Summary
Определение грибковых разнообразия в среде — это метод, используемых в профессиональных медицинских исследований для выявления опасностей для здоровья. Этот протокол описывает экстракции ДНК от профессиональных воздуха образцов для амплификации и последовательности грибковых ее регионов. Этот подход обнаруживает много грибковых видов, которые могут быть пропущены методами традиционной оценки.
Abstract
Традиционные методы выявления грибковых облучения профессиональных средах, таких как культуры и подходы на основе микроскопии, имеют некоторые ограничения, которые привели к исключению многих видов. Достижения в области за последние два десятилетия привели исследователей гигиены обратиться к молекулярной основанные подходы для выявления грибковых опасностей. Эти методы привели к выявлению многих видов в крытый и производственной среды, которые не были обнаружены с использованием традиционных методов. Этот протокол детали подход для определения грибковых разнообразия в воздухе образцы через геномной ДНК добычи, усилители, последовательности и таксономической идентификации грибковых внутренней трансляции распорку (СТС) регионах. ЕГО результаты секвенирования в обнаружении многих грибковых видов, которые не обнаружены или трудно определить на уровне видов, с использованием культуры или микроскопия. Хотя эти методы не обеспечивают количественные показатели грибковых бремени, они предлагают новый подход к идентификации опасностей и может использоваться для определения общей видовое богатство и разнообразие в профессиональной среде.
Introduction
Грибковые облучения в крытый и производственной средах может привести к респираторных заболеваний, включая аллергической сенсибилизации и астмы1. Определение опасностей, грибковых имеет важное значение для оценки рисков и предотвращение воздействия на работников. Эти грибковых опасности может быть результатом крытый заражения, проникновения наружного воздуха или экологические нарушения, которые приводят к перевозки грибковых материалов в районы, где работники являются настоящей2. Методы оценки воздействия грибковых включали выборки жизнеспособных культуры, а также микроскопические идентификация грибковых спор. Эти подходы имеют несколько ограничений и часто упускаем многие грибковых видов, которые могут способствовать общей грибковая бремя3. Подходы, основанные на культуру можно только дифференцировать эти жизнеспособных грибковых организмов, которые можно выращивать на питательных средах. Выявления грибковых спор до уровня видов через микроскопии могут быть confounded, споры, обмена аналогичными морфологии. Оба метода являются сильно зависит от микологи для анализа и выявления грибковых видов, с многих оставшихся неизвестными.
Для улучшения существующих методологий, используемых в профессиональных рисков идентификации и оценки воздействия, многие исследователи обратились к молекулярно-технологий. Подходы на основе виртуализации для оценки микробного разнообразия в крытый и профессиональной среде выявили широкий спектр плесневые столкнулись по сравнению с методами микроскопии и жизнеспособной культуры3,4 ,5. Метод, представленный здесь описывает отбор проб воздуха профессиональной среды и извлечение геномной ДНК для идентификации потенциальных опасностей грибковые. Идентификация опасности осуществляется путем виртуализации ядерной рибосомных внутренней трансляции распорка, или ее, регионы, которые сильно варьируется среди грибов и часто используются для различения плесневые6,7, 8,9. Многие виды найдены в профессиональной настройки, такие, как некоторые виды, принадлежащие к типу Базидиомицеты, не поддаются в жизнеспособные культуре и трудно дифференцировать микроскопически. Эти грибы были отмечены в высокое относительное изобилие в крытый и профессиональной среды, оценку последовательности грибковых ее регионы3,4,10. ЕГО виртуализации предоставляет больше знаний в разнообразие грибов, возникших в крытый и профессиональной среде.
