Summary
Het bepalen van de schimmel diversiteit binnen een omgeving is een methode gebruikt in studies van de gezondheid op het werk te identificeren van de gevaren voor de gezondheid. Dit protocol beschrijft DNA-extractie uit beroepsmatige lucht monsters voor de versterking en de sequencing van schimmel ITS-regio's. Deze aanpak detecteert vele schimmel soorten die kunnen worden overzien door traditionele beoordelingsmethoden.
Abstract
Traditionele methoden voor het identificeren van schimmel posities in professionele omgevingen, zoals cultuur en microscopie gebaseerde benaderingen, hebben verscheidene beperkingen die hebben geleid tot de uitsluiting van vele soorten. Ontwikkelingen op het gebied in de afgelopen twee decennia hebben onderzoekers van de gezondheid op het werk te wenden tot moleculaire gebaseerde benaderingen voor de identificatie van de gevaren van de schimmel geleid. Deze methoden hebben geleid tot de detectie van vele soorten in binnen- en werk-omgevingen die niet zijn gevonden met behulp van traditionele methoden. De gegevens van dit protocol een aanpak voor het bepalen van de schimmel diversiteit binnen lucht monsters door genomic DNA-extractie, versterking, sequencing en taxonomische identificatie van schimmel interne getranscribeerd spacer (ITS) regio's. DE rangschikking resulteert in de opsporing van vele schimmel soorten die zijn ofwel niet gedetecteerd of moeilijk vast te stellen op niveau van de soorten met cultuur of microscopie. Terwijl deze methoden geen kwantitatieve metingen van schimmel last bieden, ze bieden een nieuwe benadering van de gevaren en kunnen worden gebruikt voor het bepalen van de algemene soortenrijkdom en diversiteit in een professionele omgeving.
Introduction
Schimmel posities in binnen- en beroepsmatige omgeving kunnen leiden tot respiratoire morbiditeit, met inbegrip van allergische sensibilisatie en astma1. Identificatie van de gevaren van de schimmel is belangrijk voor de beoordeling van risico's en het voorkomen van blootstelling van de werknemer. Deze schimmel gevaren kunnen een gevolg zijn van binnen besmetting, buitenlucht inbraak of verstoringen van het milieu die resulteren in het vervoer van schimmel materialen in gebieden waar werknemers aanwezig2. Methoden voor het beoordelen van de schimmel blootstelling hebben opgenomen levensvatbare cultuur bemonstering, alsmede de microscopische identificatie van schimmelsporen. Deze benaderingen hebben verschillende beperkingen en vaak over het hoofd veel schimmel soorten die aan de algehele schimmel last3 bijdragen kunnen. Cultuur gebaseerde benaderingen kunnen alleen die levensvatbare schimmel organismen die kunnen worden geteeld op voedingsbodems differentiëren. Identificeren van schimmelsporen naar soorten niveau via microscopie kan worden verward door sporen delen van soortgelijke morphologies. Beide methoden zijn sterk afhankelijk van mycologen te analyseren en identificeren van de schimmel soort, met veel resterende niet-geïdentificeerde.
Om te verbeteren op bestaande methodes gebruikt in occupational hazard identificatie en beoordeling van de blootstelling, hebben vele onderzoekers aan moleculaire gebaseerde technologieën gedraaid. Sequencing gebaseerde benaderingen voor de beoordeling van de microbiële diversiteit in binnen- en beroepsmatige omgeving is gebleken dat een breder spectrum van schimmel soorten ondervonden vergeleken met methoden zoals microscopie en levensvatbare cultuur3,4 ,5. De hier gepresenteerde methode beschrijft de lucht bemonstering van beroepsmatige omgevingen en extractie van genomic DNA voor de identificatie van de potentiële gevaren van de schimmel. Identificatie van de gevaren gebeurt door de rangschikking van de nuclear ribosomal interne getranscribeerde spacer of ITS, regio's die onder de schimmels zeer variabel zijn en zijn gewoonlijk gebruikt om schimmel soorten6,7, differentiëren 8,9. Vele soorten gevonden in professionele instellingen, zoals sommige soorten die behoren tot de stam Basidiomycota, zijn niet identificeerbare in levensvatbare cultuur en zijn moeilijk te onderscheiden microscopisch. Deze schimmels zijn waargenomen in hoge relatieve overvloed in binnen- en beroepsmatige omgeving beoordeeld door sequentiebepaling schimmel ITS regio's3,4,10. DE volgorde heeft meer kennis verschaft in de diversiteit van de schimmels ondervonden in binnen- en beroepsmatige omgeving.
