Summary
Determinación de la diversidad fúngica dentro de un entorno es un método utilizado en los estudios de salud ocupacional para identificar riesgos para la salud. Este protocolo describe la extracción de ADN de muestras de aire ocupacional para la amplificación y secuenciación de regiones ITS hongos. Este método detecta muchas especies de hongos que pueden ser pasada por alto por los métodos de evaluación tradicionales.
Abstract
Los métodos tradicionales de identificación de hongos exposición en ambientes laborales, como cultura y enfoques basados en la microscopía, tienen varias limitaciones que han dado lugar a la exclusión de muchas especies. Avances en el campo durante las últimas dos décadas han llevado a los investigadores de salud recurrir a enfoques moleculares para la identificación de riesgos de hongos. Estos métodos han resultado en la detección de muchas especies dentro de ambientes de interiores y profesionales que no han sido detectados usando métodos tradicionales. Los datos de este protocolo muestras un enfoque para determinar la diversidad fúngica en aire a través de la extracción de ADN genómica, amplificación, secuenciación identificación taxonómica de hongos interno transcribieron regiones del espaciador (ITS). LOS resultados de la secuenciación en la detección de muchas especies de hongos que son no detectado o difíciles de identificar a nivel de especie mediante cultivo o microscopia. Mientras que estos métodos no proporcionan medidas cuantitativas de la carga fúngica, ofrecen un nuevo enfoque para la identificación de los peligros y puede utilizarse para determinar la riqueza total de especies y la diversidad dentro de un entorno laboral.
Introduction
Exposiciones de hongos en ambientes de interior y trabajo pueden causar morbilidades respiratorias, incluida la sensibilización alérgica y asma1. Identificación de los riesgos de hongos es importante para evaluar el riesgo y prevenir la exposición de los trabajadores. Estos peligros de hongos pueden ser el resultado de contaminación interior, intrusión de aire exterior o perturbaciones ambientales ocurridos en el transporte de materiales fungicidos en áreas donde los trabajadores están presentes2. Métodos para evaluar la exposición de hongos han incluido muestreo de cultura viable así como identificación microscópica de las esporas de hongos. Estos enfoques tienen varias limitaciones y a menudo pasan por alto muchas especies de hongos que podrían contribuir a la carga fúngica total3. Enfoques basados en la cultura sólo pueden distinguir los organismos fúngicos viables que pueden ser cultivados en medios nutritivos. Identificación de esporas de hongos a nivel de especie mediante microscopia puede ser confundido por esporas comparten morfologías similares. Ambos métodos son altamente dependientes de micólogos para analizar e identificar la especie fúngica, con muchos restantes no identificados.
Para mejorar metodologías existentes utilizados en identificación de riesgos laborales y evaluaciones de la exposición, muchos investigadores han recurrido a las tecnologías moleculares. Enfoques basados en la secuencia para evaluar la diversidad microbiana en ambientes de interior y trabajo han revelado un espectro más amplio de especies fúngicas encontradas en comparación con métodos como la microscopía y cultivo viable3,4 ,5. El método presentado aquí describe el muestreo de aire de ambientes laborales y la extracción de ADN genómico para la identificación de riesgos potenciales de hongos. Identificación de riesgos se logra mediante la secuenciación de regiones que son altamente variables entre los hongos y se han utilizado comúnmente para distinguir especies de hongos6,7, el espaciador transcrito interno ribosomal nuclear, o su, 8,9. Muchas especies encuentran en ajustes ocupacionales, tales como algunas especies pertenecientes al phylum Basidiomycota, no son identificables en la cultura viable y son difíciles de diferenciar microscópicamente. Estos hongos se han observado en la alta abundancia relativa dentro de ambientes interiores y ocupacionales determinado por la secuencia hongos ITS regiones3,4,10. SU secuenciación ha proporcionado un mayor conocimiento en la diversidad de hongos encontrados en ambientes de interior y trabajo.