Протокол описанные здесь методы, используемые для сбора, извлекать и усилить грибковых ее регионов от биоаэрозоли для анализа последовательностей детали. Этот подход использует Национальный институт профессиональной безопасности и здоровья (NIOSH) две ступени циклонов аэрозоля сборники для сбора твердых частиц в воздухе. Этот сборник был разработан для сбора биоаэрозоли и отдельный вдыхаемых (аэродинамический диаметр ≤4 мкм) и не вдыхаемых (> 4 мкм аэродинамический диаметр) частицы, которые позволяет для выявления грибковых организмов в пределах помещений, которые являются наиболее скорее всего быть вдыхании работника11. Другие пробоотборники воздуха, включая циклон пробоотборники, доступны на рынке, имеют возможность собирать частицы в вдыхаемых диапазоне (< 4 мкм) с помощью фильтров12,13. В противоположность этому сборники аэрозоля-двухступенчатый циклон NIOSH отделяет грибковых видов, основанный на их аэродинамический диаметр в одноразовые, полипропиленовые трубы, которые могут быть немедленно обработаны для нисходящие приложения14.
Процессы извлечения геномной ДНК и усиливая грибковых регионах ее подробно изложены в настоящем Протоколе. Извлечения представлены были разработаны методологии специально для извлечения геномной ДНК от грибков и бактерий, как многие коммерческие наборы целевой mammalian клеток, бактерии или специально дрожди15. Грунты, используемые в данном исследовании отбираются на основе их общий охват грибковых ее 1 и 2 ее регионов4,5. Последовательность этих регионов позволяет сравнивать многих накренился ее последовательностей, включая те, что последовательность ее 1 региона, ее 2 региона или в ее 1 и 2 ее регионах. Грибковые разнообразие проб воздуха, собранных в крытый настройки с помощью приведены эти методы, выявить значительное число последовательностей, типы, облеченных микологии и микологии, а также другие последовательности, принадлежащих к менее доминирующим грибковых типы, такие как Отдела зигомицетов. Широкое разнообразие грибковых последовательности, определенные с помощью этого подхода будет не захвачен с помощью методологии идентификации традиционные опасности как культивирование или микроскопии. Секвенирования грибковых ее регионов обеспечивает метод расширения для выявления грибковых опасностей и позволяет для лучшего понимания воздействия крытый и профессиональных грибковых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка NIOSH аэрозоля сборники
Примечание: Сборники аэрозоля NIOSH является сборники аэрозоля две ступени циклонов, который собирает биоаэрозоли с помощью двух труб выборки и фильтр из политетрафторэтилена (ПТФЭ).
- Перед Ассамблеей внимательно осмотрите сэмплер. Проверьте сэмплер, чтобы убедиться, что он не поврежден, все винты находятся на месте и уютно и уплотнительной ленты вокруг шов формируется две половинки нетронутыми. Осмотрите сборники уплотнительное кольцо, чтобы убедиться, что он не имеет каких-либо вмятин, трещин или слезы и что он имеет очень тонким слоем силиконовой смазки.
Примечание: Сэмплер включает в себя 37 мм 3 мкм PTFE фильтр в полистироловые или полипропиленовые трехсекционный фильтр кассетный.- Соберите Кассетный фильтр, поместив целлюлозы или пластиковый фильтр поддержки пеленального (с фильтрами) на решетчатой поверхности базового образца (см. Рисунок 1). Используете фильтр щипцы поставить фильтр на верхней части фильтра площадку поддержки коллекции стороной вверх.
- Уплотнение кассеты фильтра, с помощью ручной или Пневматический пресс. Рука закрытие позволит воздух течь вокруг фильтра и уменьшить эффективность. Вставьте кольцевой кусок (капот расширения) и использовать прессу для протолкните его вниз, плотно и равномерно. Нажмите вниз капот расширения на фильтр достаточно плотно, чтобы убедиться, что воздух не протекает вокруг фильтра.
Примечание: Верхняя часть кассеты не используется во время выборки, но должен быть сохранен для покрытия фильтр после завершения отбора проб. - Установите собранный кассеты на вершину сэмплер и протолкните его вниз, насколько это возможно. Оберните кусок ленты 19 мм (3/4 дюйма) вокруг внешней Кассетный фильтр и сборники провести Кассетный фильтр на место и выступать в качестве резервного копирования уплотнение для предотвращения утечек.
- Ввинтите каждую пробирку плотно и полностью в сборники до тех пор, пока она днища и оберните лентой вокруг каждой трубы в качестве вторичного уплотнения против утечки.
