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Environment

Erfassung und Gewinnung von betrieblichen Luftproben für Analyse der Pilz DNA

doi: 10.3791/56730 Published: May 2, 2018

Summary

Bestimmung der Pilzen Vielfalt innerhalb einer Umgebung ist eine Methode, bei der arbeitsmedizinischen Untersuchungen, gesundheitliche Gefahren zu identifizieren. Dieses Protokoll beschreibt DNA-Extraktion aus beruflichen Luftproben Amplifikation und Sequenzierung der Pilz ITS Regionen. Dieser Ansatz erkennt viele Pilzarten, die von traditionellen Bewertungsmethoden übersehen werden können.

Abstract

Traditionelle Methoden zur Identifizierung von Pilz Expositionen am Arbeitsplatz-Umgebungen, wie Kultur und Mikroskopie-basierte Ansätze, haben einige Einschränkungen, die den Ausschluss vieler Arten geführt haben. Fortschritte auf dem Gebiet in den letzten zwei Jahrzehnten haben Arbeitssicherheit Forscher zu molekularen basierende Ansätze zur Identifizierung von Pilz Gefahren geführt. Diese Methoden haben zur Erkennung vieler Arten innerhalb der innen- und beruflichen Umgebung geführt, die mit traditionellen Methoden nicht erkannt wurden. Dieser Ansatz zur Bestimmung der Pilz Vielfalt innerhalb der Luft durch genomische DNA-Extraktion, Amplifikation und Sequenzierung taxonomische Identifizierung der Pilz interne Proben Protokolldetails transkribiert Abstandhalter (ITS) Regionen. DIE Sequenzierung Ergebnisse bei der Erkennung von viele Pilzarten, die entweder nicht erkannt oder schwierig, auf Artniveau mit Kultur oder Mikroskopie zu identifizieren sind. Während diese Methoden keine quantitative Maßnahmen der Pilz Belastung angeben, sie bieten einen neuen Ansatz zur Ermittlung schädlicher Wirkungen und können verwendet werden, um allgemeine Artenreichtum und Vielfalt im beruflichen Umfeld bestimmen.

Introduction

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Pilze Belichtungen in innen- und beruflichen Umgebungen können Atemwege Begleiterkrankungen, einschließlich allergische Sensibilisierung und Asthma1führen. Pilz Gefahren ist wichtig für die Bewertung des Risikos und Exposition der Arbeitnehmer zu verhindern. Dieser Pilzen Gefahren möglicherweise ein Ergebnis von indoor Kontamination, Außenluft eindringen oder Störeinflüsse, die bei der Beförderung von Pilz Materialien in Bereiche führen, wo Arbeitnehmer derzeit2. Methoden zur Beurteilung Pilz Exposition haben tragfähige Kultur Probenahme sowie mikroskopische Bestimmung von Pilzsporen enthalten. Diese Ansätze haben mehrere Einschränkungen und oft übersehen viele Pilzarten, die insgesamt Pilz Last3beitragen könnte. Kultur-basierte Ansätze können nur jene tragfähigen pilzorganismen unterscheiden, die auf Nährmedien kultiviert werden kann. Identifizierung von Pilzsporen auf Artniveau über Mikroskopie kann durch Sporen teilen ähnliche Morphologien verwechselt werden. Beide Methoden sind stark abhängig von Mykologen zu analysieren und identifizieren die Pilzarten mit vielen verbleibenden unbekannten.

Um vorhandene Methodiken Berufsrisiko Identifikation und Expositionsabschätzungen zu verbessern, haben viele Forscher Molekulare basierenden Technologien geworden. Sequenzierung-basierte Ansätze für die Bewertung der mikrobiellen Diversität innerhalb der innen- und beruflichen Umgebung ergaben ein breiteres Spektrum an Pilzarten begegnet verglichen mit Methoden wie Mikroskopie und tragfähige Kultur3,4 ,5. Die hier vorgestellte Methode beschreibt die Luftproben der beruflichen Umgebungen und Extraktion von genomischer DNA für die Identifizierung der möglichen Pilzbefall Gefahren. Ermittlung schädlicher Wirkungen geschieht durch Sequenzierung der nuklearen ribosomale interne transkribierten Abstandhalter oder ITS, Regionen, die sehr variabel zwischen Pilzen und wurden häufig verwendet, um Pilzarten6,7zu unterscheiden, 8,9. Viele Arten gefunden in beruflichen Einstellungen, wie z. B. einige Arten gehören zu den Phylum Basidiomycota, sind nicht erkennbar in tragfähige Kultur und sind schwer zu mikroskopisch unterscheiden. Diese Pilze sind in hohe relative Häufigkeit in innen- und beruflichen Umgebungen durch Sequenzierung Pilz ITS Regionen3,4,10bewertet beobachtet worden. DIE Sequenzierung hat mehr wissen in die Vielfalt der Pilze begegnet in innen- und am Arbeitsplatz-Umgebungen zur Verfügung gestellt.