El protocolo descrito aquí detalles de los métodos usados para recolectar, extraer y amplificar regiones de su fungicidas de bioaerosoles para análisis de la secuencia. Este enfoque utiliza el Instituto Nacional de seguridad ocupacional y salud (NIOSH) sampler de aerosol de ciclón de dos etapas recoger las partículas en el aire. Este muestreador se desarrolló para recoger los bioaerosoles y respirable se separa (≤4 μm de diámetro aerodinámico) y no-respirables (> 4 μm de diámetro aerodinámico) las partículas, que permite la identificación de organismos fúngicos dentro de ambientes interiores que son los más probabilidades de ser inhalada por un trabajador11. Otros muestreadores de aire, incluyendo samplers de ciclón, están disponibles en el mercado que tienen la capacidad para recoger las partículas dentro de la gama respirable (< 4 μm) usando filtros de12,13. Por el contrario, el sampler de aerosol del ciclón de dos etapas NIOSH separa especies fúngicas basadas en su diámetro aerodinámico en tubos de polipropileno, desechables que pueden ser procesados inmediatamente para aplicaciones posteriores14.
Los procesos de extracción de DNA genómico y amplificación de las regiones de su fungicidas se detallan en el presente Protocolo. Las metodologías de extracción presentadas han sido desarrolladas específicamente para la extracción de ADN genómico de hongos y bacterias, como muchos kits comerciales dirigidos a células de mamíferos, bacterias o específicamente de levaduras15. Los cebadores utilizados en este estudio se seleccionan según su cobertura global de los hongos ITS 1 y 2 sus regiones4,5. La secuencia de estas regiones permite la comparación de muchas secuencias de sus bancos, los incluidos esa secuencia la región su 1, 2 de su región o regiones el su 1 y 2 su. La diversidad fúngica de muestras de aire recogidas en un ajuste interior utilizando que estos métodos se muestran, revelando un número importante de secuencias a lo phyla Ascomycota y Basidiomycota, así como otras secuencias pertenecientes a los phyla fungicida menos dominante, tales como Zygomycota. La amplia diversidad de hongos secuencias identificados con este enfoque no sería capturar utilizando metodologías de identificación de riesgo tradicionales como cultivo o microscopia. Secuenciación de regiones ITS hongos proporciona un método mejorado para identificar riesgos de hongos y permitir una mejor comprensión de las exposiciones de hongos interiores y trabajo.
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Protocol
1. preparación de la muestra de aerosol NIOSH
Nota: La muestra de aerosol NIOSH es un dechado de aerosol de ciclón de dos etapas que recoge bioaerosoles utilizando dos tubos de muestreo y un filtro de politetrafluoroetileno (PTFE).
- Antes del montaje, inspeccione con cuidado el muestreador. Compruebe el sampler para asegurarse de que no se daña, todos los tornillos estén colocadas y esté ajustada y el precinto alrededor de la costura formado por las dos mitades está intacta. Inspeccione el dechado junta tórica para que no tengan cualquier mellas, grietas o desgarros y que tiene una muy ligera capa de grasa de silicona.
Nota: El sampler incluye un filtro PTFE de 37 mm 3 μm en un casete de filtro tres piezas polipropileno o poliestireno.- Montar el cartucho de filtro colocando una celulosa o plástico almohadilla de apoyo (incluida con los filtros) en la superficie cuadriculada de la pieza base (ver figura 1). Utilizar filtro pinzas para colocar el filtro sobre la almohadilla de apoyo con la colección hacia arriba.
- Sellar los cartuchos del filtro utilizando una prensa manual o neumática. Cierre de mano permitirá que el aire alrededor del filtro y reducir la eficacia de la colección. Introducir la pieza en forma de anillo (la chimenea de la extensión) y utilice la prensa para empujar hacia abajo firmemente y de manera uniforme. Presione hacia abajo la chimenea de la extensión en el filtro lo suficientemente bien como para no tener fugas de aire alrededor del filtro.
Nota: La pieza superior del cassette no se utiliza mientras que muestras pero para cubrir el filtro una vez completada la toma de muestras se debe guardar. - Montar el casete montado en la parte superior del muestreador y empújela hacia abajo tanto como sea posible. Envolver un trozo de cinta de 19 mm (3/4 pulgada) alrededor del exterior del cartucho de filtro y sampler mantenga el cartucho de filtro en su lugar y actuar como un sello de copia de seguridad para evitar fugas.
