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Environment

Collecte et Extraction des échantillons d’Air professionnel pour l’analyse de l’ADN fongique

doi: 10.3791/56730 Published: May 2, 2018

Summary

Détermination de la diversité fongique au sein d’un environnement est une méthode utilisée dans les études de santé au travail afin d’identifier les risques pour la santé. Ce protocole décrit l’extraction d’ADN provenant d’échantillons d’air professionnel pour l’amplification et le séquençage des régions ITS fongiques. Cette approche détecte plusieurs espèces fongiques qui peuvent être négligées par les méthodes d’évaluation traditionnelles.

Abstract

Les méthodes traditionnelles d’identification fongiques expositions dans des environnements professionnels, comme la culture et les approches axées sur la microscopie, présentent plusieurs limites qui ont conduit à l’exclusion de nombreuses espèces. Avancées dans le domaine au cours des deux dernières décennies ont conduit les chercheurs en santé au travail à se tourner vers des approches moléculaires pour l’identification des risques fongiques. Ces méthodes ont permis de détecter de nombreuses espèces dans des environnements intérieurs et professionnels qui n’ont pas été détectés à l’aide de méthodes traditionnelles. Ce Détails du protocole une approche permettant de déterminer la diversité fongique dans l’air des échantillons par l’extraction d’ADN génomique, d’amplification, séquençage et identification taxonomique des fongiques interne transcrits régions intergéniques (ITS). SES résultats de séquençage dans la détection de nombreuses espèces de champignons qui ne sont pas détectés ou difficilement identifiables au niveau de l’espèce à l’aide de la culture ou la microscopie. Alors que ces méthodes ne fournissent pas de mesures quantitatives du fardeau fongique, ils offrent une nouvelle approche pour l’identification des dangers et peuvent être utilisées pour déterminer la richesse globale en espèces et la diversité au sein d’un milieu de travail.

Introduction

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Exposition fongique dans les environnements d’intérieurs et au travail peut entraîner des morbidités respiratoires, y compris la sensibilisation allergique et l’asthme1. Identification des dangers fongiques est importante pour évaluer le risque et prévenir l’exposition des travailleurs. Ces risques fongiques peuvent être le résultat d’une contamination intérieure, intrusion d’air extérieur ou perturbations environnementales qui entraînent le transport des matières fongiques dans des zones où les travailleurs sont présents2. Méthodes pour évaluer l’exposition fongique ont inclus la culture viable échantillonnage ainsi que l’identification microscopique des spores fongiques. Ces approches présentent plusieurs limites et oublient souvent de nombreuses espèces de champignons qui pourraient contribuer au fardeau global fongiques3. Approches axées sur la culture peuvent différencier uniquement ces organismes fongiques viables qui peuvent être cultivées sur des milieux nutritifs. Identifier les spores fongiques au niveau de l’espèce par l’intermédiaire de la microscopie peut être confondu par des spores partage morphologies similaires. Les deux méthodes sont fortement tributaires des mycologues pour analyser et identifier les espèces de champignons, avec nombreux restent non identifiés.

Pour améliorer les méthodologies existantes utilisées dans l’identification des risques professionnels et les évaluations de l’exposition, de nombreux chercheurs se sont tournés vers technologies moléculaires. Approches axées sur les séquençage permettant d’évaluer la diversité microbienne dans les environnements intérieurs et professionnels ont mis en évidence un plus large éventail d’espèces de champignons rencontrés par rapport à des méthodes telles que la microscopie et la culture viable3,4 ,,5. La méthode présentée ici décrit l’échantillonnage de l’air des milieux professionnels et l’extraction d’ADN génomique pour l’identification des dangers potentiels de champignons. Identification des dangers est accomplie en séquençant le nucléaire ribosomique espaceur interne transcrit, ou STI, régions qui sont très variables chez les champignons et ont été utilisées pour différencier les espèces fongiques6,7, 8,9. Beaucoup d’espèces trouvés dans des environnements professionnels, tels que certaines espèces appartenant au phylum Basidiomycota, ne sont pas identifiables dans la culture viable et est difficiles à différencier au microscope. Ces champignons ont été observés en grande abondance dans les environnements intérieurs et professionnels évalués par séquençage fongiques ITS régions3,4,10. SON séquençage a fourni une plus grande connaissance de la diversité des champignons rencontrés dans les environnements intérieurs et au travail.

