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Environment

コレクションと真菌 DNA の分析のための産業大気サンプルの抽出

doi: 10.3791/56730 Published: May 2, 2018

Summary

環境内で菌類の多様性を決定する、衛生学健康への危険を識別するために利用されている方法です。このプロトコルでは、真菌の ITS 領域の拡大そして配列の産業空気サンプルからの DNA 抽出について説明します。このアプローチは、伝統的な評価方法によって見落とされることができる多くの菌類の種組成を検出します。

Abstract

従来の文化や顕微鏡ベースのアプローチなどの労働環境における真菌エクスポー ジャーを識別する多くの種の排除で起因したいくつかの制限があります。最後の 20 年間の進歩は、真菌の危険を識別するための分子ベースのアプローチに衛生研究を主導しています。これらのメソッドは、従来の方法を使用して検出されていない持っている屋内と労働環境の内で多くの種の検出にしました。空気内真菌の多様性を決定するためのアプローチのゲノム DNA の抽出、増幅、シーケンシング、および内部の真菌の分類同定を通してサンプルこのプロトコルの詳細は転写スペーサー (ITS) 領域です。そのシーケンスの結果、検出できないか、または文化または顕微鏡を使用して種レベルに特定は難しい多くの菌種の検出。これらのメソッドは、真菌の負担の定量的な対策を提供しない、彼らはハザード同定への新しいアプローチを提供し、全体の種多様性および労働環境の中で多様性を決定するため使用することができます。

Introduction

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屋内と労働環境における真菌エクスポー ジャーは、アレルギー感作喘息1などの呼吸器合併症につながります。真菌危険の識別は、リスクの評価と労働者の暴露を防止するため重要です。これらの真菌危険室内汚染、外気の侵入、または労働者が現在2区域に真菌物質の輸送が行われ環境の妨害の可能性があります。真菌の暴露を評価する方法は、実行可能な文化サンプリングだけでなく、真菌胞子の顕微鏡検査に含まれています。これらのアプローチは、いくつかの制限があるし、全体的な真菌負担3に貢献できる多くの菌種を見落とすこと。文化ベースのアプローチだけの栄養媒体で栽培することができますこれらの可能な真菌の生物を区別できます。顕微鏡を介して種レベルに真菌の胞子を識別するは、胞子のような形態の共有によって混同することができます。どちらの方法、分析し多く残り正体不明で、菌種を特定する mycologists に大きく依存します。

職業上の危険識別および暴露評価で使用される既存の方法論を改良するには、多くの研究者は分子ベースの技術になっています。屋内と労働環境の中で微生物の多様性を評価するためのシーケンス ベースのアプローチは、顕微鏡や実行可能な文化3,4 などの方法と比較して検出された菌種の広範なスペクトルを明らかにしています。 ,5。ここで紹介した方法では、労働環境の空気サンプリングと真菌の潜在的な危険を識別するためのゲノム DNA の抽出をについて説明します。有害性の特定には核リボソーム内部転写スペーサー、または、その菌の中で非常に可変、真菌種6,7を区別するために一般的に使用されている地域を配列することによって、します。 8,9。多くの種門、担子菌類に属するいくつかの種はない実行可能な文化に個人を特定できるよう、職場で見と病理組織学的に区別することは困難。これらの菌は、屋内と労働環境シーケンス真菌 ITS 領域3,4,10評価内で高い相対的な豊富に観察されています。その配列は、屋内と労働環境の内で発生した菌類の多様性に一層の知識を提供しています。

プロトコルは方法を使用して収集、抽出、およびシーケンス解析のためのバイオエアロゾルから真菌の ITS 領域を増幅する詳細を紹介します。このアプローチは、空気中の微粒子を収集するために 2 段サイクロン エアロゾル サンプラーの労働安全と健康 (NIOSH) の国立研究所を利用しています。このサンプラーはバイオエアロゾルと別の吸入 (≤4 μ m 空気力学的直径) を収集するために開発された、非吸入 (> 4 μ m の空気力学的直径) 粒子は、ほとんどが屋内環境内で真菌の生物の同定は、ワーカー11によって吸入する可能性が高い。サイクロン サンプラーを含む他の空気サンプラーは吸入範囲内で粒子を収集する能力を持っている市場で利用できる (< 4 μ m)12,13をフィルターを使用しています。対照的に、NIOSH 2 段サイクロン エアロゾル サンプラーは、下流のアプリケーション14すぐに処理できる使い捨て、ポリプロピレン チューブにその空気力学的直径に基づく種の真菌を分離します。