Примечание: Первый трубки, 15 мл полипропиленовые трубы, собирает не вдыхаемых частиц с аэродинамическим диаметром > 4 мкм. Второй трубы, Трубы полипропиленовые microcentrifuge 1,5 мл, собирает вдыхаемых частиц между 1 и 4 мкм. Оставшиеся мелкие частицы, < 1 мкм, собраны на PTFE фильтр (см. Рисунок 2).
- Калибровка потока воздуха через NIOSH сборники с банкой калибровки перед каждым использованием, как различия в фильтры и пробоотборники вызовет поток воздуха меняться.
- Чтобы использовать калибровки jar, вставьте кувшин Luer фитинга в верхней части Кассетный фильтр, место сэмплер в банку и печать банку.
- Подключите калибровки jar расходомер калибровки и насос для отбора проб. Включите расходомер и позволить ему теплый на несколько минут. Обратите внимание, что расходомер всегда должна иметь фильтр прилагается к его входе чтобы избежать загрязнения расходомер и сэмплер.
- Включите насос для отбора проб и позволить ему баллотироваться на несколько минут, чтобы согреться и стабилизации.
- Регулировка насоса для задания правильного потока на 3,5 Л/мин.
Примечание: Скорость потока для аэрозоля сборники NIOSH обычно присваивается 3,5 Л/мин. На этой скорости потока сэмплер соответствует критериям ACGIH/ISO вдыхаемых частиц выборки16. Другие скорости потока может использоваться, если размеры различных отсечения желательны или уменьшить уровень шума, но следует знать, что если используется другой расхода, то пробоотборник будет больше не соответствуют вдыхаемых выборки критериям. - Когда калибровка закончена, отключите насос и расходомер.
2. статические и личные аэрозольных проб
- Настройка NIOSH аэрозоля пробоотборник для отбора проб либо личных или статической области.
Примечание: Статические выборки относится к с помощью аэрозоля сборники, пока он присоединен к штатив или другое устройство Холдинг (см. рис. 3), как против личной выборки при сборники и насос монтируются на человека изучается (см. Рисунок 4).- Для статических территориальной выборки, держите изучается пробоотборники как можно ближе к конкретной области. Держите пробоотборники от воздухозаборников, номер входов и места, которые могут быть на пути воздушного потока.
Примечание: Концентрации аэрозолей может значительно изменяться даже на короткие расстояния, особенно если источник аэрозоля в номер17. - Для личного выборки, настроить сборники в зоне дыхания человека. Прикрепите сэмплер отворот, плечо или грудь и поместите насос отбора проб на талии или в рюкзаке.
Примечание: В зоне дыхания обычно считается 30 см полушария, окружающих человека нос, из которой будет нарисована большинство воздуха во время ингаляции17.
- Для статических территориальной выборки, держите изучается пробоотборники как можно ближе к конкретной области. Держите пробоотборники от воздухозаборников, номер входов и места, которые могут быть на пути воздушного потока.
- Убедитесь, что сборники трубы хорошо очищают от заливов сборники и что ничто не препятствует заливов или вмешательства с воздуха в сборники. Сборники трубки должны не пережат или сильно перегнут. Любые блокировки вызовет насос, чтобы остановить.
- Включите насосы. Через минуту или две проверьте, если насосы по-прежнему работает.
Примечание: Проведение воздуха выборки для периодов времени, начиная от как мало, как 10 мин до полного 8 h рабочей смены, в зависимости от окружающей среды10,18,19. Результаты представлены на рисунке 6 , представитель в течение 60 мин выборки в помещении. - После завершения отбора проб воздуха, собирайте образцы труб и фильтров. Удаление Уплотнительная лента, отвинтить трубы и ограничить их. Поместите третья часть фильтр кассетный фильтр. Хранить образцы на 4 ° С до готовности для обработки.
3. Добыча геномной ДНК от пробы воздуха
- Извлечь из каждого этапа NIOSH BC251 сборники геномной ДНК (геномная ДНК). Обработки воздуха, выборки коллекции трубок и отдельно фильтрации для определения вдыхаемых и не вдыхаемых микробной аэрозолей в образце.