Het protocol beschreven hier details de methoden gebruikt voor het verzamelen, uitpakken en versterken van schimmel ITS-regio's uit bioaerosols voor sequentieanalyse. Deze aanpak maakt gebruik van het National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) tweetraps cycloon aërosol sampler voor het verzamelen van deeltjes in de lucht. Deze sampler werd ontwikkeld voor het verzamelen van bioaerosols en separaat inadembare (≤4 µm aërodynamische diameter) en niet-respirabel (> 4 µm aërodynamische diameter) deeltjes, die het mogelijk maakt voor de identificatie van schimmel organismen in overdekte omgevingen die het meest waarschijnlijk door een werknemer11worden ingeademd. Andere lucht samplers, met inbegrip van cycloon samplers, zijn beschikbaar op de markt die hebben de mogelijkheid om het verzamelen van deeltjes binnen het inadembare bereik (< 4 µm)12,13met behulp van filters. In tegenstelling, scheidt de NIOSH tweetraps cycloon aërosol sampler schimmel soorten op basis van hun aërodynamische diameter in wegwerp, polypropyleen-buizen die onmiddellijk kunnen worden verwerkt voor downstream toepassingen14.
Het proces van extractie van genomic DNA en versterken van de schimmel ITS regio's worden beschreven in dit protocol. De methoden van de extractie gepresenteerd hebben speciaal ontwikkeld voor de extractie van genomic DNA van schimmels en bacteriën, zoals veel commerciële kits cellen van zoogdieren, bacteriën, of specifiek gisten15 target. De inleidingen gebruikt in deze studie zijn geselecteerd op basis van hun totale dekking van zowel de schimmel ITS 1en ITS 2 regio's4,5. Rangschikken van deze regio's zorgt voor de vergelijking van vele dwarshelling ITS sequenties, met inbegrip van degenen die volgorde het ITS 1-gebied, het zijn 2 regio of ITS 1 zowel de ITS 2 regio's. De schimmel diversiteit van lucht monsters verzameld in een overdekt instellen met behulp van die deze methoden worden getoond, onthulling van een aanzienlijk aantal sequenties geplaatst in de stammen ascomyceten en Basidiomycota evenals andere sequenties die behoren tot de minder dominante schimmel stammen, zoals Zygomycota. De brede diversiteit van schimmel sequenties geïdentificeerd met behulp van deze aanpak zou niet worden gevangen met behulp van traditionele gevaar identificatie methodologieën zoals teelt of microscopie. Sequentiebepaling van schimmel ITS regio's biedt een verbeterde methode om te identificeren schimmel gevaren en zorgen voor een beter begrip van binnen- en beroepsmatige schimmel posities.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van de NIOSH aërosol sampler
Opmerking: De NIOSH aërosol sampler is een twee-traps cycloon aërosol sampler die verzamelt bioaerosols met behulp van twee bemonstering buizen en een polytetrafluorethyleen (PTFE) filter.
- Vóór de vergadering, zorgvuldig inspecteren de sampler. Controleer de sampler om ervoor te zorgen het niet beschadigd is, alle schroeven zijn in plaats en snug en de afdichtende tape rond de naad gevormd door de twee helften is intact. Inspecteer de O-ring om ervoor te zorgen dat het hoeft niet elke nicks, barsten of scheuren en dat er een zeer lichte coating van Siliconenvet-sampler.
Opmerking: De sampler bevat een 37 mm 3 µm PTFE filter in een polystyreen of polypropyleen 3-delige filter cassette.- De filter cassette monteren door een cellulose of plastic filter ondersteuning pad (geleverd bij de filters) op het gerasterde oppervlak van de base stuk te plaatsen (Zie Figuur 1). Filter pincet gebruiken om het filter op de top van de filter ondersteuning pad met de collectie kant naar boven.
- Het zegel van de filter cassettes met behulp van een handmatige of pneumatische pers. Hand sluiting zal toestaan lucht lekken rond de filter en verminderen de doeltreffendheid van de collectie. Voeg het ringvormige stuk (de extensie cowl), en gebruik van de pers om het te duwen naar beneden strak en gelijkmatig. Druk naar beneden de extensie cowl op het filter strak genoeg om de lucht doet niet lekken rond de filter.
Opmerking: Het bovenste stuk van de cassette wordt niet gebruikt bij bemonstering maar ter dekking van de filter na bemonstering voltooid is moet worden opgeslagen. - Passen de geassembleerde cassette op de bovenkant van de sampler en duw naar beneden mogelijk. Wikkel een stukje 19 mm (3/4 inch) tape rond de buitenkant van de filter cassette en sampler aan de filter cassette op zijn plaats houden en te fungeren als een back-up zegel te voorkomen van lekken.