Le protocole décrit ici les méthodes utilisées pour recueillir, extraire et amplifier des régions ITS fongiques de bioaérosols pour l’analyse des séquences de détails. Cette approche utilise le National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) échantillonneur d’aérosol biétage cyclone recueillir des particules en suspension dans l’air. Cet échantillonneur a été développé afin de recueillir les bioaérosols et séparé respirable (≤ 4 µm de diamètre aérodynamique) et non respirables (> 4 µm de diamètre aérodynamique) particules, ce qui permet l’identification des organismes fongiques au sein d’environnements intérieurs qui sont les plus susceptibles d’être inhalées par un travailleur11. Autres échantillonneurs d’air, y compris les échantillonneurs de cyclone, sont disponibles sur le marché qui ont la capacité de recueillir des particules dans la gamme respirable (< 4 µm) à l’aide de filtres12,13. En revanche, l’échantillonneur aérosol NIOSH biétage cyclone sépare issus de leur diamètre aérodynamique dans des tubes jetables, en polypropylène qui peuvent être transformés immédiatement pour applications en aval de14espèces de champignons.

Les processus d’extraction d’ADN génomique et d’amplifier des régions ITS fongiques sont détaillées dans le présent protocole. Les méthodes d’extraction présentées ont été développés spécifiquement pour l’extraction de l’ADN génomique des champignons et des bactéries, comme beaucoup de kits commerciaux ciblent des cellules de mammifères, bactéries ou spécifiquement levures15. Les amorces utilisées dans cette étude sont choisis sur leur couverture globale des fongiques ITS 1 et 2 de ses régions4,5. Le séquençage de ces régions permet la comparaison des nombreuses séquences ITS en banque, y compris ceux cette séquence la région ITS 1, ITS 2 région ou des régions ITS 1 tant ses 2. La diversité fongique des échantillons d’air prélevés dans un réglage intérieur à l’aide de que ces méthodes sont indiquées, révélant un grand nombre de séquences placés dans le phyla ascomycètes et basidiomycètes, mais aussi les autres séquences appartenant aux moins dominant phyla fongique, tels que Zygomycota. La grande diversité des champignons séquences identifiées à l’aide de cette approche ne serait pas être capturée à l’aide de méthodologies d’identification risque traditionnels comme la culture ou la microscopie. Le séquençage des régions ITS fongiques fournit une méthode améliorée pour identifier les risques fongiques et permettre une meilleure compréhension de l’exposition fongique intérieure et au travail.

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Protocol

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1. préparation de l’échantillonneur d’aérosol NIOSH

Remarque : Le sampler d’aérosol NIOSH est un échantillonneur d’aérosol biétage cyclone qui recueille les bioaérosols avec deux tubes de prélèvement d’échantillons et un filtre de polytétrafluoroéthylène (PTFE).

  1. Avant le montage, inspecter soigneusement l’échantillonneur. Vérifiez l’échantillonneur pour s’assurer qu’il n’est pas endommagé, toutes les vis sont en place et confortable et le ruban d’étanchéité autour de la couture formée par les deux moitiés est intact. Inspecter le sampler joint torique pour assurer qu'il n’a pas les pseudos, fissures ou déchirures et qu’elle a une très légère couche de graisse silicone.
    Remarque : Le sampler comprend un filtre PTFE de 3 µm de 37 mm en polystyrène ou cassette filtre trois pièces en polypropylène.
    1. Assembler la cassette filtre en plaçant une cellulose ou coussin de soutien de filtre en plastique (inclus avec les filtres) sur la surface quadrillée de la pièce de base (voir la Figure 1). Forceps de filtration permet de mettre le filtre sur le dessus du coussin de soutien de filtre avec le côté de la collection vers le haut.
    2. Sceller les cartouches de filtre à l’aide d’une presse manuelle ou pneumatique. Fermeture de la main permettra à air fuite autour du filtre et réduire l’efficacité de la collection. Insérer la pièce en forme d’anneau (le capot de l’extension) et utiliser la presse pour l’enfoncer fermement et uniformément. Appuyez le capot de l’extension sur le filtre assez serré pour s’assurer que l’air ne fuit pas autour du filtre.
      Remarque : La partie supérieure de la cassette n’est pas utilisée lors de l’échantillonnage, mais doit être enregistrée pour couvrir le filtre une fois que l’échantillonnage est complet.
    3. Insérez la cassette Assemblée dans la partie supérieure de l’échantillonneur et poussez-le vers le bas autant que possible. Enroulez un morceau de ruban de 19 mm (3/4 po) autour de l’extérieur de la cassette filtre et échantillonneur pour maintenir la cassette filtre en place et d’agir comme un sceau de sauvegarde pour éviter les fuites.
    4. Vissez chaque tube hermétiquement et entièrement dans l’échantillonneur jusqu'à ce qu’elle bute et les enrouler du ruban autour de chaque tube d’étanchéité d’agir comme un joint secondaire contre les fuites.
      Remarque : Le premier tube, un tube de 15 mL en polypropylène, recueille non respirables, ayant un diamètre aérodynamique de > 4 µm. Le second tube, un tube polypropylène microtubes de 1,5 mL, recueille les particules respirables entre 1 et 4 µm. Les particules plus petites encore, < 1 µm, sont prélevés sur le PTFE filtre (voir Figure 2).
  2. Calibrer le flux d’air par le biais de l’échantillonneur NIOSH avec un pot de calibrage avant chaque utilisation car les différences dans les filtres et les échantillonneurs causera le débit d’air varie.
    1. Pour utiliser un récipient de calibration, insérez le raccord Luer de la Jarre dans la partie supérieure de la cassette filtre, placer l’échantillon dans le bocal et sceller le bocal.
    2. Connectez le bocal d’étalonnage d’un débitmètre de calibration et la pompe de prélèvement. Allumez le débitmètre et laissez chauffer pendant quelques minutes. Notez que le débitmètre doit toujours avoir un filtre fixé à son entrée pour éviter de contaminer le débitmètre et le sampler.
    3. Allumer la pompe de prélèvement et laissez-le tourner pendant quelques minutes réchauffer et stabiliser.
    4. Ajuster la pompe pour régler le débit correct à 3,5 L/min.
      Remarque : Le débit pour le sampler d’aérosol NIOSH est généralement défini à 3.5 L/min. À ce débit, l’échantillonneur est conforme aux critères pour les particules inhalables d’échantillonnage16ACGIH/ISO. Autres débits peuvent être utilisés si la coupure différentes tailles sont souhaités ou pour réduire le niveau de bruit, mais sachez que si un débit différent est utilisé, puis l’échantillonneur est n’est plus conforme aux critères d’échantillonnage respirable.
    5. Lorsque l’étalonnage est terminé, arrêter la pompe et le débitmètre.