ゲノム DNA を抽出し、真菌の ITS 領域の増幅のプロセスは、このプロトコルに記載されています。抽出の方法論の提示は、多くの市販キットのターゲット哺乳類細胞、細菌、または特に酵母15菌類および細菌からの DNA の抽出のために特別開発されています。本研究で使用されるプライマーは、真菌の 1 とその 2 地域45の両方の全体的な取材に基づいて選択されます。これらの領域のシーケンスことができます含め、バンクの多くの ITS 配列の比較のシーケンスその 1 地域、その 2 地域、または地域の 1 とその 2 の両方。大気試料の菌類の多様性より少なく支配的な真菌門に属する他のシーケンスと同様に、シーケンスの門は、子嚢菌門と担子菌類のかなりの数を明らかに、これらのメソッドが表示されますを使用して屋内設定で収集接合菌。このアプローチを使用して識別される真菌のシーケンスの広範な多様性は栽培や顕微鏡のような伝統的なハザード識別方法を使用するキャプチャと思います。真菌の ITS 領域の塩基配列決定は、真菌の危険を識別し、屋内と職業の真菌エクスポー ジャーのよりよい理解を可能にする拡張メソッドを提供します。

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Protocol

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1. 準備、NIOSH サンプラー

注: NIOSH サンプラーはバイオエアロゾルの 2 つのサンプリング チューブ、ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) フィルターを使用して収集する 2 段サイクロン エアロゾル サンプラーです。

  1. アセンブリの前に慎重にサンプラーを検査します。それを確保するためのサンプラーは破損していない、すべてのネジは、場所と、ぴったりと 2 つによって形成される縫い目の周りシーリング テープ チェックの半分はそのまま。サンプラーの o リングに傷、亀裂や涙やシリコン グリスの非常に軽いコーティングしているされていないことを確認を確認します。
    注: サンプラーは、ポリスチレンやポリプロピレン スリーピース フィルター カセットで 37 mm 3 μ m PTFE フィルターを含みます。
    1. ベースの部分の格子の表面に、セルロースまたはプラスチック フィルター サポート パッド (フィルターに付属) を配置することによってフィルター カセットを組み立てる (図 1参照)。上向きコレクションの側でフィルター サポート パッドの上にフィルターを配置するのにフィルター鉗子を使用します。
    2. 手動または空気圧プレスを使用してフィルター カセットをシールします。手閉鎖空気フィルター周りリークし、コレクションの効率が低下できるようになります。リング状部分 (拡張子カウル) を挿入し、しっかりと均等にそれをプッシュ ダウンするプレスを使用します。フィルターの周りに空気が漏れていないことを確認して、しっかりをフィルターに拡張カウル押し下げます。
      メモ: カセットの上部の部分は中にサンプリングされていないがサンプリングが完了したら、フィルターをカバーする保存する必要があります。
    3. サンプラーの上に組み立てられたカセットに合わせて、可能な限りそれを押し込みます。フィルター カセットと場所でフィルター カセットを保持してリークを防ぐためにバックアップ シールとして機能するサンプラーの外側に 19 mm (3/4 インチ) テープの一部をラップします。
    4. リークに対して二次シールとして機能するサンプラー ボトムアウトするまでとシーリング テープ各チューブの周りラップにしっかりと完全に各チューブをネジします。
      注: 最初のチューブ 15 mL ポリプロピレン チューブを収集非吸入粒子の空気力学的直径と > 4 μ m。2 番目のチューブ 1.5 mL ポリプロピレン製遠心管は、1、4 μ m 間吸入粒子を収集します。残りの小さい粒子、< 1 μ m、PTFE に収集されます (図 2参照) にフィルターを適用。
  2. フィルターの違いとして各使用前に校正瓶 NIOSH サンプラーを介して空気の流れを調整し、サンプラーの気流を変化させる原因となります。
    1. 校正の jar を使用するには、フィルター カセットの上部に jar のルアーロック継ぎ手を挿入、瓶でサンプラーを配置、瓶を密封します。
    2. 校正 jar を校正流量計・ サンプリング ポンプに接続します。流量計をオンにして、数分のためのウォーム アップすること。流量計にはフィルターの流量計、サンプラーが汚れないようにその入口に接続する必要がありますに注意してください。
    3. サンプリング ポンプをオンにしてウォーム アップし、安定させるために数分の実行を許可します。
    4. 3.5 L/分で正しい流量を設定するポンプを調整します。
      注: NIOSH サンプラーの流量は通常 3.5 L/分に設定します。この流量でサンプラーは吸入粒子サンプリング16ACGIH/ISO 基準に準拠します。他の流量は、異なるカットオフ サイズが必要なまたは騒音レベルを減らすためにも注意しては異なる流量を使用すると場合、は、サンプラー、吸入サンプリング条件に適合は不要になった場合に使用できます。
    5. 校正が完了したとき、電源を切り、ポンプに流量計。