- Atornille cada tubo firme y completamente en el sampler hasta y envolver cinta alrededor de cada tubo para actuar como un sello secundario contra fugas.
Nota: El primer tubo, un tubo de polipropileno de 15 mL, recoge las partículas no-respirables con un diámetro aerodinámico de > 4 μm. El segundo tubo, un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1.5 mL, recoge las partículas respirables entre 1 y 4 μm. Las partículas más pequeñas restantes, < 1 μm, se recogen en el PTFE filtro (ver figura 2).
- Calibrar el flujo de aire a través del sampler NIOSH con un tarro de calibración antes de cada uso ya que el flujo de aire variar las diferencias en los filtros y los samplers.
- Para utilizar un recipiente de calibración, insertar conexión de Luer de la jarra en la parte superior del cartucho de filtro, colocar el muestreador en la jarra y sellar la jarra.
- Conecte el recipiente de calibración de un medidor de flujo de calibración y la bomba de muestreo. Encienda el medidor de flujo y deje que se caliente por unos minutos. Tenga en cuenta que el medidor de flujo debe tener siempre un filtro conectado a su entrada para evitar contaminar el medidor de flujo y el sampler.
- Encienda la bomba de muestreo y déjelo funcionar durante unos minutos calentar y estabilizar.
- Ajustar la bomba para fijar el caudal correcto a 3,5 L/min.
Nota: El caudal para el sampler de aerosol NIOSH se establece generalmente a 3,5 L/min. En este flujo, el muestreador se ajusta a los criterios de la ACGIH/ISO para muestreo de partículas respirables16. Otras tasas de flujo pueden utilizarse si el corte diferentes tamaños se desean o para reducir el nivel de ruido, pero ten en cuenta que si se utiliza un caudal diferente, entonces el sampler ya no cumplirá los criterios de muestreo respirable. - Cuando la calibración haya terminado, apague la bomba y el medidor de flujo.
2. muestreo de aerosoles estática y personal
- Configurar el dechado de aerosol NIOSH para cada muestreo de área personal o estático.
Nota: Muestreo estático se refiere al uso de la muestra de aerosol mientras está conectado a un trípode u otro dispositivo de retención (ver figura 3), como contra el personal de muestreo cuando el sampler y la bomba están montados sobre la persona estudiada (ver figura 4).- Para el muestreo de área estática, seguirán estudiando los samplers tan cerca como sea posible para el área específica. Mantenga los muestreadores de entradas de aire, entradas de habitación y lugares que podrían estar en la ruta del flujo de aire.
Nota: Las concentraciones de Aerosol pueden variar considerablemente incluso en distancias cortas, especialmente si la fuente de aerosoles está en la sala17. - Para el muestreo personal, configurar el muestreador en la zona de respiración de la persona. Colocar el muestreador a la solapa, hombros o pecho y coloque la bomba de muestreo en la cintura o en una mochila.
Nota: La zona de respiración se supone comúnmente que un hemisferio de 30 cm alrededor de la nariz de una persona de que se extrae la mayoría del aire durante la inhalación17.
- Para el muestreo de área estática, seguirán estudiando los samplers tan cerca como sea posible para el área específica. Mantenga los muestreadores de entradas de aire, entradas de habitación y lugares que podrían estar en la ruta del flujo de aire.
- Asegúrese de que el muestreador de tubo es bien claro de las tomas de muestras y que nada es obstruir las entradas de o interferir con el flujo de aire en el sampler. El muestreador de tubo no está aplastado o doblado. Cualquier bloqueo hará que la bomba se detenga.
- Activar las bombas. Después de uno o dos minutos, comprobar si las bombas están funcionando todavía.
Nota: Conducta aire muestreo por periodos de tiempo que van desde tan sólo 10 minutos a un turno de trabajo completo de 8 h, dependiendo del medio ambiente10,18,19. Los resultados presentados en la figura 6 son representativas de un período de muestreo de 60 min en un ambiente interior. - Después de completa el muestreo de aire, recoger los tubos de muestra y el filtro. Quitar el precinto, desenroscar los tubos y la tapa les. Poner la tercera pieza de la casete de filtro sobre el filtro. Almacenar las muestras a 4 ° C hasta que esté listo para el proceso.