2. l’échantillonnage statique et personnels en aérosol

  1. Mettre en place l’échantillonneur d’aérosol NIOSH pour soit personnelle ou statique aréolaires.
    NOTE : Échantillonnage statique se rapporte en utilisant l’échantillonneur aérosol alors qu’il est fixé sur un trépied ou autre dispositif de fixation (voir Figure 3), que par rapport à quand échantillonnage individuel l’échantillonneur et la pompe sont montés sur la personne étudiée (voir Figure 4).
    1. Pour l’échantillonnage de la zone statique, garder les échantillonneurs aussi près que possible de la zone étudiées. Garder les échantillonneurs de prises d’air, les entrées de la salle et les endroits qui pourraient être dans le chemin d’accès de l’air.
      Remarque : Des concentrations d’aérosols peuvent varier considérablement même sur de courtes distances, surtout si la source de l’aérosol est dans la chambre17.
    2. Pour l’échantillonnage individuel, mis en place l’échantillonneur de zone de respiration de la personne. Fixez l’échantillonneur sur le revers, l’épaule ou la poitrine et placer la pompe de prélèvement à la taille ou dans un sac à dos.
      Remarque : La zone de respiration présume généralement être un hémisphère de 30 cm qui entourent le nez d’une personne dont la majorité de l’air est tirée pendant l’inhalation17.
  2. Assurez-vous que l’échantillonneur tube est largement à l’écart des entrées du sampler et que rien n’est les bras de mer ou entrave au flux d’air dans l’échantillonneur. L’échantillonneur tube pas doit être pincé ou plié. Tout blocage provoquera l’arrêt de la pompe.
  3. Mettre les pompes. Après une minute ou deux, vérifier si les pompes sont encore en cours d’exécution.
    Remarque : Conduite d’air d’échantillonnage pour des périodes de temps allant d’aussi peu que 10 minutes à un quart de travail complet 8 h, selon l’environnement10,18,19. Les résultats présentés à la Figure 6 sont représentatifs d’une période de 60 min d’échantillonnage dans un environnement intérieur.
  4. Après que l’échantillonnage de l’air est terminée, recueillir les tubes d’échantillons et le filtre. Enlever le ruban adhésif, dévisser les tubes et les cap. Placez le troisième morceau de la cassette filtre sur le filtre. Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu’au moment de la transformation.