2. 静的および個人的なエアロゾル サンプリング

  1. いずれかの個人または静的エリア サンプリングの NIOSH エアロゾルのサンプラーを設定します。
    注: 静的サンプリングは、三脚または他の固定装置に接続して、サンプラーを使用して、 (図 3参照)、サンプリング時個人対サンプラーとポンプは (図 4参照) を検討されている人にマウント。
    1. 静的な領域のサンプリングで保つ特定の領域にできるだけ近いサンプラーを検討中します。吸気口、部屋の入り口や気流のパスがあるかもしれない場所からサンプラーを維持します。
      注: エアロゾル濃度かなり異なります、短い距離でも元のエアロゾルが部屋17に場合は特に。
    2. 個人的なサンプリングは、人の呼吸ゾーン内のサンプラーを設定します。襟、肩や胸にサンプラーを接続し、バックパック、腰にサンプリング ポンプを配置します。
      注: 呼吸ゾーンですと周りの人の鼻吸入17時に空気の大部分を描画する 30 cm の半球をする一般的。
  2. 管サンプラー サンプラー入り江も明確であり、何もが入り江を妨害したり、サンプラーに空気の流れを妨げることがであることを確認します。管サンプラのピンチまたはねじれていないする必要があります。任意の閉塞は、ポンプを停止する原因となります。
  3. ポンプをオンにします。2 分後、ポンプが実行されているかどうかはチェックしてください。
    注: 行為の空気から 10 分ほどで環境10,18,19によっての完全 8 h 勤務に至るまでの期間のためのサンプリングします。図 6に示された結果は、屋内環境で 60 分サンプリング周期の代表です。
  4. 空気サンプリングが完了した後は、サンプル チューブとフィルターを収集します。シーリング テープを削除、チューブを外し、それらをキャップします。フィルター カセットの 3 番目の部分は、フィルター上に置きます。処理の準備ができるまで 4 ° c のサンプルを格納します。