- Elke buis strak en volledig schroeven in de sampler totdat het bodems uit en de wrap sealing tape rond elke buis om op te treden als een secundaire afdichting tegen lekken.
Opmerking: De eerste buis, een polypropyleen tube van 15 mL, verzamelt niet-inadembare deeltjes met een aerodynamische diameter van > 4 µm. De tweede buis, een 1,5 mL polypropyleen microcentrifuge buis, verzamelt inadembare deeltjes tussen 1 en 4 µm. De resterende kleinere deeltjes, < 1 µm, worden verzameld op de PTFE filteren (Zie Figuur 2).
- Kalibreren van de luchtstroom door de NIOSH sampler met een kalibratie pot vóór elk gebruik als verschillen in de filters en samplers zorgt de luchtstroom te variëren.
- Voor het gebruik van een kalibratie-pot, invoegen van de pot Luer montage in de top van de filter cassette, plaats de monsternemer in de pot en verzegelen van de pot.
- De kalibratie-pot verbinden met een debietmeter ijking en de bemonsteringspomp bevinden. De flowmeter inschakelen en laat ze voor een paar minuten opwarmen. Merk op dat de stroomsnelheidsmeter altijd een filter gekoppeld aan de inlaat te voorkomen besmetten de stroomsnelheidsmeter en de sampler.
- Het inschakelen van de bemonsteringspomp bevinden en laat het lopen voor een paar minuten opwarmen en stabiliseren.
- Aanpassen van de pomp in te stellen van de juiste debiet op 3,5 L/min.
Opmerking: Het debiet voor de NIOSH aërosol sampler wordt gewoonlijk ingesteld op 3,5 L/min. Aan deze stroomtarief voldoet de sampler aan de criteria van de ACGIH/ISO voor de inadembare deeltjes bemonstering16. Andere debiet kunnen worden gebruikt als verschillende licht-donkerscheiding afmetingen gewenst zijn of ter vermindering van het geluidsniveau, maar wees ervan bewust dat als een ander debiet wordt gebruikt, vervolgens de sampler niet langer aan de inadembare bemonstering criteria voldoen zal. - Wanneer de kalibratie is voltooid, schakelt u de pomp en de flowmeter.
2. statische en persoonlijke aërosol bemonstering
- De NIOSH aërosol sampler voor de bemonstering van hetzij persoonlijke of statische gebied instellen
Opmerking: Statische bemonstering verwijst naar het gebruik van de sampler aërosol terwijl deze is aangesloten op een statief of ander bedrijf apparaat (Zie Figuur 3), zoals versus persoonlijke bemonstering wanneer de sampler en de pomp zijn gemonteerd op de persoon die wordt onderzocht (Zie Figuur 4).- Voor statische gebied bemonstering, houden de samplers zo dicht mogelijk naar het specifieke gebied bestudeerd. Houd de samplers uit de buurt van de luchtinlaten, kamer ingangen en plaatsen die misschien wel in het pad van de luchtstroom.
Opmerking: Aerosol concentraties kunnen aanzienlijk variëren ook over korte afstanden, vooral als de bron van het aërosol in de kamer17. - Voor persoonlijke bemonstering, stelt u de monsternemer in de ademhalingszone van de persoon. De sampler hechten aan het revers, de schouder en de borst, en plaats van de bemonsteringspomp bevinden in de taille of in een rugzak.
Opmerking: De ademhalingszone wordt algemeen aangenomen dat een 30 cm halfrond omringende iemands neus waaruit de meerderheid van de lucht wordt getekend tijdens inademing17.
- Voor statische gebied bemonstering, houden de samplers zo dicht mogelijk naar het specifieke gebied bestudeerd. Houd de samplers uit de buurt van de luchtinlaten, kamer ingangen en plaatsen die misschien wel in het pad van de luchtstroom.
- Zorg ervoor dat de buizen sampler goed duidelijk van de sampler inhammen is en dat niets is belemmeren de inhammen of met de luchtstroom in de sampler interfereren. De sampler buizen moet niet worden geknepen of opgerold. Elke blokkade zorgt ervoor dat de pomp om te stoppen.
- Inschakelen van de pompen. Controleer na een minuut of twee, als de pompen zijn nog steeds actief.
Opmerking: Gedrag air bemonstering voor perioden variërend van zo weinig als 10 minuten tot een volledige 8 h-ploeg, afhankelijk van de omgeving10,18,19. De resultaten in Figuur 6 zijn representatief voor een periode van 60 min bemonstering in een binnenmilieu. - Nadat lucht bemonstering is voltooid, verzamelen de monster buizen en filter. Verwijder de afdichtende tape, schroef de buizen en hen van het GLB. Plaats het derde stuk van de filter cassette over het filter. Bewaren monsters bij 4 ° C tot klaar voor verwerking.