3. extraction de l’ADN génomique des échantillons d’air

  1. Extraire l’ADN génomique (ADNg) de chaque étape de l’échantillonneur de NIOSH BC251. Traiter l’air collection tubes d’échantillonnage et filtrer séparément pour permettre une détermination des aérosols microbiens respirables et non respirables dans l’échantillon.
    Remarque : Vous pouvez également les trois étapes se combinent et extraits si l’inoculum de l’échantillon est trop petit.
    1. Dans une classe II hotte biologique de sécurité ou un banc propre à flux laminaire, aseptiquement enlever le filtre. Essuyer la cassette d’échantillonnage à l’aide d’éthanol à 70 % et soulevez la cassette d’échantillonnage ouvrir à l’aide d’un outil de cassette-ouverture. Utilisez un panier de filtre pour appuyer sur la touche filtre et support vers le haut. Saisir le filtre à l’aide de forceps de filtration et le placer dans une boîte de petri stérile. Couper le filtre en 6 morceaux égaux et les placer dans un tube de 2 mL renforcée contenant des perles de verre de 300 mg (0,2 - 0,5 mm).
    2. Placer le tube contenant le filtre dans l’azote liquide pendant 30 s et le placer immédiatement dans un homogénéisateur de moulin de perle fixé à 4,5 m/s pendant 30 s.
    3. Répétez l’étape 3.1.2 une ou deux fois jusqu'à ce que le filtre est déchiqueté. Petits morceaux de filtre intact peut-être rester. Ajouter 0,5 mL de tampon de lyse (urée 4 M, 200 mM Tris, NaCl, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), de 200 mM à 20 mM, pH 7,4).
    4. Ajouter 0,3 mL de tampon de lyse aux tubes d’échantillonneur air 1,5 mL et 15 mL. Vortex le tube pendant 10-15 s tandis que debout et puis un autre 10-15 s inversé. Transférer le contenu de chaque tube dans des tubes de 2 mL renforcée contenant des perles de verre de 300 mg.
      Remarque : La plupart des matériaux collecté dans chaque tube échantillonneur s’accumule près du sommet du tube.
    5. Traiter tous les tubes de l’homogénéisateur de moulin de perle à 4,5 m/s à 30 s et centrifuger à 20 000 x g pendant 1 min à 22 ° C. Transfert de surnageants aux tubes de microcentrifuge stérile de 1,5 mL et centrifuger les tubes à 20 000 x g à nouveau pendant 1 min à 22 ° C. Répétez cette étape.
  2. Ajouter 30 µL de réactif de lyse (voir Table des matières) pour chaque tube et incuber les tubes à 37 ° C pendant 15 min.
  3. Ajouter 0,2 mL de tampon de liaison (10 M urée, guanidine-HCl 6 M, 10 mM Tris-HCl, 20 % X-100 Triton, pH 4,4) et la protéinase K (100 µg/mL) à chaque tube et incuber les tubes à 70 ° C pendant 10 min. Ajouter 100 µL d’isopropanol dans chaque tube.
  4. Les solutions de l’extrait de transfert dans des tubes de filtre de fibre verre (capacité de 700 µL) placés dans des tubes de prélèvement de 2 mL et centrifuger les tubes de prélèvement à 20 000 x g pendant 30 s à 22 ° C. Jeter les tubes de prélèvement et placer les tubes de filtre dans les nouveaux tubes de prélèvement de 2 mL.
  5. Ajouter 0,5 mL de tampon d’enlèvement inhibiteur (5 M guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6,6, 38 % d’éthanol) dans chaque tube et centrifuger les tubes de prélèvement à 20 000 x g pendant 30 s à 22 ° C. Jeter les tubes de prélèvement et placer les tubes de filtre dans les nouveaux tubes de prélèvement de 2 mL.
  6. Ajouter 0,5 mL de tampon de lavage (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80 % d’éthanol) dans chaque tube et centrifuger les tubes de prélèvement à 20 000 x g pendant 30 s à 22 ° C. Jeter les tubes de prélèvement et placer les tubes de filtre dans les nouveaux tubes de prélèvement de 2 mL. Répétez ce processus.
  7. Centrifuger les tubes de prélèvement à 20 000 x g pendant une supplémentaire de 1 min à 22 ° C pour éliminer n’importe quel tampon de lavage résiduelle. Jeter les tubes de prélèvement et placer les tubes de filtre dans les nouveaux tubes de prélèvement.
  8. Ajouter 100 µL tampon d’élution (≥70 ° C) (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) dans chaque tube de réchauffer et les incuber à température ambiante pendant 1 à 2 min. centrifuger les tubes de prélèvement à 20 000 x g pendant 30 s à 22 ° C. Transférer les tubes vides de filtre dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL et réappliquez les éluats de l’étape 3,8. Incuber à température ambiante pendant 1 à 2 min. Centrifuger à 20 000 x g pendant 30 s à 22 ° C.
    Remarque : Les éluats peuvent être utilisés immédiatement pour l’étape 4 ou stockée à-20 ° C jusqu’au moment de l’utiliser. L’ADN génomique peut être conservée pendant un an à-20 ° C. Il est recommandé que l’ADN être stockées à-80 ° C si le stockage à long terme est nécessaire.