3. 大気試料からゲノム DNA の抽出

  1. NIOSH BC251 サンプラーの各段階からゲノム DNA (gDNA) を抽出します。コレクション チューブをサンプリング空気を処理し、個別にサンプルで吸入と吸入以外の微生物エアロゾルの測定を許可するフィルターします。
    注: 代わりに、3 つのステージと結合できるサンプル接種が小さすぎる場合を抽出します。
    1. クラス II 生物学的安全キャビネットまたは層流クリーン ベンチ、無菌フィルターを削除します。70% のエタノールおよびテコで動かす道具サンプリング カセット カセット開口部ツールを使用してを開くを使用してサンプリング カセットを拭いてください。フィルター リフターを使用して、フィルターとサポート パッドを上向きにプッシュします。フィルター鉗子を使用してフィルターをつかみ、滅菌シャーレに配置。フィルターを 6 等分にカットし、300 mg ガラスビーズ (0.2 - 0.5 mm) を有する補強 2 mL チューブに配置します。
    2. 30 液体窒素でフィルターを含むチューブ s、すぐに 30 の 4.5 m/s に設定ビーズ工場ホモジナイザの場所 s。
    3. フィルターは千切りまで手順 3.1.2 を何回か繰り返します。そのままフィルターの小さな断片が残ることがあります。0.5 mL の溶解バッファー (4 M 尿素、200 mM トリス、20 mM の NaCl、200 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、pH 7.4) を追加します。
    4. 15 mL と 1.5 mL の空気サンプラー管に 0.3 mL の溶解バッファーを追加します。渦管 10 - 15 秒で直立と倒立し、別の 10-15 s。300 mg ガラス ビーズを含む強化 2 mL チューブに各チューブの内容を転送します。
      注: 各サンプラー管で収集した材料のほとんどは、管の上部に蓄積されます。
    5. 4.5 m/s 30 s と遠心分離機でビーズ工場ホモジナイザのすべてのチューブを処理 22 ° C で 1 分 20,000 × g で滅菌 1.5 mL 遠心チューブに上清を転送および 22 ° C で 1 分再び 20,000 x g でチューブを遠心分離この手順を繰り返します。
  2. 溶解試薬の 30 μ L を追加 (材料表を参照) をそれぞれチューブし、37 ° C 15 分でチューブを孵化させなさい。
  3. 0.2 mL の結合バッファー (10 M 尿素, 6 M グアニジン塩酸、10 mM トリス-HCl、20% トリトン X-100, pH 4.4) を追加、プロテイナーゼ K (100 μ g/mL) 各チューブ、10 分追加 100 μ L 各管にイソプロパノールの 70 ° C でチューブを孵化させなさい。
  4. ガラス繊維フィルター チューブ (700 μ L 容量) 2 mL 採血管の配置に抽出ソリューションを転送し、20,000 x g 30 で採血管を遠心分離機 22 ° C で sコレクション チューブを破棄し、新しい 2 mL 採血管にフィルター チューブを配置します。
  5. 各管に 0.5 mL の阻害剤の除去バッファー (5 M グアニジン HCl、20 mM トリス-HCl、pH 6.6, 38% のエタノール) を追加し、コレクション チューブ 30 20,000 × g で遠心分離機 22 ° C で sコレクション チューブを破棄し、新しい 2 mL 採血管にフィルター チューブを配置します。
  6. 各管に 0.5 mL の洗浄バッファー (20 mM NaCl、2 mM トリス-HCl、pH 7.5、80% エタノール) を追加し、コレクション チューブ 30 20,000 × g で遠心分離機 22 ° C で sコレクション チューブを破棄し、新しい 2 mL 採血管にフィルター チューブを配置します。このプロセスを繰り返します。
  7. 任意の残留洗浄バッファーを削除する 22 ° C でさらに 1 分間 20,000 × g で採血管を遠心分離します。コレクション チューブを破棄し、新しい管にフィルター チューブを配置します。
  8. 追加 100 μ L (70 ° C) 溶出バッファー (トリス-HCl、pH 8.5 10 mM) 各チューブを暖かいし、室温で 1-2 分間遠心分離機 30 20,000 × g で採血管を孵化させなさい 22 ° C で s空のフィルター チューブを滅菌 1.5 mL 遠心チューブに転送し、再ステップ 3.8 から波を適用します。1-2 分間遠心分離機 30 20,000 × g、室温でインキュベート 22 ° C で s
    注: 波を使用することができますステップ 4 またはを使用する準備ができるまでの-20 ° C で保存されているためにすぐに。ゲノム DNA を保存ことができます年に-20 ° C まで長期的なストレージが必要な場合は、-80 ° C で DNA を格納することをお勧めします。