3. extractie van genomic DNA van monsters van de lucht
- Het uittreksel van genomic DNA (gDNA) van elke fase van de NIOSH BC251 sampler. Verwerken van de lucht bemonstering collectie buizen en afzonderlijk filteren zodat voor de bepaling van respirabel en niet-respirabel microbiële aërosolen in de steekproef.
Opmerking: U kunt ook de drie stadia kunnen worden gecombineerd en uitgepakt als monster entmateriaal te klein is.- In een klasse II biologische veiligheidskast of schone laminaire flow-bench, aseptisch het filter te verwijderen. Veeg de bemonstering cassette neer met 70% ethanol en loeren de bemonstering cassette openen met behulp van een cassette-opening tool. Gebruik een filter lifter te duwen van het filter en steun pad naar boven. Pak het filter filter pincet gebruiken en plaatst u deze in een steriele petrischaal. Het filter in 6 gelijke stukjes gesneden en plaats ze in een tube van de 2 mL versterkt met glasparels 300 mg (0,2 - 0,5 mm).
- De buis met het filter in vloeibare stikstof voor 30 s en plaatst u deze onmiddellijk in een kraal molen homogenizer vastgesteld op 4,5 m/s voor 30 s.
- Herhaal stap 3.1.2 of twee keer totdat het filter is versnipperd. Kleine stukjes intact filter kunnen blijven. Voeg 0,5 mL lysisbuffermengsel (4 M ureum, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), pH 7.4).
- 0.3 mL lysisbuffermengsel aan de 15 mL en 1,5 mL lucht sampler buizen toevoegen. Vortex de buis voor de 10-15 s terwijl rechtop en dan nog eens 10-15 s omgekeerd. Breng de inhoud van elke buis 2 mL versterkt buizen bevattende glazen bolletjes van 300 mg.
Opmerking: De meeste van het materiaal verzameld in elke buis sampler zal ophopen in de buurt van de bovenkant van de buis. - Verwerken van alle buizen in de kraal molen homogenizer bij 4.5 m/s voor 30 s en centrifuge hen bij 20.000 x g gedurende 1 minuut bij 22 ° C. Supernatant overbrengen in steriele 1,5 mL microcentrifuge buizen en centrifugeer de buizen bij 20.000 x g opnieuw gedurende 1 minuut bij 22 ° C. Herhaal deze stap.
- Voeg 30 µL van lysis reagens (Zie Tabel van materialen) aan elk tube en Incubeer de buizen bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Voeg 0,2 mL bindende buffer (10 M ureum, 6 M guanidine-HCl, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X-100, pH 4.4) en proteïnase K (100 µg/mL) tot elk tube en Incubeer de buizen bij 70 ° C gedurende 10 min. Voeg 100 µL van isopropanol aan elke buis.
- Breng de extract-oplossingen in glasvezel filter buizen (700 µL capaciteit) in 2 mL collectie buizen geplaatst en centrifugeer de collectie buizen bij 20.000 x g gedurende 30 s bij 22 ° C. Negeren van de collectie buizen en plaats de filter-buizen in nieuwe 2 mL collectie buizen.
- Voeg 0,5 mL remmer verwijdering buffer (5 M guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6.6, 38% ethanol) aan elke buis en centrifugeer de collectie buizen bij 20.000 x g gedurende 30 s bij 22 ° C. Negeren van de collectie buizen en plaats de filter-buizen in nieuwe 2 mL collectie buizen.
- Voeg 0,5 mL was buffer (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80% ethanol) aan elke buis en centrifugeer de collectie buizen bij 20.000 x g gedurende 30 s bij 22 ° C. Negeren van de collectie buizen en plaats de filter-buizen in nieuwe 2 mL collectie buizen. Herhaal dit proces.
- Centrifugeer de collectie buizen bij 20.000 x g gedurende een extra 1 min bij 22 ° C tot het verwijderen van alle resterende was buffer. Negeren van de collectie buizen en plaats de filter-buizen in nieuwe collectie buizen.
- Voeg 100 µL warm (≥70 ° C) elutie buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) aan elke buis en uit te broeden ze bij kamertemperatuur voor 1-2 min. Centrifuge buizen van de collectie bij 20.000 x g gedurende 30 s bij 22 ° C. De buizen leeg filter overbrengen in een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis en eluaten opnieuw van toepassing vanaf stap 3.8. Incubeer bij kamertemperatuur voor 1-2 min. Centrifuge bij 20.000 x g gedurende 30 s bij 22 ° C.