4. amplification de l’ADN ribosomal fongique

  1. Amorces universelles de champignons permet d’amplifier ses régions 1 et 2 de l’ADNg extraite.
    Remarque : Pour ce protocole, l’apprêt paire Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') sont utilisés pour fournir la plus grande couverture des régions ITS4,5. Autres paires d’amorces, tels que ceux qui amplifient des régions ITS1 et ITS2 seules, peuvent être utilisés.
    1. Mettre en place des réactions en chaîne par polymérase (PCR) pour chaque échantillon en triple 50 réactions de µL en tubes PCR stériles 0,5 mL ou plaques PCR 96 puits comme suit : 5 µL de l’extrait modèle ADN (de l’étape 3), 33,3 µL d’eau grade PCR, 5 µL de tampon de x PCR 10 , 1,5 µL de 50 mM MgCl2, 1 µL de 10 mM 2'-DÉSOXYNUCLÉOSIDE 5'-triphosphate, 0,5 µL de 20 µM Fun18Sf avant l’apprêt, 0,5 µL de 20 µM ITS4R inverse l’apprêt et 0.2 µL de Taq ADN polymérase.
    2. Effectuer des réactions dans un thermocycleur : dénaturation à 95 ° C pendant 3 min ; 6 cycles de dénaturation (96 ° C, 30 s) recuit (50 ° C, 45 s) et extension d’amorce (72 ° C, 3 min) ; 20 cycles de dénaturation (96 ° C, 30 s), recuit (50 ° C, 45 s) et l’extension d’amorce (72 ° C, 1 min) ; et extension d’amorce à 72 ° C pendant 10 min. Gardez les mélanges réactionnels à 4 ° C jusqu'à l’étape suivante.
  2. Combiner que les réactions de PCR en triple purifient à l’aide d’un kit de purification à base de membranes de silice.
    Remarque : Cette procédure permet l’élimination des composants PCR (amorces, dNTPs, enzymes, sels, etc.) et d’autres contaminants de la préparation de l’ADN amplifiée.
    1. Combiner les trois réactions pour chaque échantillon (total 150 µL) dans des tubes de microcentrifuge stérile de 1,5 mL. Ajouter le tampon de liaison (5 M guanidine-HCl, 30 % isopropanol) à un volume de 5 x (750 µL) et la composition de la solution de pipetage et descendre dix fois.
    2. Ajouter 450 µL du mélange pour faire tourner les colonnes placées dans des tubes pour prélèvements et centrifuger les tubes à 17 900 g pour 30 s. jeter les filtrats. Ajouter le restant 450 µL aux colonnes et centrifuger à 17 900 x g pendant 30 s à 22 ° C.
      Remarque : Les colonnes de spin contiennent une membrane de silice qui permet pour l’adsorption de l’ADN aux colonnes.
    3. Jeter les filtrats et ajouter 750 µL de tampon de lavage (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, éthanol à 80 %) pour les colonnes à centrifuger. Centrifuger les colonnes à 17 900 g pendant 30 s à 22 ° C.
      Remarque : Ce processus supprime les contaminants de la réaction PCR mentionnée ci-dessus.
    4. Jeter le filtrat et centrifuger les colonnes vides à 17 900 x g pendant 1 min à 22 ° C.
      NOTE : Cette étape consiste à enlever tout résidu lavage tampon qui peut-être interférer avec des applications en aval.
    5. Transférer les colonnes à centrifuger à tubes de microcentrifuge de stériles de 1,5 mL. Ajouter 45 µL de tampon d’élution (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) et incuber les tubes à température ambiante pendant 5 min. centrifuger les colonnes à centrifuger à 17 900 x g pendant 1 min à 22 ° C.
    6. Utiliser l’ADN éluée immédiatement pour les étapes 4 et 5 ou conserver à-20 ° C jusqu'à prêt à l’emploi.
      Remarque : Les amplicons peut être conservés pendant un an à-20 ° C. Il est recommandé que l’ADN être stockées à-80 ° C si le stockage à long terme est nécessaire.

5. vérification des champignons ITS amplification par électrophorèse sur gel d’agarose

  1. Cast un agarose à 1 % gel contenant du bromure d’éthidium 1 µg/mL. Dissoudre l’agarose en ébullition 1 x tampon Tris-acétate-EDTA (TAE). Une fois que la solution est refroidie à environ 50 ° C, ajouter le bromure d’éthidium et versez dans gel coulé.
  2. Après le gel d’agarose est solidifiée, immerger le gel à 1 x TAE et préparer les amplicons d’être chargé sur le gel. À 8 µL d’ADN amplifié, ajouter 2 µL de 5 x tampon de chargement.
    Remarque : Ces volumes peuvent être réglés selon la concentration de la mémoire tampon de chargement désirée.
  3. Charger les échantillons, tous les 10 µL et sur le gel avec une échelle d’ADN pour référence de taille. Exécutez le gel à 75 V (6 V/cm) pendant environ 90 min et visualiser les bandes, généralement observés entre 750 et 1 000 paires de bases, à l’aide de rayons ultraviolets (voir Figure 5).