4. 菌のリボソーム DNA の増幅

  1. その地域 1 および 2 抽出された gDNA からを増幅するのに普遍的な真菌のプライマーを使用します。
    注: このプロトコルのプライマー対 Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3')/ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') ITS 領域45の最高のカバレッジを提供するために使用されます。Its 1 領または ITS2 領域だけを増幅するものなどの他のプライマー セットを使用できます。
    1. ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 滅菌 0.5 mL PCR チューブや 96 ウェル PCR プレート帳票 50 μ L 反応の各サンプルを次のように設定: 5 μ L (ステップ 3) から抽出されたテンプレート DNA の PCR グレード水の 33.3 μ L、5 μ L の 10 x PCR バッファー、50 mm MgCl21.5 μ L、10 mM - デオキシヌクレオシド 2' 5'-三リン酸塩の 1 μ L、20 μ M Fun18Sf 前方プライマーの 0.5 μ L、20 μ M ITS4R 逆プライマー、0.5 μ、 Taq DNA ポリメラーゼの 0.2 μ L。
    2. サーマルサイクラーに反応を実行: 3 分; 95 ° C で変性変性の 6 サイクル (96 ° C、30 s) アニール (50 ° C、45 s) とプライマー拡張 (72 ° C、3 分);変性の 20 サイクル (96 ° C、30 s)、焼鈍 (50 ° C、45 s)、およびプライマー拡張 (72 ° C、1 分);72 ° C で 10 分間でプライマー拡張は、次のステップまで 4 ° C で反応混合物を保ちます。
  2. 帳票の PCR の反作用は浄化シリカ膜精製キットを使用して結合します。
    注: この手順により、PCR コンポーネント (プライマー、dNTPs、酵素、塩、) および増幅された DNA の準備から他の汚染物質を除去するため。
    1. 滅菌 1.5 mL 容マイクロ チューブ内の各サンプル (合計 150 μ L) の 3 つの反作用を結合します。5 倍ボリューム (750 μ L) で結合バッファー (5 M グアニジン HCl、30% イソプロパノール) を追加し、上下に 10 回ピペッティングして混合します。
    2. 列コレクション チューブの配置をスピンし、濾液 30 s. 破棄の 17,900 x g でチューブを遠心分離機の混合物の 450 μ L を追加します。列に残り 450 μ L を追加し、30 の 17,900 × g で遠心分離機 22 ° C で s
      注: スピンの列には、列に DNA の吸着は、シリカ膜が含まれます。
    3. 濾液を破棄し、750 μ L 洗浄バッファー (10 mM トリス-HCl、pH 7.5、80% エタノール) をスピンの列に追加します。遠心分離機の 30 の 17,900 x g で列 22 ° C で s
      注: このプロセスは、上記 PCR の反作用からの汚染物質を削除します。
    4. 濾液を破棄し、遠心分離機の 22 ° C で 1 分 17,900 x g で空の列
      注: この手順は、ダウン ストリーム アプリケーションを妨げるバッファーを洗浄、残留を取り除くことです。
    5. 滅菌 1.5 mL 遠心チューブにスピン列を転送します。溶出バッファー (10 mM Tris Cl、pH 8.5) の 45 μ L を追加し、室温で 5 分間遠心分離機管 22 ° C で 1 分 17,900 x g でスピン列を孵化させなさい
    6. 手順 4 および 5 のためすぐに溶離された DNA を使用してまたは使用の準備が整うまで-20 ° C で保存します。
      注意: amplicons の格納することができます年に-20 ° C まで長期的なストレージが必要な場合は、-80 ° C で DNA を格納することをお勧めします。

5. 真菌その増幅器は agarose のゲルの電気泳動の検証

  1. キャスト 1% の agarose のゲル含む 1 μ G/ml エチジウム ブロマイド。トリス-酢酸-EDTA (TAE) バッファー x 1 を沸騰のアガロースを溶解します。ソリューションは、約 50 ° C に冷却は、エチジウム ブロマイドを追加し、キャスト ゲルに注ぐ。
  2. Agarose のゲルは固化後 1 のゲルを浸す x TAE とゲルにロードする産物を準備します。増幅された DNA の 8 μ L は、バッファーを読み込んで x 5 の 2 μ L を追加します。
    注: これらのボリュームは、必要な読み込みバッファーの濃度に応じて調整できます。
  3. サイズの参考のため DNA の梯子とジェルの上にすべての 10 μ L のサンプルをロードします。75 V でゲルを実行 (6 V/cm) 約 90 分通常 750 間見られるバンドを視覚化して紫外線を使用して、1,000 塩基対光 (図 5参照)。