Примечание: в качестве альтернативы, трех этапов можно комбинировать и извлечены, если образец посевным материалом слишком мал.- В классе II биологической безопасности кабинета или ламинарного потока чистого скамейке асептически удалите фильтр. Протрите кассеты выборки с использованием 70% этанола и подглядывать выборки кассеты открыть с помощью инструмента кассеты открытие. Используйте фильтр стеклоподъёмника нажать панель фильтра и поддержка вверх. Понять фильтр с помощью фильтра щипцами и поместите его в стерильных Петри. Cut фильтр на 6 равных частей и поместите их в 2 мл усилены тубы 300 мг стеклянные бусины (0,2 - 0,5 мм).
- Поместите трубку, содержащую фильтр в жидком азоте для 30 s и сразу же поместить его в шарик мельница гомогенизатор на 4,5 м/с для 30 s.
- Повторите шаг 3.1.2 один или два раза, до тех пор, пока фильтр измельчается. Небольшие кусочки нетронутыми фильтра могут оставаться. Добавьте 0,5 мл буфера lysis (4 M мочевины, 200 мм трис, 20 мм NaCl, 200 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), рН 7,4).
- Добавление 0,3 мл буфера lysis 15 мл и 1,5 мл воздуха сборники трубы. Вихревой трубе для 10-15 s при вертикальном положении и затем еще 10-15 s перевернутой. Передавать содержимое каждой трубы армированные 2 мл пробирки, содержащие 300 мг стеклянные бусины.
Примечание: Большинство материалов, собранных в каждой тюбике сборники будут накапливаться в верхней части трубки. - Обрабатывать все трубы в гомогенизатор мельница шарик, 4.5 м/с для 30 s и центрифуги их на 20000 x г за 1 мин в 22 ° C. Передача supernatants стерильные 1,5 мл microcentrifuge трубы и центрифуги трубы на 20 000 x g снова за 1 мин в 22 ° C. Повторите этот шаг.
- 30 мкл Реагента лизис (см. Таблицу материалы), для каждой трубки и инкубировать трубы при 37 ° C 15 мин.
- Добавить 0,2 мл буфера привязки (мочевины 10 М, 6 М гуанидина HCl, 10 мм трис-HCl, 20% Тритон X-100, рН 4,4) и протеиназы K (100 мкг/мл) для каждой трубки и инкубировать трубы при 70 ° C для 10 минут добавить 100 мкл изопропанола для каждой трубы.
- Передача решения экстракт в стеклянные волокна фильтра трубки (вместимость 700 мкл) помещены в 2 мл коллекции трубок и центрифуги коллекции трубок на 20000 x g за 30 сек при 22 ° C. Отменить коллекции трубок и поместить фильтр трубы в новой коллекции трубок 2 мл.
- Добавить 0,5 мл ингибитор удаления буфера (5 M гуанидина HCl, 20 мм трис-HCl, рН 6,6, 38% этиловом спирте) к каждой пробке и центрифуги коллекции трубок на 20000 x g за 30 сек при 22 ° C. Отменить коллекции трубок и поместить фильтр трубы в новой коллекции трубок 2 мл.
- Добавить 0,5 мл буфера мытья (20 мм NaCl, 2 мм трис-HCl, pH 7.5, 80% этиловом спирте) к каждой пробке и центрифуги коллекции трубок на 20000 x g за 30 сек при 22 ° C. Отменить коллекции трубок и поместить фильтр трубы в новой коллекции трубок 2 мл. Повторите этот процесс.
- Центрифуга для коллекции трубок на 20000 x g для дополнительного 1 мин при 22 ° C, чтобы удалить любые остаточные мыть буфера. Отменить коллекции трубок и поместить фильтр трубы в новой коллекции трубок.
- Добавить 100 мкл теплый (≥70 ° C) Элюирующий буфер (10 мм трис-HCl, рН 8,5) к каждой пробке и инкубировать их при комнатной температуре на 1-2 мин центрифуги коллекции трубок на 20000 x g за 30 сек при 22 ° C. Передать пробки microcentrifuge стерильные 1,5 мл трубки пустой фильтр и повторно применить элюаты из шага 3.8. Инкубации при комнатной температуре на 1-2 мин центрифуги на 20000 x g за 30 сек при 22 ° C.