6. le séquençage et l’analyse des régions ITS fongiques

  1. Séquencer l’ADNg extrait ou régions amplifiées à ITS fongiques et d’analyser les séquences à l’aide des méthodes actuelles et appropriés.

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Representative Results

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La distribution des espèces dans un environnement peut être évaluée à l’aide de l’abondance relative en déterminant le nombre de clones de chaque OTU identifiée dans les échantillons d’air. La figure 6 est un graphique de la Couronne représentant les espèces taxonomiquement placés au sein d’un environnement intérieur après 60 min d’échantillonnage de l’air. On peut constater que l’environnement contienne une variété d’espèces au sein des deux principaux embranchements fongiques, Ascomycota et Basidiomycota, en plus des espèces appartenant au phylum Zygomycota (Rhizopus microsporus). Les méthodes traditionnelles d’évaluation sont partial envers les espèces d’ascomycètes, car Basidiomycota beaucoup ne sont pas cultivables ou ne peuvent pas être différenciés à l’aide de méthodes axées sur la microscopie. Le séquençage des régions ITS fongiques permet une détection des nombreuses espèces de champignons, plus précisément certains Basidiomycota, qui passent souvent inaperçus. L’analyse de cet environnement montre que 68 % des fongiques séquences identifiées appartenait à la Basidiomycota avec la plupart d'entre eux placés dans l’ordre Polyporales.

Les données taxonomiques obtenues à l’aide d’approches axées sur le séquençage permet de déterminer la diversité taxonomique au sein d’un environnement. Les indices de diversité, telles que celles présentées dans le tableau 1, déterminent comment les riches est à l’environnement, qui décrit le nombre d’espèces identifiées dans chaque échantillon, ainsi que l’environnement est diversité, qui prend en compte le nombre d’espèces et l’abondance des chaque. Le tableau 1 montre les indices de richesse 1 Chao et Shannon indices de diversité pour les deux environnements intérieurs. Les indices indiquent la richesse et la diversité dans un environnement climatisé par rapport aux environnements refroidisseur par évaporation plus élevé. Coefficients de dissimilitude de Bray-Curtis sont également inclus. Elles décrivent comment différents échantillons dans l’environnement sont en ce qui concerne les espèces identifiées au sein de chaque échantillon. Les échantillons dans les deux les environnements décrits dans le tableau 1 sont très dissemblables à 98 % et 97 % pour climatiseur et environnements refroidisseur par évaporation, respectivement.

Figure 1
Figure 1 : représentation schématique d’une Assemblée de cassette filtre three-piece. La cassette filtre est composée de trois pièces : une pièce de haut ou cap (entrée), un auvent extension et un morceau de base (sortie). Un coussin de soutien et le filtre sont placés sur la surface quadrillée de la pièce de base. Le capot de l’extension est ensuite scellé dans le socle à l’aide d’une presse manuelle ou pneumatique. Pour une utilisation avec l’échantillonneur de cyclone aux bioaérosols NIOSH, la pièce supérieure est laissée lors de l’échantillonnage et est alors remplacée pour le stockage et le transport. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : représentation schématique de l’échantillonneur de cyclone aux bioaérosols NIOSH. L’échantillonneur d’aérosol de cyclone NIOSH recueille des particules aéroportées en tirant l’air dans l’échantillonneur par le biais de l’entrée et produisant un cyclone que les dépôts de particules sur la paroi des tubes échantillon. L’air est aspiré tout d’abord dans un tube de 15 mL en polypropylène, où de grandes particules (> 4 µm) recueillent sur les parois du tube. Ensuite l’air s’écoule le premier tube et est aspiré par un tube de microtubes de 1,5 mL, où recueillent des particules plus petites (1 à 4 µm). Les particules restantes (< 1 µm) collecter sur un filtre PTFE comme l’air est aspiré hors de l’échantillonneur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : exemple d’une configuration statique échantillonneur. L’image montre des échantillonneurs mis en place pour l’échantillonnage de la zone statique. Les échantillonneurs NIOSH sont définies jusqu'à recueillir 40 pouces (102 cm) et 60 pouces (152 cm) du sol, soit des hauteurs où une séance et un adulte debout, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : exemple d’un montage personnel échantillonneur. L’image illustre un échantillonneur NIOSH porté sur un sac à dos par un individu. Le commutateur échantillonneur et puissance sont situés sur les sangles du sac tandis que la pompe de prélèvement se trouve dans le sac à dos lui-même. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : exemple d’un gel d’agarose visualisation amplifié son ADN d’échantillons d’air. L’image montre des bandes d’ADN entre 750 et 1 000 paires de bases. Ces bandes représentent amplifié fongiques ITS régions provenant d’échantillons de l’air extrait. SES régions varient en taille selon l’origine des espèces. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : exemple Krona graphique présentant placé sur le plan taxonomique espèces de champignons identifiés au sein d’un environnement intérieur. Le graphique de la Couronne illustre l’abondance relative des espèces fongiques présentes dans 4 échantillons prélevés dans les foyers après une période d’échantillonnage air 60 min avec l’échantillonneur de cyclone aux bioaérosols NIOSH. 68 % des espèces identifiées appartiennent au phylum Basidiomycota avec les restant appartenant aux ascomycètes (33 %) et Zygomycota (1 %). Les séquences ITS plus abondants dans cet environnement appartenaient à l’ordre Polyporales et ont été identifiés comme Phanerodontia chrysosporium et Gelatoporia dichroa. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Richesse de Chao-1 Diversité de Shannon Distance de Bray-Curtis
moyenne (min, max) moyenne (min, max) moyenne (min, max)
Climatiseur (n = 9) 33,86 (15,0, 102,0) 1.39 (0,68, 2,51) 0.9778 (0.8313, 1.00)
Refroidisseur par évaporation (n = 10) 25.46 (12,5, 49,5) 1.10 (0.50, 1,72) 0.9624 (0.3804, 1.00)