6. シーケンスと真菌の ITS 領域の解析

  1. 抽出された gDNA または増幅真菌 ITS 領域をシーケンス処理し、最新かつ適切なメソッドを使用してシーケンスを分析します。

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Representative Results

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環境内での種の分布は、大気試料で識別される各乙のクローンの数を決定することによって相対的な豊かさを使用して評価できます。図 6は、次の空気サンプリングの 60 分屋内環境内で分類学的に種を表すアイスランドクローナ グラフです。それは、環境にさまざまな門接合菌 (クモノスカビ microsporus) に属する種と同様、2 つの主要な菌門、子嚢菌門、担子菌類、内の種が含まれていることに観察できます。評価の伝統的な方法では子嚢菌門種偏っている多くの菌類、人為的または顕微鏡ベースのメソッドを使用して区別することはできません。真菌の ITS 領域の塩基配列決定は、具体的にいくつか菌類、しばしば突き止め、多数の菌種の検出が可能です。この環境の分析は、Polyporales の順序で置かれたそれらのほとんどと、担子菌類に属していた識別される真菌のシーケンスの 68% を示しています。

シーケンス ベースのアプローチを使用して得られた分類学的データは、環境内で分類学的多様性を決定する使用できます。表 1 に示したものなど、多様性指標決定どのように豊かな環境は、種は、各サンプルの特定の数を記述するだけでなく、環境がどのように多様な種数との豊かさを考慮に入れた各。表 1は、2 つの屋内環境の多様度指数チャオ 1 豊かさ指標とシャノンを示します。インデックス高い豊かさと蒸発クーラー環境と比較してエアコンの環境の多様性を示します。また、ブレイ カーティス非類似度係数です。これらは、環境内でどのように異なるサンプルを記述する各サンプル内で識別種について。表 1 に示す環境の両方内のサンプルは、それぞれ 98% と 97% のエアコンおよび蒸発クーラー環境に高い異種。

Figure 1
図 1: スリーピース フィルター カセット アセンブリの略図。フィルター カセットが 3 つの部分から成っている: 上部またはキャップの部分 (入口), 拡張カウルと基本部分 (コンセント)。サポート パッドとフィルターは、ベースの部分のグリッド サーフェスに配置されます。拡張子カウルを手動または空気圧プレスを使用してベースの上に封印します。NIOSH バイオエアロゾル サイクロン サンプラー用、トップ部分はサンプリング中にオフに左し、貯蔵および輸送用に置き換えられています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: NIOSH バイオエアロゾル サイクロン サンプラーの略図。NIOSH サイクロン エアロゾル サンプラーは、入口をサンプラーに空気を描画し、堆積物粒子のサンプル チューブの壁にサイクロンを生産大気浮遊粉じんを収集します。大、15 mL ポリプロピレン チューブに空気を最初に描画される粒子 (> 4 μ m)、管の壁に収集します。空気、最初の管の外に出るし、小さい粒子 (1 に 4 μ m) が収集 1.5 mL 遠心チューブに引き込まれます。残りの粒子 (< 1 μ m) 空気を描画するサンプラーから PTFE フィルターで収集します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 静的なサンプラーの設定の例です。画像は、サンプラーの静的な領域をサンプリングするための設定を示します。NIOSH サンプラーから設定されます収集 40 インチ (102 cm) までと 60 インチ (152 cm) 床に座っていると立っている大人の高さをそれぞれ表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 個人サンプラー アセンブリの例です。イメージは、個々 によってバックパックに装着 NIOSH サンプラーを示しています。サンプリング ポンプはバックパック自体の内にある間、サンプラーおよび電源スイッチはパックのストラップに配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: agarose のゲルが可視化の例は空気サンプルからの DNA を増幅します。画像は、750 と 1,000 塩基対の DNA バンドを示しています。これらのバンドは、抽出された大気試料から増幅された真菌 ITS 領域を表します。その地域は、種の起源に応じてサイズが異なります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: 屋内環境内で特定された種の真菌を配置例アイスランドクローナ グラフ提示分類します。アイスランドクローナ グラフは、NIOSH バイオエアロゾル サイクロン サンプラーと 60 分空気サンプリング周期を次の家から収集された 4 サンプルで見られる真菌種の相対的な豊かさを示しています。特定種の 68% は、子嚢菌門 (33%) と菌 (1%) に残りの属すると門担子菌類に属する。この環境で最も豊富な ITS シーケンスは順序 Polyporales に属し、 Phanerodontia 解析Gelatoporia dichroaとして識別されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