Das Protokoll beschriebenen hier Einzelheiten der Methoden zu sammeln, zu extrahieren und Pilze ITS Regionen von bioaerosolen für Sequenzanalyse zu verstärken. Dieser Ansatz nutzt das National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) zweistufige Zyklon-Aerosol-Sampler, Partikel in der Luft zu sammeln. Dieses Tuch wurde entwickelt, um Bioaerosole und Separate lungengängigen (≤4 µm aerodynamischen Durchmesser) zu sammeln und nicht-Lungengängige (> 4 µm aerodynamischen Durchmesser) Teilchen, die zur Identifizierung der pilzorganismen innerhalb von geschlossenen Räumen ermöglicht, die meisten sind voraussichtlich um Arbeiter11eingeatmet werden. Andere Luft-Sampler, einschließlich Zyklon Sampler gibt es auf dem Markt, die die Fähigkeit haben, im Bereich atembarer Partikel sammeln (< 4 µm) mit12,13filtert. Im Gegensatz dazu trennt der NIOSH zweistufigen Zyklon Aerosol Sampler Pilzarten anhand ihrer aerodynamischen Durchmesser in Einweg, Polypropylen-Rohre, die sofort für downstream-Anwendungen14verarbeitet werden können.

Die Prozesse der genomischen DNA Extraktion und verstärken die Pilzen ITS-Regionen sind in diesem Protokoll aufgeführt. Die Extraktion Methoden vorgestellt wurden speziell für die Extraktion von genomischer DNA aus Pilzen und Bakterien, wie viele kommerzielle Kits Säugetier-Zellen, Bakterien oder speziell Hefen15Ziel entwickelt. Die in dieser Studie verwendeten Primer werden anhand ihrer insgesamt Abdeckung der Pilz seine 1 und ITS 2 Regionen4,5ausgewählt. Sequenzierung dieser Regionen kann für den Vergleich vieler Querneigung ITS-Sequenzen, einschließlich derjenigen dieser Sequenz der ITS-1-Region, ITS-2-Region oder der ITS 1 und ITS 2 Regionen. Die Pilze Vielfalt von Luftproben gesammelt in einer indoor-Einstellung mit, die diese Methoden gezeigt werden, enthüllt eine beträchtliche Anzahl von Sequenzen in die Stämme gelegt, Schlauchpilze und Basidiomycota sowie andere Sequenzen Zugehörigkeit zu weniger dominant Pilz Stämme, wie Zygomycota. Die breite Vielfalt der Pilz Sequenzen identifiziert mit diesem Ansatz würde nicht mit traditionellen Gefahr Kennzeichnung Methoden wie Anbau oder Mikroskopie erfasst werden. Sequenzierung der Pilz ITS Regionen bietet eine verbesserte Methode um Pilz Gefährdungen ermitteln und ermöglichen ein besseres Verständnis der innen- und berufliche Pilz Belichtungen.

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Protocol

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1. Vorbereitung des NIOSH-Aerosol-Samplers

Hinweis: Der NIOSH-Aerosol-Sampler ist ein zweistufiges Zyklon Aerosol-Sampler, der mit zwei Stichproben-Rohren und Polytetrafluorethylen (PTFE) Filter Bioaerosole sammelt.