3. extracción de DNA genómico de muestras de aire
- Extraiga el DNA genómico (gDNA) de cada etapa del NIOSH BC251 sampler. Proceso el tubos de muestreo de aire y filtro por separado para permitir la determinación de aerosoles microbianos respirables y no-respirables en la muestra.
Nota: Como alternativa, las tres etapas pueden combinar y extrae si inóculo de la muestra es demasiado pequeña.- En una clase de gabinete de seguridad biológica II o banco limpio del flujo laminar, asépticamente Retire el filtro. Limpie el cartucho de muestreo utilizando etanol al 70% y palanca el cassette de muestreo utilizando una herramienta de apertura de cassette. Utilice un elevador de filtro para Presione la almohadilla del filtro y hacia arriba. Agarre el filtro con unas pinzas de filtro y colocar en una placa Petri estéril. El filtro de corte en 6 partes iguales y colocarlos en un tubo de 2 mL reforzado que contiene perlas de vidrio de 300 mg (0.2 - 0.5 mm).
- Coloque el tubo que contiene el filtro en nitrógeno líquido durante 30 s y colocar inmediatamente en un homogeneizador de molino de grano a 4,5 m/s a 30 s.
- Repita el paso 3.1.2 una vez o dos veces hasta que el filtro está destrozado. Pueden quedar pequeños trozos de filtro intacto. Agregar 0,5 mL de tampón de lisis (urea de 4 M, 200 mM Tris, 20 mM de NaCl, ácido etilendiaminotetracético de 200 mM (EDTA), pH 7,4).
- Agregar 0,3 mL de tampón de lisis a los 15 mL y tubos de muestras de aire de 1,5 mL. Vórtice el tubo 10-15 s, mientras que en posición vertical y luego otro 10-15 s invertida. Transferir el contenido de cada tubo a los tubos 2 mL reforzado que contiene perlas de vidrio de 300 mg.
Nota: la mayor parte del material recogido en cada tubo del muestreador se acumulará en la parte superior del tubo. - Procesar todos los tubos en el homogenizador de molino de grano a 4,5 m/s de 30 s y centrifugue a 20.000 x g durante 1 min a 22 ° C. Transferencia de sobrenadantes a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estéril y centrifugar los tubos a 20.000 x g otra vez durante 1 min a 22 ° C. Repita este paso.
- Añadir 30 μl de reactivo de lisis (véase Tabla de materiales) a cada tubo e incubar los tubos a 37 ° C durante 15 minutos.
- Añadir 0,2 mL de tampón de unión (10 M urea, guanidina-HCl de 6 M, 10 mM Tris-HCl, 20% Tritón X-100, pH 4.4) y proteinasa K (100 μg/mL) a cada tubo e incubar los tubos a 70 ° C por 10 minutos añadir 100 μl de isopropanol a cada tubo.
- Transferir las soluciones de extracto fibra filtro tubos de vidrio (capacidad de 700 μL) en tubos de 2 mL y centrifugar los tubos de la colección a 20.000 x g durante 30 s a 22 ° C. Deseche los tubos y colocar los tubos de filtro en nuevos tubos de recogida de 2 mL.
- Añadir 0,5 mL de tampón de extracción de inhibidor (5 M guanidina-HCl 20 mM Tris-HCl, pH 6.6, 38% de etanol) a cada tubo y centrifugar los tubos de la colección a 20.000 x g durante 30 s a 22 ° C. Deseche los tubos y colocar los tubos de filtro en nuevos tubos de recogida de 2 mL.
- Añadir 0,5 mL de tampón de lavado (20 mM de NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7,5, etanol al 80%) a cada tubo y centrifugar los tubos de la colección a 20.000 x g durante 30 s a 22 ° C. Deseche los tubos y colocar los tubos de filtro en nuevos tubos de recogida de 2 mL. Repita este proceso.
- Centrifugar los tubos a 20.000 x g durante un 1 minuto adicional a 22 ° C para eliminar cualquier tampón de lavado residual. Deseche los tubos y colocar los tubos de filtro en nuevos tubos de recogida.