チャオ 1 豊かさ シャノンの多様性 ブレイ カーティス距離
平均値 (最小、最大) 平均値 (最小、最大) 平均値 (最小、最大)
エアコン (n = 9) 33.86 (15.0, 102.0) (0.68、2.51) 1.39 0.9778 (0.8313, 1.00)
蒸発クーラー (n = 10) 2,546万 (12.5 49.5) 1.10 (0.50、1.72) 0.9624 (0.3804, 1.00)

表 1: サンプル データの多様性と種の豊かさ指標屋内環境の比較を提示します。表はチャオ 1 豊かさ指標 (サンプルあたりの種数)、シャノンの多様度指数 (種数) と、それぞれの豊かさとブレイ カーティス非類似度係数 (どのように異なる種の分布は、0 件の規模でサンプル間の 1)。これらのデータは、高い豊かさとエアコンの環境、両方の環境でのサンプルの間で高い非類似度の多様性を示しています。このテーブルは、レモンから変更されています。王立化学協会の許可を得て10

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Discussion

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シーケンス ベースのアプローチを使用して労働環境の中で真菌多様性を決定する真菌ハザードの同定と露出の評価が上がった。このアプローチを使用して頻繁にしない文化または評価の顕微鏡ベースのメソッドを使用して検出される多くの種の追加真菌の検出のため許可しています。職業などの室内環境とその増幅とシーケンスの空気サンプルからゲノム DNA の抽出からバイオエアロゾルをサンプリング法を次に示します。これらのメソッドを使用して菌の多様性の決定は非常に依存して: 空気ゲノム DNA の抽出 (1) 成功し、完全なサンプル、プライマーのシーケンスがバンクに増幅の比較を可能にすると gDNA の増幅 (2)データベースおよび制限増幅バイアスと (3) の正しい分類同定データベース内のシーケンスのシーケンス。

成功したゲノム DNA の抽出は、抽出の方法論と研究で用いられる試薬に依存しています。プロトコルに記載されているように、バイオエアロゾル、NIOSH 2 段サイクロン サンプラーの管の段階で収集されたその他の生物・非生物粒子の多くはチューブの上部に収集します。任意の粒子を失わないためには換散バッファーを追加するとき慎重にチューブを開くということは換散バッファー (右側上下逆さまにダウン) に該当するすべての粒子は、方法で vortexed ことは非常に重要です。また、フィルターが慎重にすることが重要だ抽出前に表面が収集、または汚染の DNA を導入するバイオエアロゾルを破壊することとして無菌メソッドを使用して処理されます。それは、大量の市販ゲノム DNA 抽出キット15の多くの間の変動があることが実証されています。特定菌種とさまざまな DNA の結果いくつかの抽出手順のバイアスは、20を得られます。抽出 DNA の収量が低い場合より高い PCR 反応レプリケートを実行できます。溶媒抽出はさまざまに異なり、だけ、キットの多くは微生物の DNA 汚染のかなりの量を貢献します。このため、識別し、分析から潜在的な試薬の汚染物質を除去する手順全体の適切なコントロールを含めることが重要です。

