место крыса в поле индукции анестезии. 4% изофлюрановая ввести в поле (примерно 5 минут).
- Место крысы на стерильную пеленку на грелку в лежачем положении после того, как животное тщательно под наркозом в поле индукции. Проверить наличие глубины анестезии, отсутствие реакции на щепотку мыс. Сохранить изофлюрановая 1,5-2,0% с носовой конус.
- Примените для депиляции пены на животе от пупка до региона арку тазовых органов. После нескольких минут протрите депиляционный пены с бумажным полотенцем. Бритва может использоваться в качестве заменителя для депиляционный пены.
- Примените марлей, пропитанной дезинфицирующим раствором йода в регионе депилируемое кожи.
- Место хирургические драпировки с круглым отверстием для покрытия живот помимо области хирургический разрез. Несколько кусочки Марли может использоваться в качестве заменителя для драпировка.
- С помощью хирургического скальпеля, сделать надрез примерно 2,5 см длиной на нижней части живота от верхнего края лобковой кости прямо вверх к пупку. Затем сделайте надрез через слой мышц под.
- Место несколько кусков стерильные марлевые вокруг открытия драпировка и мокрой марлей с утепленным засолены.
- Прижмите обе боковые стороны живота мягко, так, чтобы часть рога матки возникает от разреза.
- Продезинфицируйте руки хирурга с 70% этиловом спирте.
- Осторожно потяните весь рога матки из брюшной полости вручную без использования щипцов. С помощью Щипцы хирургические не рекомендуется, поскольку они могут легко повредить хрупкие матки, плодов и кровеносных сосудов, сжимая их решительно и неравномерно.
- Место рога матки на мокрой марлей.
- Выполните ту же процедуру для других рога матки.
- Подсчитать количество плодов.
- Примените утепленные солевых часто, чтобы сохранить матку теплых и влажных всей операции.
- Измените пеленку, когда она вобрала в себя слишком много физиологического раствора. Для поддержания стабильности, повторите дезинфекции перчатки с 70% этанола и советы инструмент с йодом. Сохраняя нестерильные пальцы вдали от стерильного советы инструмент имеет решающее значение.
- Выявления проксимального отдела главной аркада яичников и маточных артерий под стереомикроскопом.
Примечание: Важно различать основные аркада от отделения плаценты. Обратите внимание, что хирургическая операция может быть проще, когда перевернулся рога матки. Иногда применяя катушки на очень проксимальной части аркады трудно, потому что она находится глубоко в брюшной полости и артерий плаценты находятся очень близко к проксимальной части аркады. В этом случае катушки может применяться к части аркады после первого филиала вилки выкл. - Отдельные артерии от Вены, параллельно к нему с щипцами и пространство между ними.
- Поместите кусок строки (Шелковый шов 4.0, 5 см в длину) под артерии.
- Поднимите обоих концах строки с щипцами, так что артерии приподнимется и отделены от хрупких вен.
- Удерживая край microcoil с тонкой щипцами в другой стороны, место microcoil рядом с нулификацией артерии (Рисунок 2.1).
- Вращайте поднял артерии, используя строку вокруг microcoil обернуть microcoil вокруг артерии. Это проще для поворота артерии вокруг катушки чем вращением катушки вокруг артерии (Рисунок 2.2).
- После вращения артерии 3 или 4 витков (катушки имеют 5 поворачивает), изменить сайт, на котором катушки проводится на другой край. Держите край катушкой, которая была обернута вокруг артерии с щипцами. Измените сайт, на котором строка поднимает артерии на другой стороне бухты. Вращать артерии вокруг катушки так что катушки полностью (5 поворачивает) упаковывает артерии (рис.3, 2.4).
- Удалите строку.
- Выполните ту же процедуру для трех других артерий.
- Обратите внимание, что часто применение утепленные физиологического раствора в матку имеет решающее значение; в противном случае увеличивается уровень смертности плодов и переохлаждение может быть нейропротекторной.
- Осторожно вернуть рога матки в брюшную полость. Подъем края разреза брюшной стенки с щипцами можно упростить эту процедуру.