Примечание: Элюаты может использоваться непосредственно для шага 4 или хранимой в-20 ° C до готовой к использованию. Геномная ДНК может храниться до одного года при-20 ° C. Рекомендуется, что ДНК храниться при температуре-80 ° C, при необходимости длительного хранения.
4. усиление грибковых рибосомной ДНК
- Используйте универсальные грибковых грунтовки для того чтобы усилить ее регионов 1 и 2 от извлеченного геномная ДНК.
Примечание: Для этого протокола, грунтовка пары Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') используются для предоставления наибольший охват ее регионов4,5. Другие наборы грунт, например те, которые усиливают ITS1 или ITS2 регионов в одиночку, может использоваться.- Настройка полимеразной цепной реакции (ПЦР) для каждого образца, в трех экземплярах 50 мкл реакциях в стерильных 0,5 мл ПЦР трубы или 96-луночных ПЦР планшетов следующим образом: 5 мкл извлеченный шаблон ДНК (шаг 3), 33.3 мкл воды класса PCR, 5 мкл 10 x PCR буфера , 1,5 мкл 50 мм MgCl2, 1 мкл 10 мм 2'-deoxynucleoside 5'-трифосфатов, 0.5 мкл 20 мкм Fun18Sf вперед грунт, 0.5 мкл 20 мкм ITS4R обратный грунтовки и 0,2 мкл полимеразы дна Taq .
- Выполняют реакции в тепловой циклователь: Денатурация при 95 ° C 3 мин; 6 циклов денатурации (96 ° C, 30 s) отжига (50 ° C, 45 s) и выдвижение праймера (72 ° C, 3 мин); 20 циклов денатурации (96 ° C, 30 s), отжига (50 ° C, 45 s) и выдвижение праймера (72 ° C, 1 мин); и выдвижение праймера на 72 ° C для 10 min. держать реакция смеси при температуре 4 ° C до следующего шага.
- Комбинат, что тройные ПЦР-реакции очистить, используя комплект для очистки на основе мембранных кремнезема.
Примечание: Эта процедура позволяет для удаления компонентов ПЦР (грунты, дНТФ, ферменты, соли, и т.д.) и других загрязняющих веществ от амплифицированного ДНК препаратов.- Объединить три реакции для каждого образца (всего 150 мкл) в стерильных 1.5 мл пробирок microcentrifuge. Добавление привязки буфера (5 M гуанидина HCl, 30% изопропиловый спирт) в объеме 5 x (750 мкл) и перемешать раствор, закупорить вверх и вниз по десять раз.
- 450 мкл смеси спина столбцов в коллекции трубок и центрифуги трубы на 17 900 x g для 30 s. отменить фильтратами. Добавить оставшиеся 450 мкл столбцы и центрифуги на 17 900 x g для 30 сек при 22 ° C.
Примечание: Спина столбцы содержат кремний мембраны, которая позволяет для адсорбции ДНК в столбцы. - Отменить фильтратами и добавьте 750 мкл Отмывающий буфер (10 мм трис-HCl, pH 7.5, 80% этиловом спирте) счетчик столбцов. Центрифуга для столбцов в 17 900 g x 30 сек при 22 ° C.
Примечание: Этот процесс удаляет примеси из реакции PCR, упомянутых выше. - Отменить фильтрата и центрифуги пустые столбцы в 17 900 x г за 1 мин в 22 ° C.
Примечание: Этот шаг заключается в удалении любых остаточных отмывающего буфера, который может вмешиваться в нисходящие приложения. - Передать стерильные 1.5 мл пробирок microcentrifuge спин столбцы. 45 мкл буфера (10 мм трис-Cl, рН 8,5) и инкубировать трубы при комнатной температуре на 5 мин центрифуги спин столбцы в 17 900 x г за 1 мин в 22 ° C.