Opmerking: Eluaten kunnen dienen onmiddellijk voor stap 4 of opgeslagen bij-20 ° C tot klaar voor gebruik. Genomic DNA kan worden opgeslagen voor maximaal een jaar bij-20 ° C. Het wordt aanbevolen dat de DNA-80 ° c worden opgeslagen als op lange termijn opslag vereist is.
4. versterking van schimmel ribosomal DNA
- Universele schimmel inleidingen gebruiken om te vergroten haar gebieden 1 en 2 van de uitgepakte gDNA.
Opmerking: Voor dit protocol, de primer koppelen Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') worden gebruikt om de grootste dekking van de ITS regio's4,5te bieden. Andere primer sets, zoals die ITS1 of ITS2 regio's alleen vergroten, kunnen worden gebruikt.- Polymerase kettingreactie (PCR) voor elk monster in drievoudige 50 µL reacties in steriele 0,5 mL PCR buizen of 96-wells-platen voor PCR als volgt instellen: 5 µL van uitgepakte sjabloon DNA (uit stap 3), 33.3 µL van het PCR rang water, 5 µL van 10 x PCR buffer , 1.5 µL van 50 mM MgCl2, 1 µL van 10 mM 2'-deoxynucleoside 5'-trifosfaat, 0,5 µL van 20 µM Fun18Sf vooruit primer, 0,5 µL van 20 µM ITS4R reverse primer en 0.2 µL van Taq polymerase van DNA.
- Reacties in een thermische cycler uitvoeren: denaturatie bij 95 ° C gedurende 3 min; 6 cycli van denaturatie (96 ° C, 30 s) gloeien (50 ° C, 45 s) en de uitbreiding van de primer (72 ° C, 3 min); 20 cycli van denaturatie (96 ° C, 30 s), onthardende (50 ° C, 45 s), en de uitbreiding van de primer (72 ° C, 1 min); en primer extensie bij 72 ° C gedurende 10 minuten houden de mengsels van de reactie bij 4 ° C tot de volgende stap.
- Combineer die de drievoudige PCR reacties zuiveren met behulp van een silica membraan gebaseerde zuivering kit.
Opmerking: Deze procedure maakt het mogelijk voor de verwijdering van PCR onderdelen (inleidingen dNTPs, enzymen, zouten, enz.) en andere verontreinigingen van de versterkte voorbereidingen van DNA.- De drie reacties voor elk monster (150 µL totale) in steriele 1,5 mL microcentrifuge buizen combineren. Voeg bindende buffer (5 M guanidine-HCl, 30% isopropanol) op een volume van 5 x (750 µL) en meng de oplossing door pipetteren op en neer tien keer.
- Voeg 450 µL van het mengsel te draaien van de kolommen in de collectie buizen geplaatst en de buizen op 17,900 x g gedurende 30 s. negeren de filtraten centrifugeren. Voeg de resterende 450 µL toe aan de kolommen samen en centrifugeer bij 17,900 x g gedurende 30 s bij 22 ° C.
Opmerking: De spin kolommen bevatten een silica-membraan waarmee de adsorptie van het DNA aan de kolommen. - Negeren van de filtraten en 750 µL wassen buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80% ethanol) toevoegen aan de kolommen van de spin. Centrifugeer de kolommen bij 17,900 x g gedurende 30 s bij 22 ° C.
Opmerking: Dit proces wordt verwijderd van de verontreinigingen uit de PCR reactie hierboven vermeld. - Negeren van het filtraat en centrifugeer de lege kolommen bij 17,900 x g gedurende 1 minuut bij 22 ° C.
Opmerking: Deze stap is het verwijderen van alle resterende wassen buffer die met downstream toepassingen interfereren kan. - De spin kolommen overbrengen in steriele 1,5 mL microcentrifuge buizen. Voeg 45 µL van elutie buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) en Incubeer de buizen bij kamertemperatuur voor 5 min. Centrifuge de spin kolommen bij 17,900 x g gedurende 1 minuut bij 22 ° C.
- Gebruik het eluted DNA onmiddellijk voor stap 4 en 5 of bewaren bij-20 ° C tot klaar voor gebruik.
Opmerking: De waarbij kan worden opgeslagen voor maximaal een jaar bij-20 ° C. Het wordt aanbevolen dat de DNA-80 ° c worden opgeslagen als op lange termijn opslag vereist is.