- Стич мышц живота, а затем Стич брюшной кожи с швом (Шелковый шов 4.0). Галстук шва после каждого Штих, т.е. Прерванный одного шва.
- Примените марлей, пропитанной дезинфицирующим раствором йода на и вокруг хирургический разрез.
- Подкожно администрирование болеутоляющее мелоксикам в 0,5 мг/кг веса тела.
- Разрешить для 30 минут восстановления в клетке утепленные. Проверить животных если полностью проснуться и движущихся вокруг клетки, возвратиться домой клетку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После применения microcoils для всех артерий кормления матки, т.е. двусторонние матки и яичников, подвергаются все плодов сопоставимые уровни гипоперфузии. Применение microcoils с внутренним диаметром 0,24 мм вызывает умеренный стеноз этих артерий, тем самым вызывая мягкий снижение кровотока плаценты и плода (рис. 3; приблизительно 30% от уровня предварительной стеноза в плаценту, см. ссылка 1 для подробной информации). Щенков, рожденных от плотины продемонстрировать IUGR (Таблица 1).
Плотин, как представляется, быть hypoactive в течение нескольких дней после операции. Кроме того плотины не представляют каких-либо заметных осложнений и полностью восстановиться в течение одной недели после операции. Плотин способны жить долгое время после родов (смертность составляет 0% для наблюдения за период) и медсестра щенков. Катушек остаются в том же месте.
Таблицы 1. Тела веса при рождении (послеродовой день 0, P0) и в день эквивалентна эмбриональных день 29 (E29), который был P6-8. Детенышей в группе контроля без хирургия родились E23, тогда как те, в группе Шам хирургия родились 1 день раньше (E22); те, в группе мягкая внутриматочная гипоперфузии (MIUH) родились 1-2 дня раньше (E21-22) через спонтанные труда. Таким образом E29 эквиваленты были P6 P8 в зависимости от гестационного периода щенка. (n = 8-14 в каждой группе для каждого пола и каждый момент времени) *P < 0.01 против без хирургия управления группы, а также группу Шам хирургии. Односторонний дисперсионный анализ, следуют Тьюки Креймер тест.
Рисунок 1. Схема анатомические артериальной системы в матке. Четыре microcoils были установлены вокруг артерий вверх по течению двусторонних яичников и маточных артерий. Пунктирные стрелки указывают направление притока артериальной крови. Эта цифра была изменена от того, в нашей предыдущей публикации 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Иллюстрации применения катушки к артерии. 1. Поднимите артерии со строкой. Место microcoil рядом с артерии. 2. поворотом вокруг microcoil артерии, microcoil оборачивают вокруг артерии. 3. после вращения артерии 3 или 4 витков (катушка имеет 5 поворачивает), изменить сайт, на котором катушки проводится на другой край. Держите края катушки вместе с артерии, используя пинцет. Измените сайт, на котором строка поднимает артерии на другую сторону катушки. 4. Поверните артерии вокруг катушки так что катушки полностью (5 поворачивает) упаковывает артерии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Представитель изображение матки производится с лазерной спекл флоуметрия1. Это изображение показывает снижение кровотока в левый рога матки, но не право, после стеноза катушка была выполнена в левой яичников и маточных артериях. *: местах стеноза катушки в пассаже яичников и маточных артерий; Верхняя звездочка соответствует проксимальной частью яичников артерии, и Нижняя соответствует проксимального отдела маточной артерии. Пунктирная линия показывает аркада яичников и маточных артерий в левый рога матки. Красноватый цвет указывает больше приток крови, а голубоватый цвет меньше поток крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microcoil стеноз яичников и маточных артерий в обоих маточные рожки производит последовательной и воспроизводимые внутриматочная гипоперфузии во всех плаценты и плода. Уровень гипоперфузии могут быть изменены с помощью microcoils с различным внутренним диаметром. Крыса щенков, рожденных от плотины, на котором была выполнена стеноза артерии с microcoils 0,24 мм внутренний диаметр продемонстрировать IUGR и преждевременные роды (см. ссылку 1 для подробной информации). Pups экспонат нейроанатомический и поведенческие изменения, которые напоминают признаки и симптомы, наблюдаемые у недоношенных детей. Эти нейроанатомический изменения включают в себя расширение желудочков, истончение коры и мозолистого тела и снижение веса мозга но не потери очевидным клетки или кистозные поражения 1. Поведенческие изменения наблюдается включают задержки новорожденных рефлекс, снижение мышечной силы и изменены спонтанной активности 1.