  1. Überprüfen Sie vor der Montage sorgfältig den Sampler. Überprüfen Sie um sicherzustellen, dass der Sampler ist nicht beschädigt, alle Schrauben sind vorhanden und gemütlich und das Dichtband um die Naht gebildet, indem die beiden Hälften ist intakt. Den o-Ring, um sicherzustellen, dass es kein Kerben, Risse oder Tränen und hat eine sehr dünne Schicht Silikonfett-Sampler zu inspizieren.
    Hinweis: Der Sampler enthält einen 37-mm-3 µm-PTFE-Filter in einem Polystyrol oder Polypropylen dreiteilige FILTERKASSETTE.
    1. FILTERKASSETTE indem ein Cellulose oder Kunststoff Unterstützung Filtervlies (Filter im Lieferumfang) auf die gerasterten Oberfläche des Basis montieren (siehe Abbildung 1). Verwenden Sie Filter Zange Filter oben auf das Filtervlies Unterstützung mit der Sammlung-Seite nach oben zu setzen.
    2. Die Filterkassetten mit Hilfe einer manuellen oder pneumatischen Press zu versiegeln. Hand-Verschluss lassen Luft zu lecken um den Filter und reduzieren die Abscheideleistung. Legen Sie das ringförmige Stück (die Erweiterung Motorhaube), und verwenden Sie die Presse es fest und gleichmäßig nach unten drücken. Drücken Sie die Erweiterung Motorhaube auf den Filter fest genug um sicherzustellen, dass die Luft um den Filter nicht leckt.
      Hinweis: Das obere Stück der Kassette wird nicht verwendet, während der Probenahme aber sollten gespeichert werden, um den Filter zu decken, sobald die Probenahme abgeschlossen ist.
    3. Die montierte Kassette auf der Oberseite des Samplers passen und so weit wie möglich nach unten drücken. Wickeln Sie ein Stück Klebeband 19 mm (3/4 Zoll) auf der Außenseite der FILTERKASSETTE und Sampler zu FILTERKASSETTE in Position zu halten und zu handeln als backup Dichtung um Leckagen zu vermeiden.
    4. Schrauben Sie jedes Rohr fest und vollständig in die Sampler bis es Talsohle und Wrap Dichtband um jedes Rohr als Sekundärdichtung gegen Lecks ein.
      Hinweis: Die erste Tube, 15 mL Polypropylen Rohr, sammelt nicht Lungengängige Partikel mit einem aerodynamischen Durchmesser von > 4 µm. Die zweite Röhre, einen 1,5 mL Polypropylen Microcentrifuge Schlauch sammelt Lungengängige Partikeln zwischen 1 bis 4 µm. Die verbleibenden kleineren Teilchen < 1 µm werden gesammelt auf PTFE Filtern (siehe Abbildung 2).
  2. Kalibrieren Sie den Luftstrom durch die NIOSH-Sampler mit Kanope Kalibrierung vor jedem Gebrauch als Unterschiede in den Filtern und Sampler werden dazu führen, dass des Luftstroms zu variieren.
    1. Um eine Kalibrierung Glas zu verwenden, einfügen Sie das Glas Luer Formstück in den oberen Teil der FILTERKASSETTE, legen Sie den Sampler in das Glas und verschließen Sie das Glas.
    2. Schließen Sie die Kalibrierung Jar an eine Kalibrierung-Flow-Meter und die Probenahme-Pumpe. Schalten Sie den Durchflussmesser und lassen Sie ihn für ein paar Minuten aufwärmen. Beachten Sie, dass der Durchflussmesser muss immer einen Filter angebracht, seine Einlass zur Vermeidung einer Kontamination der Durchflussmesser und dem Sampler.
    3. Die Probenahme-Pumpe einschalten und laufen für ein paar Minuten zum Aufwärmen und stabilisieren lassen.
    4. Stellen Sie die Pumpe, um die korrekte Durchflussmenge bei 3,5 L/min eingestellt.
      Hinweis: Die Durchflussmenge für den NIOSH-Aerosol-Sampler ist in der Regel bis 3,5 L/min eingestellt. Bei diesem Durchflussrate entspricht der Sampler an die ACGIH/ISO-Kriterien für Lungengängige Partikel Probenahme16. Andere Durchflussmengen können verwendet werden, wenn unterschiedliche Cut-Off-Größen erwünscht sind oder um den Lärmpegel zu reduzieren aber seien Sie sich bewusst, dass wenn eine unterschiedliche Fließgeschwindigkeit verwendet wird, dann der Sampler nicht mehr die lungengängigen Probenahme-Kriterien entspricht.
    5. Wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist, schalten Sie die Pumpe und Durchflussmesser.