5. controle van de schimmel ITS versterking met behulp van de Elektroforese van het gel van de agarose
- Cast een 1% agarose gel met 1 µg/mL ethidiumbromide. Oplossen agar in kokend 1 x Tris-acetaat-EDTA (TAE)-buffer. Zodra de oplossing tot ongeveer 50 ° C afkoelen, de ethidiumbromide toevoegen en giet in gel gegoten.
- Nadat de agarose gel is gestold, dompel de gel in 1 x TAE en de waarbij worden geladen op de gel te bereiden. Voeg tot 8 µL van versterkte DNA, 2 µL van 5 x het laden van de buffer.
Opmerking: Deze volumes kunnen worden aangepast afhankelijk van de concentratie van de buffer van de gewenste laden. - Laden van de monsters, alle 10 µL, op de gel samen met een DNA-ladder voor grootte referentie. Uitvoeren van de gel op 75 V (6 V/cm) voor ongeveer 90 min en visualiseren van bands, meestal gezien tussen 750 en 1.000 basenparen, met behulp van ultraviolet licht (Zie Figuur 5).
6. sequencing en analyse van schimmel ITS-regio's
- Opeenvolging van de uitgepakte gDNA of versterkte schimmel ITS-regio's en het analyseren van de sequenties met behulp van huidige en geschikte methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De verdeling van de soorten binnen een omgeving kan worden beoordeeld met behulp van relatieve overvloed door bepaling van het aantal klonen van elke OTU geïdentificeerd in de monsters van de lucht. Figuur 6 is een grafiek van de kroon van het taxonomisch geplaatste soorten binnen een binnenmilieu na 60 min van de bemonstering van de lucht. Het kan worden waargenomen dat het milieu bevat een verscheidenheid van soorten binnen twee grote schimmel stammen, ascomyceten en branden, evenals de soorten die behoren tot de stam Zygomycota (Rhizopus microsporus). Traditionele beoordelingsmethoden zijn bevooroordeeld richting ascomyceten soorten, als vele branden niet culturable of niet kan worden gedifferentieerd met behulp van microscopie gebaseerde methoden. Sequentiebepaling van schimmel ITS regio's zorgt voor de opsporing van talrijke schimmel soorten, specifiek aantal branden, die vaak onopgemerkt blijven. Analyse van deze omgeving blijkt dat 68% van de schimmel sequenties geïdentificeerd behoorde tot de Basidiomycota met de meeste van hen geplaatst in de orde van Polyporales.
De taxonomische gegevens die zijn verkregen met behulp van sequencing gebaseerde benaderingen kan worden gebruikt om te bepalen van de taxonomische diversiteit binnen een omgeving. Diversiteit indexen, zoals die worden beschreven in tabel 1, bepalen hoe rijk het milieu is, waarin het aantal soorten geïdentificeerd in elk monster wordt beschreven, evenals hoe divers de omgeving is, waarin rekening wordt gehouden met het aantal soorten en de overvloed aan elke. Tabel 1 toont de Chao 1 rijkdom indices en Shannon diversiteit indices voor twee indoor omgevingen. De indices geven hogere rijkdom en diversiteit in de van airconditioning voorziene omgevingen in vergelijking met verdampingsemissies koeler omgevingen. Ook inbegrepen zijn Bray-Curtis volgens coëfficiënten. Deze beschrijven hoe ongelijke monsters binnen de omgeving zijn met betrekking tot de soorten geïdentificeerd binnen elk monster. De monsters binnen zowel van de omgevingen beschreven in tabel 1 zijn zeer ongelijk 98% en 97% voor air conditioner en verdampingsemissies koeler omgevingen, respectievelijk.