Для изучения внутриматочная ишемии, Животные модели, основанные на тяжелой ишемии за короткий срок с реперфузией являются часто используемые 10,11. Когда оба конца аркада артерии, сформированные из яичников и маточных артерий блокируются путем отсечения, кровоснабжение рога матки (включая плаценты и плода) полностью прекращается. Следовательно продолжительность отсечения должен быть коротким, или умрут плодов. В клинических условиях, однако, мы предположить, что длительное мягкая гипоперфузии может более часто встречающихся вместо резких блокады кровоснабжение матки и ее полное восстановление в течение часа.
Грызун модели с участием Перевязка швов одного или обоих приклеиванию аркада маточной артерии и тех, кто с участием отсечения, который оставляет некоторое внутреннее пространство между двусторонним яичников артерий и аорты были доступны только модели мягкой продлен внутриутробная гипоперфузии 13,14,16,19,20. Эти перевязки и отсечения модели имеют низкий воспроизводимости, т.е., только несколько плодов выжить и страдают от гипоперфузии. Когда поток крови в артерии яичников блокируется перевязки швов, плодов, расположен ближе к яичника, то есть, в верхней части рога матки, подвергается глубокой ишемии, тогда как плод, расположенный ближе к шейке матки и влагалища, подвергаются Минимальная или не уменьшается в крови питания 12.
Существует три важнейшие шаги в протоколе. Важно определить Проксимальная часть основных аркада яичников и маточных артерий. Основные артериальной аркада имеет многочисленные отделения плаценты. Некоторые из этих артерий филиал большие в диаметре и иногда почти как большой, как главной артерии. Таким образом различия главной артерии из числа нескольких других ветвления артерии может быть запутанным. Обратите внимание, что основные артериальной аркада не большие в диаметре. Вен, работает рядом с аркада несколько раз больший диаметр, чем артерии. Артерии могут стать даже более узкий, вследствие сужения в ответ хирургическая стимуляция. Разделение артерии из Вены, параллельно он представляет собой деликатную задачу. Адвентиции артерии находится в тесном контакте с вен на протяжении большей части аркады. Имейте в виду, что Вены легко кровоточит при прикосновении щипцами. Сохраняя матки, теплый и влажный является критически важным; в противном случае плотины и плодов могут страдать от стресса и обезвоживания, и многие плод может быть потеряно до родов. Ограничением этой методики модель стенозом катушки является длительных хирургических продолжительности, необходимой. Для завершения операции, применяя четыре катушки требуется в течение приблизительно 60 мин. Этот длительных хирургических продолжительность может вызвать дополнительный стресс плодов и плотины.
Мы считаем, что наиболее клинически соответствующим и воспроизводимые модель MIUH модель, представленная в настоящем документе. Эта модель позволяет для оценки временных и продольные воздействия MIUH на IUGR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана FY 2013 программа исследовательского обмена между JSP и CNRS, JSP-страницы KAKENHI Грант номер 26860858 и Narishige Neuroscience исследовательский фонд. Мы благодарим Drs. Марико Харада-Шиба и Кёко Shioya за полезные дискуссии. Мы благодарим Mari Фурута, Mutsumi Сакамото, Рицуко Маки и доктор Emi Tanaka за отличную техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | |||
| Isoflurane anesthesia machine | |||
| Anesthesia induction box | |||
| Heating pad | |||
| Diaper 30x40 cm | |||
| Depilatory foam or shaver | |||
| Iodine disinfectant solution | |||
| Gauze 10x20 cm | |||
| Surgical drape 45x45 cm with a round opening 5 cm in diameter | |||
| Spray bottle with ethanol for disinfection | |||
| Cotton swab | |||
| Forceps with large blunt tips | |||
| Forceps with angled fine tips | |||
| Scissors | |||
| Surgical scalpel, blade size is 27mm long (no.10, Axel, AS ONE Corporation, Osaka, Japan) | |||
| Surgical suture needle | |||
| Metal microcoils; inner diameter 0.24 mm, made from gold-coated steel (SAMINI Co. Ltd., Shizuoka, Japan) | |||
| Silk suture 4-0 | |||
| Sterile saline (0.9% sodium chloride) | |||
| Heating water bath | |||
| Plastic syringes (50ml) and needles (18G) |
References
- Ohshima, M., et al. Mild intrauterine hypoperfusion reproduces neurodevelopmental disorders observed in prematurity. Sci Rep. 6, 39377 (2016).