その増幅はプロトコルの別の重要なステップです。環境サンプルからの PCR 阻害物質を削除する能力を使用する抽出方法論によって異なります。これは特にに関する環境ダスト サンプル21です。ここに示すメソッドを使用して抽出したサンプルの PCR の拡大は、ほこり15の 10 mg の付加の後でいくつかの PCR 阻害を出展しました。PCR 阻害環境ダスト中の最大の関心事ですが、真菌多様性を決定するための大気サンプルから抽出した DNA を増幅に関する一考察をはずです。このメソッドで使用される PCR プライマーは、その 1 とその 2 の両方の領域のカバレッジを提供します。これにより、シーケンス データベース配置シーケンスの多くと比較するため。抽出のプロシージャと同様多くの増幅およびプライマーのバイアスは前述の22をされています。真菌ゲノムのサイズと遺伝子のコピー数も増幅23に影響を与える可能性があります。結果のシーケンス データを解釈するとき考慮これらのバイアスを撮影する必要があります。そのシーケンスの分類同定は、おそらく、このメソッドの最も重要なコンポーネントです。企業の判定基準の一貫性を維持することが重要です。そのシーケンスを識別する能力はデータベースにシーケンスに依存しています。多くのシーケンスは、種レベルを識別できません。割合アイデンティティ ヒューズのようなバンクのシーケンスに基づく分類学的同定の際に特定の条件を持つ研究からデータセットの整合性を保つが重要です。

伝統的な評価手法と比較して、労働の空気サンプルから真菌 DNA シーケンスの抽出とは、環境内で真菌多様性のより完全な表現を提供します。上記で説明した制限事項、に加えてこれらのタイプの解析の結果、文化、胞子カウントまたは定量的 PCR24定量的なデータをもたらすことができるとは異なり半定量を注意しなければなりません。データのシーケンスは、真菌多様性指標の算出し同様、サンプルごとの相対量を決定する使用できます。これらのメソッドより定量化可能なデータを取得する qPCR のような他の方法と組み合わせて使用できます。特定労働環境における真菌危険性のよりよい理解を得るために労働衛生研究でこれらのアプローチを使用して作成したデータセットを使用できます。標準化された抽出、プライマーの選択のアプローチより良い特徴し、真菌多様性法を用いた研究を比較に必要な開発。

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Disclosures

調査結果とこのレポートの結論のこれらの者は、必ずしも疾病対策と予防のための労働安全と健康センターの国立研究所の公式の位置ではないです。

Acknowledgments

この作品は、NIOSH と NIEHS (AES12007001-1-0-6) 間の省庁間の契約によって部分で支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler NIOSH BC251 The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps Fisher Scientific 02-681-373 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352096 15 mL polypropylene tubes for air sampling
Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width McMaster-Carr 76505A1 sealing tape
Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm SKC Inc. 225-3LF 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs
PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm EMD Millipore FSLW03700 Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads
Fisherbrand filter forceps Fisher Scientific 09-753-50 filter forceps
Model 502 Precision PanaPress PanaVise 502 pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press
Scotch Super 33+ vinyl electrical tape McMaster-Carr 76455A21 19 mm tape
Multi-purpose Calibration Jar, Large SKC Inc. 225-112 calibration jar
Universal PCXR4 Sample Pump SKC Inc. 224-PCXR4 sampling pump
Mass Flowmeter 4140 TSI Inc. 4140 flow meter
Roche High Pure PCR Template Kit Roche Diagnostics 11796828001 Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes
Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps Fisher Scientific 15340162 2 mL reinforced tubes for bead homogenization
Glass beads, acid washed, 212-300 µm Sigma-Aldrich G1277 glass beads
Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer Fisher Scientific 15-340-163 bead homogenizer
CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X Sigma-Aldrich C8740 lysis reagent
Platinum Taq polymerase Invitrogen 10966-018 Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender
dNTP Mix Invitrogen 18427-088 10 mM dNTP mix
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye
Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System Thermo Fisher B1 or B2
TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder Thermo Fisher 10488-085 DNA ladder

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References

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コレクションと真菌 DNA の分析のための産業大気サンプルの抽出
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Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).More

Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).

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