Figuur 1: schematische weergave van een 3-delige filter cassette montage. De filter cassette is opgebouwd uit drie delen: een bovenste of GLB stuk (inlaat), een extensie cowl en een basis stuk (stopcontact). Een pad van de steun en de filter worden geplaatst op het gerasterde oppervlak van de base stuk. De extensie cowl vervolgens wordt afgesloten op de base met behulp van een handmatige of pneumatische pers. Voor gebruik met de NIOSH bioaerosol cycloon sampler, het bovenste stuk is gebleven gedurende de bemonstering en wordt dan vervangen voor opslag en vervoer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: schematische weergave van de NIOSH bioaerosol cycloon sampler. De NIOSH cycloon aërosol sampler verzamelt lucht deeltjes door tekenen van lucht in de sampler de instroomopening passeren, en het opstellen van een cycloon die deposito's van deeltjes op de muur van de monster-buizen. Lucht is eerst getrokken in een polypropyleen tube van 15 mL, waar grote deeltjes (> 4 µm) verzamelen op de muren van de buis. Lucht vervolgens stroomt uit de eerste buis en is getrokken in een 1,5 mL microcentrifuge buis, waar het verzamelen van kleinere deeltjes (1 tot en met 4 µm). De resterende deeltjes (< 1 µm) verzamelen op een PTFE-filter, zoals de lucht wordt getrokken uit de sampler. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: voorbeeld van een statische sampler set-up. De afbeelding toont samplers instellen voor statische gebied bemonstering. De NIOSH samplers worden ingesteld tot verzamelen 40 inch (102 cm), en 60 inch (152 cm) vanaf de vloer, hoogten van een vergadering en staande volwassene, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: voorbeeld van een persoonlijke sampler vergadering. De afbeelding illustreert een NIOSH sampler op een rugzak gedragen door een individu. De sampler en macht schakelaar bevinden zich op de banden van het peloton terwijl de bemonsteringspomp bevinden zich bevindt binnen de rugzak zelf. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: voorbeeld van een agarose gel visualiseren versterkt zijn DNA van lucht monsters. De afbeelding toont DNA banden tussen 750 en 1.000 basenparen. Deze bands vertegenwoordigen versterkte schimmel ITS regio's van de geëxtraheerde lucht monsters. DE regio's variëren in grootte, afhankelijk van de oorsprong van de soorten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: voorbeeld kroon grafiek presenteren taxonomisch geplaatst schimmel soorten geïdentificeerd binnen een binnenmilieu. De kroon grafiek toont de relatieve overvloed van schimmel soorten gevonden in 4 monsters verzameld uit huizen na een periode van 60 min-lucht-bemonstering met het NIOSH bioaerosol cycloon sampler. 68% van de soorten die behoren tot de stam Basidiomycota met de resterende behoren tot de ascomyceten (33%) en Zygomycota (1%). De overvloedigste ITS sequenties in deze omgeving behoorde tot de orde van Polyporales en werden geïdentificeerd als Phanerodontia chrysosporium en Gelatoporia dichroa. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Chao-1 rijkdom | Shannon diversiteit | Bray-Curtis afstand | |
| gemiddelde (min, max) | gemiddelde (min, max) | gemiddelde (min, max) | |
| Air Conditioner (n = 9) | 33.86 (15,0, 102.0) | 1.39 (0.68, 2.51) | 0.9778 (0.8313, 1,00) |
| Verdampingsemissies koeler (n = 10) | 25.46 (12,5, 49,5) | 1.10 (0.50, 1.72) | 0.9624 (0.3804, 1,00) |
Tabel 1: voorbeeldgegevens presenteren diversiteit en soorten rijkdom indexcijfers vergelijken indoor omgevingen. De tabel toont Chao 1 rijkdom indexcijfers (aantal soorten per monster), Shannon diversiteit indexcijfers (aantal soorten) en overvloed van elk en Bray-Curtis volgens coëfficiënten (hoe ongelijk de soorten verdeling is tussen de monsters op een schaal van 0 - 1). Deze gegevens tonen hoger rijkdom en diversiteit in een airconditioned omgeving en hoge verschil tussen monsters in beide omgevingen. Deze tabel is gewijzigd van citroenen et al. 10 met toestemming van de Royal Society of Chemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bepaling van de schimmel diversiteit binnen een professionele omgeving met behulp van sequencing gebaseerde benaderingen verbeterd beoordeling over de identificatie en de blootstelling van de schimmel gevaren. Met behulp van deze benadering is toegestaan voor de detectie van vele extra schimmel soorten die vaak niet worden gedetecteerd met behulp van cultuur of microscopie gebaseerde methoden voor de beoordeling. Een methode voor de bemonstering van de bioaerosols van beroeps- en indoor omgevingen en de extractie van genomic DNA van monsters van de lucht voor de versterking en de sequencing wordt hier gepresenteerd. Bepalingen van schimmel diversiteit met behulp van deze methoden is sterk afhankelijk van: (1) de succesvolle en complete winning van genomic DNA uit de lucht samples, (2) versterking van de gDNA met inleidingen die het mogelijk maken voor de vergelijking van de versterkte haar sequenties dwarshelling sequenties in de database en limiet amplificatie vooroordelen, en (3) juiste taxonomische identificatie van de sequenties in de databases.