Tableau 1 : exemple de données présentant des espèces et la diversité des indices de richesse en comparant les environnements intérieurs. Le tableau présente les indices de richesse Chao 1 (nombre d’espèces par exemple), les indices de diversité de Shannon (nombre d’espèces) et l’abondance de chacune et coefficients de dissimilitude de Bray-Curtis (est de la distribution des espèces comment dissemblables entre les échantillons sur une échelle de 0 - 1). Ces résultats démontrent plus de richesse et de diversité dans les environnements climatisés et grande dissemblance entre les échantillons dans les deux environnements. Cette table a été modifiée de citrons et al. 10 avec la permission de la Royal Society of Chemistry.

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Discussion

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Détermination de la diversité fongique au sein d’un milieu de travail à l’aide d’approches axées sur le séquençage a amélioré évaluation identification et exposition des risques fongiques. En utilisant cette approche a permis la détection de nombreuses autres espèces fongiques qui sont souvent non détectés à l’aide de la culture ou les méthodes d’évaluation axée sur la microscopie. Une méthode d’échantillonnage bioérosols des environnements professionnels et intérieures et l’extraction de l’ADN génomique des échantillons d’air pour l’amplification et le séquençage est présentée ici. Selon les prescriptions de la diversité fongique à l’aide de ces méthodes est fortement tributaire : échantillons d’extraction (1) efficace et complète de l’ADN génomique de l’air (2) l’amplification de l’ADNg avec des amorces qui permettent la comparaison de l’amplifié ses séquences déposé en banque séquences dans les biais d’amplification de base de données et de la limite et (3) identification taxonomique correcte des séquences dans les bases de données.

L’extraction d’ADN génomique réussie repose sur les méthodes d’extraction et les réactifs utilisés dans une étude. Comme indiqué dans le protocole, beaucoup des bioaérosols et autres particules biologiques et non biologiques recueillies dans les phases de tube de l’échantillonneur de cyclone biétage NIOSH recueillir dans la partie supérieure du tube. Il est très important que les tubes soient ouvertes avec précaution lorsque vous ajoutez le tampon de lyse afin de ne pas perdre des particules et qu’ils soient mixés dans une manière qui permette à toutes les particules de tomber dans le tampon de lyse (à droite vers le haut et à l’envers vers le bas). Il est également important que le filtre soit soigneusement gérées à l’aide des méthodes aseptiques aussi ne pas de perturber les bioaérosols qui ont recueilli sur la surface avant l’extraction ou introduire de l’ADN contaminant. Il a été démontré qu’il existe une grande quantité de variation entre plusieurs des disponibles dans le commerce genomic DNA extraction kits15. Un biais de procédures d’extraction vers certaines espèces fongiques et résultat dans l’ADN variable donne20. Si le rendement d’ADN après une extraction est faible, plus réplicats de réaction PCR est possible. Non seulement les rendements d’extraction varient, mais bon nombre des kits de contribuent une somme importante de contamination microbienne de l’ADN. Pour cette raison, il est important d’inclure des mesures de contrôle appropriées tout au long de la procédure pour identifier et éliminer les contaminants potentiels de réactif de l’analyse.