- Сразу использовать eluted дна для шаги 4 и 5 или хранить при температуре от-20 ° C до готовности для использования.
Примечание: Ампликонов может храниться до одного года при-20 ° C. Рекомендуется, что ДНК храниться при температуре-80 ° C, при необходимости длительного хранения.
5. Проверка грибковых его усиления, с помощью электрофореза геля агарозы
- Литой агарозы 1% гель, содержащий 1 бромид ethidium мкг/мл. Растворите агарозы в кипящей 1 x буфер Tris ацетат ЭДТА (ТЭ). После того, как раствор остынет до примерно 50 ° C, добавьте бромид ethidium и вылить в гель бросили.
- После затвердевшим геля агарозы, погружать гель в 1 x TAE и подготовить ампликонов загружаться на геле. До 8 мкл амплифицированного ДНК 2 мкл 5 x загрузки буфера.
Примечание: Эти тома может быть скорректирована в зависимости от концентрации желаемого загрузки буфера. - Загрузите образцы, все 10 мкл, на гель наряду с ДНК лестница для размера ссылкой. Побегите гель на 75 V (6 V/см) для примерно 90 мин и визуализировать полос, обычно наблюдается между 750 и 1000 пар оснований, с использованием ультрафиолетового света (см. Рисунок 5).
6. последовательность и анализ грибковых ее регионов
- Последовательность извлеченные геномная ДНК или усиленные грибковых ее регионов и анализировать последовательности, используя текущий и соответствующие методы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Распределение видов в среде может быть оценена с помощью относительного изобилия, определяя количество клонов каждого OTU, определенных в пробах воздуха. Рисунок 6 -крона единицы, представляющие таксономически размещены видов в помещении после 60 мин отбора проб воздуха. Можно отметить, что среда содержит целый ряд видов в рамках двух основных грибковых типы, микологии и микологии, а также виды, принадлежащие к типу отдела зигомицетов (патогену microsporus). Традиционные методы оценки будут смещены в сторону Аскомицеты видов, как многие Базидиомицеты не culturable или не смогите быть продифференцировано с использованием методов на основе микроскопии. Секвенирование грибковых ее регионов позволяет для обнаружения многочисленных грибковых видов, в частности некоторые Базидиомицеты, которые часто остаются незамеченными. Анализ этой среды показывает, что 68% от грибковых последовательностей, определенных принадлежал Базидиомицеты с большинством из них размещены в порядке грибы.
Таксономическое данные, полученные с помощью подходов на основе последовательности может использоваться для определения таксономического разнообразия в среде. Разнообразие индексов, таких, как те, которые представлены в таблице 1, определить, как богатой окружающей среды является, которое описывает количество видов, определенных в каждом образце, а так же как окружающей среды разнообразна, который учитывает количество видов и обилие каждый. Таблица 1 показывает 1 ЧАО богатство индексов и Шеннон индексы разнообразия для двух закрытых средах. Индексы указывают выше богатство и разнообразие в кондиционерами средах, по сравнению с испарений кулер средах. Кроме того, включены Брей-Кертис несходство коэффициенты. Они описывают как разнородных образцов в рамках окружающей среды относительно видов, определенных в рамках каждой выборки. Образцы в обеих средах, описанных в таблице 1 являются весьма разнородными на 98% и 97% для кондиционера и испарений кулер среды, соответственно.