- Specified Report on Vital Statistics in FY2010, Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan. , Available from: http://www.mhlw.go.jp/english/database/db-hw/FY2010/live_births.html (2010).
- Anderson, P., Doyle, L. W., Victorian Infant Collaborative Study, G. Neurobehavioral outcomes of school-age children born extremely low birth weight or very preterm in the 1990s. JAMA. 289 (24), 3264-3272 (2003).
- Levine, T. A., et al. Early childhood neurodevelopment after intrauterine growth restriction: a systematic review. Pediatrics. 135 (1), 126-141 (2015).
- Sucksdorff, M., et al. Preterm Birth and Poor Fetal Growth as Risk Factors of Attention-Deficit/ Hyperactivity Disorder. Pediatrics. 136 (3), e599-e608 (2015).
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. Lancet Neurol. 8 (1), 110-124 (2009).
- Nardozza, L. M., et al. Fetal growth restriction: current knowledge. Arch Gynecol Obstet. 295 (5), 1061-1077 (2017).
- Chang, E. Preterm birth and the role of neuroprotection. Bmj. 350, g6661 (2015).
- Coq, J. O., Delcour, M., Massicotte, V. S., Baud, O., Barbe, M. F. Prenatal ischemia deteriorates white matter, brain organization, and function: implications for prematurity and cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 58, Suppl 4. 7-11 (2016).
- Jantzie, L. L., Corbett, C. J., Firl, D. J., Robinson, S. Postnatal Erythropoietin Mitigates Impaired Cerebral Cortical Development Following Subplate Loss from Prenatal Hypoxia-Ischemia. Cereb Cortex. 25 (9), 2683-2695 (2015).
- Kubo, K. I., et al. Association of impaired neuronal migration with cognitive deficits in extremely preterm infants. JCI Insight. 2 (10), (2017).
- Delcour, M., et al. Mild musculoskeletal and locomotor alterations in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Int J Dev Neurosci. 29 (6), 593-607 (2011).
- Gilbert, J. S., Babcock, S. A., Granger, J. P. Hypertension produced by reduced uterine perfusion in pregnant rats is associated with increased soluble fms-like tyrosine kinase-1 expression. Hypertension. 50 (6), 1142-1147 (2007).
- Granger, J. P., et al. Reduced uterine perfusion pressure (RUPP) model for studying cardiovascular-renal dysfunction in response to placental ischemia. Methods Mol Med. 122, 383-392 (2006).
- Mazur, M., Miller, R. H., Robinson, S. Postnatal erythropoietin treatment mitigates neural cell loss after systemic prenatal hypoxic-ischemic injury. J Neurosurg Pediatr. 6 (3), 206-221 (2010).
- Olivier, P., Baud, O., Evrard, P., Gressens, P., Verney, C. Prenatal ischemia and white matter damage in rats. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (11), 998-1006 (2005).
- Robinson, S., et al. Developmental changes induced by graded prenatal systemic hypoxic-ischemic insults in rats. Neurobiol Dis. 18 (3), 568-581 (2005).
- Rice, D., Barone, S. Jr Critical periods of vulnerability for the developing nervous system: evidence from humans and animal models. Environ Health Perspect. 108, Suppl 3. 511-533 (2000).
- Basilious, A., Yager, J., Fehlings, M. G. Neurological outcomes of animal models of uterine artery ligation and relevance to human intrauterine growth restriction: a systematic review. Dev Med Child Neurol. 57 (5), 420-430 (2015).
- Delcour, M., et al. Neuroanatomical, sensorimotor and cognitive deficits in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Brain Pathol. 22 (1), 1-16 (2012).