- Añadir 100 μl tampón de elución (≥70 º C) (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) a cada tubo de caliente y ellos incubar a temperatura ambiente durante 1-2 min centrifugar los tubos a 20.000 x g durante 30 s a 22 ° C. Transferir los tubos de vacío del filtro a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril y vuelva a aplicar eluatos de paso 3.8. Incubar a temperatura ambiente durante 1-2 min centrífuga a 20.000 x g durante 30 s a 22 ° C.
Nota: Eluidos pueden utilizarse inmediatamente para el paso 4 o almacenado a-20 ° C hasta que esté listo para usar. ADN genómico puede conservarse hasta un año a-20 ° C. Se recomienda almacenar ADN a-80 ° C, si se requiere el almacenamiento a largo plazo.
4. amplificación de ADN ribosomal de hongos
- Utilizar cebadores universales hongos para amplificar las regiones 1 y 2 del gDNA extraído.
Nota: Para este protocolo, el primer par Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') se utilizan para proporcionar la mayor cobertura de sus regiones4,5. Otros conjuntos de la cartilla, como los que amplifican las regiones ITS1 o ITS2 solas, se pueden utilizar.- Crear reacciones en cadena de polimerasa (PCR) para cada muestra por triplicado 50 μl las reacciones en tubos PCR de 0,5 mL estéril o placas de PCR de 96 pocillos como sigue: 5 μl de plantilla extraído ADN (del paso 3), 33,3 μl de agua de grado PCR, 5 μl de buffer de x PCR 10 , 1.5 μl de MgCl2de 50 mM, 1 μl de 10 mM deoxynucleoside de 2'-5'-trifosfatos, 0,5 μl de cebador forward de 20 μm Fun18Sf, 0,5 μl de cebador inverso de 20 μm ITS4R y 0,2 μl de Taq ADN polimerasa.
- Realizar reacciones en un termociclador: desnaturalización a 95 ° C por 3 min; 6 ciclos de desnaturalización (96 ° C, 30 s) recocido (50 ° C, 45 s) y extensión de la cartilla (72 ° C, 3 min); 20 ciclos de desnaturalización (96 ° C, 30 s), recocido (50 ° C, 45 s) y la extensión de la cartilla (72 ° C, 1 min); y extensión de la cartilla a 72 ° C durante 10 minutos la mezcla de reacción a 4 ° C hasta el siguiente paso.
- Se combinan que las reacciones de PCR por triplicado purifican mediante un kit de purificación con membranas de sílice.
Nota: Este procedimiento permite la eliminación de los componentes de la PCR (cartillas, dNTPs, enzimas, sales, etcetera) y otros contaminantes de las preparaciones de ADN amplificadas.- Combinan las tres reacciones para cada muestra (total 150 μL) en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estéril. Añadir el tampón de unión (guanidina-HCl de 5 M, 30% isopropanol) en un volumen de 5 x (750 μL) y mezclar la solución mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces.
- Añadir 450 μl de la mezcla a girar columnas en tubos y centrifugar los tubos a 17.900 x g durante 30 s. descarte los filtrados. Añadir el resto 450 μl a las columnas y centrifugue a 17.900 x g durante 30 s a 22 ° C.
Nota: Las columnas spin contienen una membrana de silicona que permite la adsorción del DNA a las columnas. - Deseche los filtrados y añadir 750 μl de tampón de lavado (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 80% de etanol) a las columnas de la vuelta. Centrifugue las columnas a 17.900 x g durante 30 s a 22 ° C.
Nota: Este proceso elimina los contaminantes de la reacción de PCR antes mencionados. - Descarte el filtrado y centrifugar las columnas vacías a 17.900 x g durante 1 min a 22 ° C.
Nota: Este paso es eliminar cualquier residuo de lavado tampón que puede interferir con aplicaciones posteriores. - Transferir las columnas de la vuelta a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estéril. Añadir 45 μl de tampón de elución (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) e incubar los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos centrífuga las columnas de la vuelta a 17.900 x g durante 1 min a 22 ° C.
- Utilizar el ADN eluído inmediatamente para los pasos 4 y 5 o almacenar a-20 ° C hasta que esté listo para su uso.