Рисунок 1: Схематическое представление сборки трехсекционный фильтр кассетный. Кассетный фильтр состоит из трех частей: верхней или крышка кусок (вход), расширение капота и базовый кусок (выход). Подушка опоры и фильтр размещаются на решетчатой поверхности базового образца. Капот расширения затем опечатаны на базу, с помощью ручной или Пневматический пресс. Для использования с NIOSH Биоаэрозоль циклон сэмплер верхняя часть остановились во время отбора проб и затем заменяется для хранения и транспортировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Схематическое изображение NIOSH Биоаэрозоль циклон сэмплер. Сборники аэрозоля циклон NIOSH собирает воздухе частиц путем нагнетания воздуха в сборники через вход и производит циклона, отложений частиц на стене пробоотборные трубки. Воздух сначала рисуется в 15 мл полипропиленовые трубы, где большие частицы (> 4 мкм) собирают на стенках трубы. Воздух затем течет из первой трубки и обращается в 1,5 мл microcentrifuge трубку, где собирают мелкие частицы (1-4 мкм). Остальные частицы (< 1 мкм) собирать на PTFE фильтр как воздух всасывается из пробоотборника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: пример настройки статического сэмплер. Изображение демонстрирует пробоотборники для статических территориальной выборки. NIOSH Пробоотборники устанавливаются до сбора 40 дюймов (102 см) и 60 дюймов (152 см) от пола, представляющие высот сидя и стоя взрослого, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: пример личного сборники Ассамблеи. Изображение иллюстрирует NIOSH сэмплер, носили индивидуума на рюкзак. Сборники и питания коммутатора расположены на лямках пакета, а насос отбора проб расположен в рюкзак, сам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Пример визуализации гель агарозы усиливается ее ДНК от пробы воздуха. На изображении показана ДНК полосы между 750 и 1000 пар оснований. Эти группы представляют усиливается грибковых ее регионы от извлеченного воздуха образцов. ЕЕ регионах варьируется в зависимости от видовой принадлежности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: пример крона диаграммы представления таксономически помещены грибковых видов, определенных в помещении. Крона диаграмма изображает относительное обилие грибковых видов, обитающих в 4 пробах из домов после периода отбора проб воздуха 60 мин с NIOSH Биоаэрозоль циклон сэмплер. 68% выявленных видов принадлежат к Фила Базидиомицеты с остальные принадлежащие Аскомицеты (33%) и отдела зигомицетов (1%). Наиболее распространенным ее последовательности в этой среде принадлежал ордену грибы и были определены как Phanerodontia chrysosporium и Gelatoporia Дихроа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Богатство ЧАО-1 | Шеннон разнообразие | Брей Кертис расстояние | |
| Среднее (мин, Макс.) | Среднее (мин, Макс.) | Среднее (мин, Макс.) | |
| Кондиционер (n = 9) | 33.86 (15,0, 102.0) | 1.39 (0,68, 2.51) | 0.9778 (0.8313, 1.00) |
| Испарительный охладитель (n = 10) | 25.46 (12,5, 49,5) | 1.10 (0,50, 1.72) | 0.9624 (0.3804, 1.00) |
Таблица 1: пример данных, представляя разнообразие видов и богатство индексов, сравнивая помещениях. В таблице 1 ЧАО богатство индексы (количество видов на сэмпл), индексы разнообразия Shannon (количество видов) и обилие каждого и Брей-Кертис несходство коэффициенты (как разнородных видов распределяются между выборками по шкале 0 - 1). Эти данные свидетельствуют о более богатство и разнообразие в кондиционерами сред и высоких различие среди образцов в обеих средах. Эта таблица была изменена из лимонов и др. 10 с разрешения Королевского общества химии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Определение грибковых разнообразия в профессиональной среде, используя подходы, основанные на последовательности улучшилась идентификации и воздействия оценки грибковых опасности. Используя этот подход позволил для выявления многих дополнительных грибковых видов, которые часто не обнаруживаются с помощью культуры или микроскопия основе методов оценки. Здесь представлен метод отбора проб биоаэрозоли от профессиональных и крытый сред и добыча геномной ДНК из проб воздуха для его усиления и последовательности. Сильно зависит от определений грибковых разнообразия с помощью этих методов: образцы (1) успешного и полного извлечения геномной ДНК из воздуха, (2) усиление геномная ДНК с праймерами, которые позволяют для сравнения усиливается ее последовательности накренился последовательности в базу данных и предел усиления предубеждения и (3) правильно таксономической идентификации последовательностей в пределах базы данных.