SON amplification est une autre étape critique du protocole. Les méthodes d’extraction utilisées peuvent varier dans leur capacité à éliminer les inhibiteurs de PCR des échantillons environnementaux. Il s’agit notamment concernant avec échantillons de poussière environnementale21. Amplification par PCR des échantillons extraits à l’aide de la méthode présentée ici exposé certaine inhibition de PCR après l’addition de 10 mg de poussière15. Bien que l’inhibition de la PCR est plus préoccupant dans les échantillons de poussières environnementale, il faut toujours un examen lors de l’amplification d’ADN extrait d’échantillons d’air pour la détermination de la diversité fongique. L’amorce PCR, la valeur utilisée dans cette méthode fournit une couverture des régions ITS 1 tant ses 2. Cela permet de comparer à plusieurs des séquences dans les bases de données de séquence. Comme pour la procédure d’extraction, de nombreux préjugés amplification et apprêt ont été décrites précédemment22. Le nombre de copies du génome fongique taille et gène pourrait aussi influencer son amplification23. Ces biais doivent prendre en considération lors de l’interprétation des données de séquence qui en résulte. Identification taxonomique de ses séquences est peut-être l’élément le plus critique de cette méthode. Il est important assurer la cohérence des critères d’identification. La capacité d’identifier ses séquences dépend des séquences conservées dans les bases de données. Plusieurs séquences ne peuvent être identifiés au niveau de l’espèce. Ayant des critères spécifiques lors d’identifications taxonomiques basées sur les séquences en banque, comme les seuils de pourcentage d’identité, est essentiel pour garder les ensembles de données cohérente d’une étude à.

Par rapport aux méthodes d’évaluation traditionnelles, extraction et séquençage ADN fongique des échantillons d’air professionnel fournit une représentation plus complète de la diversité fongique au sein d’un environnement. En plus des limitations évoquées ci-dessus, il est à noter que les résultats de ces types d’analyses sont semi-quantitatifs contrairement à la culture, comtes de spores ou PCR quantitative24 qui peut produire des données quantitatives. Séquençage de données peut servir à déterminer l’abondance relative par exemple mais aussi de calculer des indicateurs de la diversité fongique. Ces méthodes permettent en conjonction avec d’autres méthodes, comme qPCR, pour obtenir davantage de données quantifiables. Les ensembles de données créés à l’aide de ces approches peut être utilisé dans des études de santé d’acquérir une meilleure compréhension des risques fongiques dans des environnements professionnels spécifiques. Développer plus standardisée, approches de sélection extraction et apprêt sont nécessaires pour mieux caractériser et comparer les études sur le séquençage de la diversité fongique.

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Disclosures

Les constatations et conclusions de ce rapport sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement la position officielle de l’Institut National pour la sécurité et la santé, centres de prévention et de lutte contre les maladies.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par un accord interinstitutions entre NIOSH et NIEHS (AES12007001-1-0-6).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler NIOSH BC251 The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps Fisher Scientific 02-681-373 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352096 15 mL polypropylene tubes for air sampling
Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width McMaster-Carr 76505A1 sealing tape
Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm SKC Inc. 225-3LF 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs
PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm EMD Millipore FSLW03700 Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads
Fisherbrand filter forceps Fisher Scientific 09-753-50 filter forceps
Model 502 Precision PanaPress PanaVise 502 pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press
Scotch Super 33+ vinyl electrical tape McMaster-Carr 76455A21 19 mm tape
Multi-purpose Calibration Jar, Large SKC Inc. 225-112 calibration jar
Universal PCXR4 Sample Pump SKC Inc. 224-PCXR4 sampling pump
Mass Flowmeter 4140 TSI Inc. 4140 flow meter
Roche High Pure PCR Template Kit Roche Diagnostics 11796828001 Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes
Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps Fisher Scientific 15340162 2 mL reinforced tubes for bead homogenization
Glass beads, acid washed, 212-300 µm Sigma-Aldrich G1277 glass beads
Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer Fisher Scientific 15-340-163 bead homogenizer
CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X Sigma-Aldrich C8740 lysis reagent
Platinum Taq polymerase Invitrogen 10966-018 Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender
dNTP Mix Invitrogen 18427-088 10 mM dNTP mix
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye
Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System Thermo Fisher B1 or B2
TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder Thermo Fisher 10488-085 DNA ladder

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References

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Collecte et Extraction des échantillons d’Air professionnel pour l’analyse de l’ADN fongique
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Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).More

Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).

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