Nota: Los amplicones pueden conservarse hasta un año a-20 ° C. Se recomienda almacenar ADN a-80 ° C, si se requiere el almacenamiento a largo plazo.
5. verificación de hongos ITS la amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa
- Molde una agarosa 1% gel con bromuro de etidio 1 μg/mL. Disolver la agarosa en ebullición 1 x de tampón Tris-acetato-EDTA (TAE). Una vez que la solución se ha enfriado a aproximadamente 50 ° C, añadir el bromuro de etidio y vierta en molde de gel.
- Después de que el gel de agarosa ha solidificado, sumergir el gel en 1 x TAE y preparar los amplicones para cargar en el gel. A 8 μl de ADN amplificado, añadir 2 μl de 5 x buffer de carga.
Nota: Estos volúmenes se pueden ajustar dependiendo de la concentración del buffer de carga deseada. - Las muestras, todas de 10 μl, en el gel junto con una escalera de DNA para referencia del tamaño de la carga. Correr el gel a 75 V (6 V/cm) durante aproximadamente 90 minutos y visualizar bandas, vistos normalmente entre 750 y 1.000 pares de bases, utilizando radiación ultravioleta luz (ver figura 5).
6. secuenciación y análisis de regiones de sus hongos
- Secuencia del gDNA extraído o amplificado hongos ITS regiones y analizar secuencias usando métodos actuales y adecuados.
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Representative Results
Puede evaluarse la distribución de las especies dentro de un entorno con abundancia relativa en la determinación de la cantidad de clones de cada OTU identificados en las muestras de aire. Figura 6 es un gráfico de la corona que representan las especies taxonómicamente colocadas dentro de un ambiente interior después de 60 min de muestreo de aire. Se puede observar que el entorno contiene una variedad de especies dentro de dos grande phyla fungicida, Ascomycota y Basidiomycota, así como especies pertenecientes al phylum Zygomycota (Rhizopus microsporus). Los métodos tradicionales de evaluación son parciales hacia especies de Ascomycota, Basidiomycota muchos no son cultivables o no se pueden distinguir usando métodos basados en la microscopía. Secuenciación de regiones ITS hongos permite la detección de numerosas especies de hongos, especialmente algunos Basidiomycota, que a menudo pasan desapercibidos. Análisis de este entorno muestra que 68% de las secuencias hongos identificadas pertenecieron a lo Basidiomycota con la mayoría de ellos en el orden Polyporales.
Los datos taxonómicos obtenidos mediante enfoques basados en la secuenciación se pueden utilizar para determinar la diversidad taxonómica dentro de un entorno. Índices de diversidad, tales como los presentados en la tabla 1, determinan cuán rico es el medio ambiente, que describe el número de especies identificadas en cada muestra, así como la diversidad es el medio ambiente, que tiene en cuenta el número de especies y la abundancia de cada uno. La tabla 1 muestra los índices de riqueza Chao 1 y Shannon índices de diversidad para dos ambientes interiores. Los índices indican mayor riqueza y diversidad en ambientes con aire acondicionado en comparación con entornos enfriador evaporativos. También se incluyen coeficientes de disimilitud de Bray-Curtis. Éstos describen cómo diferentes muestras dentro del entorno están en relación con las especies identificadas dentro de cada muestra. Las muestras dentro de los ambientes descritos en la tabla 1 son muy disímiles en 98% y 97% para aire acondicionado y ambientes enfriador evaporativos, respectivamente.