Успешной геномной ДНК добычи зависит от методики экстракции и реактивы, используемые в исследовании. Как указано в протоколе, много биоаэрозоли и других биологических и небиологических частиц, собранных в трубку фазы сборники две ступени циклонов NIOSH собирать в верхней части трубки. Это очень важно, что трубы тщательно открыт при добавлении литического буфера не терять любой частицы и что они быть vortexed таким образом, который позволяет для всех частиц попасть в буфер lysis (справа вверх и вверх вниз). Важно также и то, что фильтр быть тщательно обработаны с помощью асептических методов не сорвать любые биоаэрозоли, собрали на поверхности до извлечения или ввести загрязняющих ДНК. Было продемонстрировано, что существует большое количество вариации между многими из коммерчески доступных геномной ДНК извлечения наборы15. Некоторые извлечения процедуры уклон в сторону конкретных видов грибковых и результат в той или иной ДНК дает20. Если доходность ДНК, после извлечения низкая, выше реплицирует реакции PCR может выполняться. Не только меняют извлечения урожайности, но многие из этих комплектов вносить значительное количество контаминацию ДНК. По этой причине важно включать надлежащий контроль на протяжении всей процедуры для выявления и устранения потенциальных реагента примеси из анализа.
ЕГО усиления является еще одним критическим шагом протокола. Методики извлечения может варьироваться в их способности удалять ингибиторы ПЦР из экологических проб. Это особенно касается с окружающей пыли образцы21. Амплификации PCR образцов, извлеченные с помощью метода, представленные здесь выставлены ингибитирование некоторых PCR после добавления 10 мг пыли15. Хотя ПЦР ингибирование имеет наибольшую озабоченность в пробах окружающей среды пыли, он все еще должен быть рассмотрение при усилении ДНК, извлеченные из проб воздуха для определения грибковых разнообразия. PCR праймер, используемую в этом методе обеспечивает охват ее 1 и 2 ее регионов. Это позволяет для сравнения, многие из последовательностей, помещены в базах данных последовательности. Как и в случае с процедурой извлечения, многие усилители и грунтовка предубеждения были ранее описанных22. Грибковые генома размер и Джин номер копии также могут оказывать влияние его усиления23. Эти предубеждения должны учитываться при интерпретации данных результирующей последовательности. Таксономической идентификации ее последовательностей является, пожалуй, наиболее важным компонентом этого метода. Важно сохранить согласованность критериев идентификации. Способность определить свои последовательности зависит от последовательности, накопленные в базах данных. Многие последовательностей не могут быть идентифицированы на уровне видов. Имея конкретные критерии при принятии таксономической идентификации основе складированные последовательности, как процент личность предохранители, имеет решающее значение для поддержания наборы данных последовательно от исследования для изучения.
По сравнению с традиционной оценке подходов, извлечение и секвенирования грибковых ДНК пробы профессиональных воздуха обеспечивает более полное представление грибковых разнообразия в среде. Помимо ограничения, обсуждавшиеся выше необходимо отметить, что результаты этих видов анализов полуколичественного в отличие от культуры, споро счетчиков или количественного PCR24 , может принести количественных данных. Виртуализация данных может использоваться для определения относительного изобилия на сэмпл, а также рассчитать метрики грибковых разнообразия. Эти методы может использоваться в сочетании с другими методами, как ПЦР, чтобы получить больше поддающихся количественной оценке данных. Наборы данных, созданные с помощью этих подходов может использоваться в профессиональных медицинских исследований для лучшего понимания грибковых опасностей в конкретных условиях труда. Разработка более стандартизированной, лучше характеризуют и сравнить исследования, основанные на последовательности, грибковых разнообразия необходимы подходы добычи и грунтовка отбора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Результаты и выводы в настоящем докладе, принадлежат авторам и не обязательно отражают официальную позицию национального института профессиональной безопасности и здравоохранения, центры по контролю и профилактике заболеваний.
Acknowledgments
Эта работа частично поддержали межведомственного соглашения между NIOSH и NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
References
- Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
- Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
- Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
- Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
- Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
- Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).
- Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).
- Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
- Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
- Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
- Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).
- Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
- Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
- ACGIH. Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).
- Rodes, C. E., Thornburg, J. W. Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. Ruzer, L. S., Harley, N. H. , CRC Press. (2005).
- Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
- Couch, J., et al. Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).
- Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
- Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
- Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
- Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
- Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).