Succesvolle genomic DNA-extractie is afhankelijk van de extractie methodologieën en reagentia werkzaam in een studie. Zoals is vermeld in het protocol, veel van de bioaerosols en andere biologische en niet-biologische deeltjes verzameld in de fasen van de buis van de NIOSH tweetraps cycloon sampler verzamelen aan de bovenkant van de buis. Het is zeer belangrijk dat de buizen voorzichtig bij het toevoegen van de lysis-buffermengsel niet te verliezen deeltjes worden geopend en dat zij vortexed op een wijze die voorziet in alle deeltjes worden te vallen in de lysis-buffermengsel (rechts omhoog en opwaartse naar beneden). Het is ook belangrijk dat het filter zorgvuldig worden behandeld met behulp van aseptische methoden niet te verstoren van elke bioaerosols die hebben verzameld op het oppervlak voorafgaand aan winning of besmettende DNA te introduceren. Het is aangetoond dat er een grote hoeveelheid variatie tussen veel van de verkrijgbare genomic DNA extractie kits15is. Sommige extractie procedures bias naar specifieke schimmel soorten en resultaat in verschillende DNA levert20. Wanneer het rendement van de DNA na extractie laag is, kunnen hogere PCR reactie wordt gerepliceerd worden uitgevoerd. Niet alleen de winning opbrengsten variëren, maar veel van de kits een aanzienlijke bedrag van bacteriële besmetting van DNA bij te dragen. Om deze reden is het belangrijk om op te nemen van de juiste controles gedurende de hele procedure te identificeren en verwijderen van potentiële verontreinigingen van de reagens van de analyse.
DE versterking is een andere kritische stap van het protocol. De gebruikte methodes voor de extractie kunnen variëren in hun vermogen om PCR remmers van het milieu monsters. Dit is met name betreffende milieu stof monsters21. PCR versterking van monsters geëxtraheerd met behulp van de methode die hier tentoongesteld enkele remming van de PCR na toevoeging van 10 mg van de stof15. Hoewel PCR remming van grootste belang in milieu stof monsters, zou het nog een overweging moeten zijn wanneer DNA geëxtraheerd uit lucht monsters voor het bepalen van de schimmel diversiteit frequentiebanden te versterken. De PCR-primer instellen gebruikt bij deze methode biedt dekking van zowel de ITS 1en ITS 2 regio's. Dit zorgt voor vergelijking met veel van de sequenties in de databases van de reeks geplaatst. Net als bij de extractie procedure, zijn vele versterking en primer vooroordelen eerder beschreven22. De schimmel genoom grootte en gene exemplaaraantal kan ook van invloed zijn haar amplificatie23. Deze vooroordelen moeten rekening worden gehouden bij de interpretatie van de resulterende sequencedata. Taxonomische identificatie van de sequenties is misschien wel de meest kritische component van deze methode. Het is belangrijk identificatiecriteria om consistent te houden. Het vermogen om te identificeren zijn sequenties is afhankelijk van de sequenties die zijn opgeslagen in de databases. Vele sequenties niet tot de soorten niveau kunnen worden geïdentificeerd. Met specifieke criteria bij het maken van de taxonomische identificaties gebaseerd op dwarshelling sequenties, zoals percentage identiteit cutoffs, is van cruciaal belang voor het houden van datasets consistent van studie tot studie.
Vergeleken met traditionele beoordeling benaderingen, biedt uitpakken en het rangschikken van DNA van de schimmel uit beroepsmatige lucht monsters een meer volledige weergave van schimmel diversiteit binnen een omgeving. Naast de beperkingen hierboven besproken, moet worden opgemerkt dat de resultaten van dit soort analyses zijn semi-kwantitatieve in tegenstelling tot cultuur, spore graven of kwantitatieve PCR24 die kwantitatieve gegevens kan opleveren. Rangschikking van de gegevens kan worden gebruikt om te bepalen van de relatieve overvloed per monster evenals schimmel diversiteit statistieken te berekenen. Deze methoden kunnen worden gebruikt in combinatie met andere methoden, zoals qPCR, om meer kwantificeerbare gegevens. De datasets gemaakt met behulp van deze benaderingen kan worden gebruikt in studies van de gezondheid op het werk te krijgen een beter begrip van schimmel gevaren voor specifieke professionele omgevingen. Het ontwikkelen van meer gestandaardiseerde benaderingen van extractie en primer selectie zijn nodig om beter te karakteriseren en vergelijk sequencing gebaseerde studies van schimmel diversiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De bevindingen en conclusies in dit verslag zijn die van de auteurs, en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het Nationaal Instituut voor veiligheid en gezondheid, Centers for Disease Control and Prevention.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een interdepartementale overeenkomst tussen NIOSH en NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
References
- Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
- Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
- Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
- Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
- Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
- Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).
- Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).
- Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
- Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
- Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
- Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).
- Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
- Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
- ACGIH. Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).
- Rodes, C. E., Thornburg, J. W. Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. Ruzer, L. S., Harley, N. H. , CRC Press. (2005).
- Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
- Couch, J., et al. Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).
- Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
- Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
- Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
- Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
- Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).