Figura 1: representación esquemática de un conjunto de cassettes del filtro tres piezas. El cartucho de filtro se compone de tres piezas: una pieza de la parte superior o tapa (entrada), una chimenea de extensión y una pieza base (salida). Un cojín de soporte y filtro se colocan en la superficie cuadriculada de la pieza base. La chimenea de la extensión entonces es sellada en la base utilizando una prensa manual o neumática. Para el uso con el sampler de ciclón de bioaerosol NIOSH, la pieza superior queda durante el muestreo y luego se sustituye para el almacenamiento y transporte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: representación esquemática del sampler de ciclón de bioaerosol NIOSH. El sampler de aerosol del ciclón NIOSH recoge partículas aerotransportadas por aire de dibujo en el sampler a través de la entrada y la producción de un ciclón que deposita las partículas en la pared de los tubos de muestras. El aire es aspirado primero en un tubo de polipropileno de 15 mL, donde grandes partículas (> 4 μm) recoger en las paredes del tubo. Luego el aire sale el primer tubo y se mete en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, donde se recogen las partículas más pequeñas (1 a 4 μm). Las partículas restantes (< 1 μm) recoge en un filtro PTFE como el aire es aspirado fuera del sampler. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: ejemplo de una configuración estática sampler. La imagen muestra samplers para muestreo de área estática. Los muestreadores de NIOSH se fijan hasta recogemos 40 pulgadas (102 cm) y 60 pulgadas (152 cm) del piso, que representan alturas de una sentada y de pie adulto, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: ejemplo de montaje de un muestreador personal. La imagen ilustra un sampler NIOSH lleva en una mochila por un individuo. El interruptor sampler y poder se encuentran en las correas de la mochila mientras que la bomba de muestreo se encuentra dentro de la mochila en sí mismo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: ejemplo de una visualización del gel de agarosa amplifica su ADN de muestras de aire. La imagen muestra bandas de ADN entre 750 y 1.000 pares de bases. Estas bandas representan regiones de su fungicidas amplificadas de muestras de aire extraído. SUS regiones varían de tamaño dependiendo el origen de las especies. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: ejemplo corona gráfico presentando colocado taxonómicamente especies de hongos identificadas dentro de un ambiente interior. La carta de la corona representa la abundancia relativa de especies de hongos encontradas en 4 muestras de hogares después de un período de muestreo de aire de 60 min con el sampler de ciclón de bioaerosol NIOSH. 68% de las especies identificadas pertenecen al phylum Basidiomycota con los restantes pertenecientes a la Ascomycota (33%) y los Zygomycota (1%). Las secuencias ITS más abundantes en este entorno pertenecieron a la orden Polyporales y fueron identificadas como Phanerodontia chrysosporium y Gelatoporia dichroa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Riqueza de Chao-1 | Diversidad de Shannon | Distancia de Bray-Curtis | |
| media (min, max) | media (min, max) | media (min, max) | |
| Acondicionador de aire (n = 9) | 33.86 (15.0, 102.0) | 1,39 (0.68, 2.51) | 0.9778 (0.8313, 1.00) |
| Enfriador evaporativo (n = 10) | 25,46 (12.5, 49.5) | 1.10 (0.50, 1.72) | 0.9624 (0.3804, 1.00) |
Tabla 1: datos de la muestra que presenta especies y diversidad índices de riqueza, comparación de ambientes de interior. La tabla muestra índices de riqueza Chao 1 (número de especies por muestra), índices de diversidad de Shannon (número de especies) y abundancia de cada uno y coeficientes de disimilitud de Bray-Curtis (diferentes cómo es la distribución de las especies entre muestras en una escala de 0 - 1). Estos datos demuestran la mayor riqueza y diversidad en ambientes con aire acondicionado y gran disimilitud entre muestras en ambos entornos. Esta tabla ha sido modificada de limones, et al. 10 con el permiso de la Real Sociedad de química.
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Discussion
Determinar la diversidad fúngica dentro de un entorno de trabajo utilizando enfoques basados en la secuenciación ha mejorado la evaluación de identificación y exposición de peligro de hongos. Con este enfoque ha permitido la detección de muchas otras especies fúngicas que a menudo no se detectan mediante cultivo o métodos de evaluación basados en la microscopía. Aquí se presenta un método para el muestreo de bioaerosoles de ambientes interiores y en el trabajo y la extracción de DNA genómico de muestras de aire para su amplificación y secuenciación. Manejo de la diversidad fúngica utilizando estos métodos es altamente dependiente de: muestras de extracción (1) exitosa y completa de la DNA genomic del aire, (2) la amplificación de la gDNA con iniciadores que permiten la comparación de los amplificados sus secuencias para bancarizados secuencias en los sesgos de la base de datos y límite de amplificación y (3) identificación taxonómica correcta de las secuencias dentro de las bases de datos.
Extracción de ADN genómica exitosa depende de las metodologías de extracción y reactivos empleados en un estudio. Como se menciona en el protocolo, recoger un montón de los bioaerosoles y otras partículas biológicas y no biológicas recogidas en las fases de tubo del muestreador de ciclón de dos etapas NIOSH en la parte superior del tubo. Es muy importante que los tubos cuidadosamente abrir al añadir el tampón de lisis no para perder cualquier partículas y que agitó de una manera que permite que todas las partículas caer en el tampón de lisis (lado derecho hacia arriba y boca abajo). También es importante que el filtro sea cuidadosamente manejado utilizando métodos asépticos no para interrumpir cualquier bioaerosoles que se han depositado en la superficie antes de la extracción o introducen ADN contaminante. Se ha demostrado que existe una gran cantidad de variación entre muchos de los disponibles en el mercado genomic DNA extracción kits15. Algunos sesgos de procedimientos de extracción hacia especies fúngicas específicas y el resultado de ADN diferente rendimientos de20. Si el rendimiento de ADN después de la extracción es bajo, se pueden realizar más repeticiones de reacción de PCR. No sólo los rendimientos de extracción varían, pero muchos de los kits de contribuyan con una cantidad considerable de contaminación de ADN microbiana. Por esta razón, es importante incluir controles adecuados durante todo el procedimiento para identificar y eliminar los contaminantes potenciales de reactivo del análisis.
SU amplificación es otro paso fundamental del protocolo. Las metodologías de extracción utilizadas pueden variar en su capacidad para eliminar los inhibidores de la PCR de las muestras ambientales. Esto es particularmente preocupante con muestras de polvo ambiental21. Amplificación por PCR de las muestras extraídas mediante el método presentado aquí exhibió algunos inhibición de la polimerización en cadena después de la adición de 10 mg de polvo15. Aunque la inhibición de la PCR es de mayor preocupación en las muestras de polvo ambiental, todavía debería ser una consideración cuando la amplificación de ADN extraído de muestras de aire para determinar la diversidad fúngica. La cartilla PCR sistema utilizada en este método proporciona una cobertura del su 1 y 2 de sus regiones. Esto permite la comparación a muchas de las secuencias en las bases de datos de secuencia. Como con el procedimiento de extracción, muchos prejuicios de amplificación y cartilla han sido previamente descritos22. El número de copia tamaño y gen genoma fúngico también podría influir en su amplificación23. Estos sesgos deben tenerse en cuenta al interpretar los datos de la secuencia resultante. Identificación taxonómica de sus secuencias es quizás el componente más crítico de este método. Es importante mantener la coherencia de criterios de identificación. La capacidad para identificar sus secuencias depende de las secuencias bancarizadas en las bases de datos. Muchas secuencias no se puede identificar a la especie llano. Tener criterios específicos al hacer identificaciones taxonómicas basadas en secuencias inclinadas, como porcentaje identidad atajos, es crítico para mantener conjuntos de datos consistente de un estudio a otro.
En comparación con los enfoques tradicionales de evaluación, extracción y secuenciación de ADN hongos de muestras de aire ocupacional proporciona una representación más completa de la diversidad fúngica dentro de un entorno. Además de las limitaciones mencionadas, debe señalarse que los resultados de estos tipos de análisis son semi cuantitativos a diferencia de la cultura, conteos de esporas o PCR cuantitativa24 que permite obtener datos cuantitativos. Secuencia de datos puede utilizarse para determinar la abundancia relativa por muestra como calcular métricas de diversidad fúngica. Estos métodos pueden utilizarse en conjunción con otros métodos, como la qPCR, para obtener más datos cuantificables. Los conjuntos de datos creados con estos enfoques pueden utilizarse en estudios de salud ocupacional para obtener una mejor comprensión de peligros hongos en ambientes de trabajo específicos. Desarrollo más estandarizado métodos de extracción y cartilla de selección son necesarios para caracterizar y comparar estudios basados en la secuenciación de la diversidad fúngica mejor.
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Disclosures
Los resultados y conclusiones de este informe son las de los autores y no representan necesariamente la posición oficial del Instituto Nacional de salud y seguridad ocupacional, centros de Control y prevención de enfermedades.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por un acuerdo interinstitucional entre NIOSH y de NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
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