2. statische und persönliche Aerosol Probenahme

  1. Richten Sie die NIOSH-Aerosol-Generator für entweder persönlich oder statischen Bereich Probenahme.
    Hinweis: Statische Probenahme bezieht sich auf die Verwendung des Aerosol-Samplers, während sie ein Stativ oder anderen Haltevorrichtung befestigt ist (siehe Abbildung 3), da im Vergleich zu persönlichen Probenahme bei der Sampler und die Pumpe auf den Menschen untersucht (siehe Abbildung 4) montiert werden.
    1. Für die statischen Bereich Probenahme, halten die Sampler so nah wie möglich an den bestimmten Bereich untersucht. Halten Sie die Sampler Lufteinlässe, Zimmer Eingänge und interessanten Plätzen, die in den Pfad des Luftstroms möglicherweise entfernt.
      Hinweis: Aerosol-Konzentrationen können auch über kurze Distanzen unterschiedlich vor allem, wenn die Aerosol-Quelle in den Raum17.
    2. Für persönliche Probenahme der Sampler innerhalb der Person Atemzone eingerichtet. Der Revers, Schulter oder Brust beimessen Sie den Sampler, und platzieren Sie die Probenahme-Pumpe an der Taille oder in einem Rucksack.
      Hinweis: Die Atemzone wird allgemein angenommen, zu einer 30 cm Halbkugel rund um eine Person, die Nase, von denen die Mehrheit der Luft während der Inhalation17gezeichnet wird.
  2. Stellen Sie sicher, dass der Sampler Schläuche auch frei von den Sampler-Inlets und nichts ist die Einlässen zu behindern oder den Luftstrom in den Sampler stören. Der Sampler Schläuche muss nicht eingeklemmt oder geknickt werden. Jede Blockade wird dazu führen, dass die Pumpe stoppt.
  3. Die Pumpen schalten. Überprüfen Sie nach einer Minute oder zwei, ob die Pumpen noch laufen.
    Hinweis: Verhalten Luft Probenahme für Zeiträume von weniger als 10 min bis hin zu einer Arbeitsschicht volle 8 h, je nach Umgebung10,18,19. In Abbildung 6 dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für eine 60 min. Abtastperiode in Innenräumen.
  4. Nach Abschluss der Luftproben sammeln Sie das Probenröhrchen und Filter. Entfernen Sie das Dichtband, Schrauben Sie die Rohre und verschließen sie. Platzieren Sie das dritte Stück der FILTERKASSETTE über den Filter. Speichern Sie Proben bei 4 ° C bis zur Verarbeitung bereit.

3. die Extraktion von genomischer DNA aus Luftproben

  1. Jede Stufe des Samplers NIOSH BC251 genomischen DNA (gDNA) entziehen. Verarbeiten der Luft Probenahme primärgefäßen und separat zu filtern, um zur Bestimmung von lungengängigen und nicht-Lungengängige mikrobiellen Aerosolen in der Probe zu ermöglichen.
    Hinweis: Alternativ, die drei Stufen können kombiniert und extrahiert, wenn Probe Inokulum zu klein ist.
    1. In einer Klasse II biologische Sicherheitswerkbank oder Laminar-Flow sauberen Werkbank aseptisch entfernen Sie den Filter. Wischen Sie die Probenahme-Kassette mit 70 % Ethanol und hebeln die Probenahme-Kassette mit Kassette Öffnungswerkzeug öffnen aus. Verwenden Sie ein Filter-Lifter, um Filter und Support-Pad nach oben schieben. Fassen Sie den Filter mit Filter Pinzette und legen Sie sie in eine sterile Petrischale. Schneiden Sie den Filter in 6 gleich große Stücke und legen Sie sie in ein 2 mL verstärkt Röhrchen mit 300 mg Glasperlen (0,2 - 0,5 mm).
    2. Das Rohr mit dem Filter in flüssigem Stickstoff für 30 s und legen Sie sie sofort in eine Perle Mühle Homogenisator eingestellt auf 4,5 m/s für 30 s.
    3. Wiederholen Sie Schritt 3.1.2 ein-bis zweimal, bis der Filter zerkleinert ist. Kleine Stücke von intakten Filter verbleiben. 0,5 mL Lyse-Puffer (4 M Harnstoff, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), pH 7,4) hinzugeben.
    4. 15 mL und Sampler Luftschläuche 1,5 mL 0,3 mL Lyse Puffer hinzufügen. Wirbel der Röhre für 10-15 s, während aufrecht und dann weitere 10-15 s invertiert. Übertragen Sie den Inhalt jedes Rohr auf 2 mL verstärkt Röhrchen mit 300 mg Glasperlen.
      Hinweis: Ein Großteil des Materials in jedem Sampler-Röhrchen gesammelt werden am oberen Rand der Röhre ansammeln.
    5. Alle Rohre in die Wulst Mühle Homogenisator bei 4,5 m/s für 30 s und Zentrifuge verarbeiten Sie 20.000 x g für 1 min bei 22 ° C. Übertragen Sie Überstände an sterilen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren Sie der Rohre bei 20.000 x g wieder für 1 min bei 22 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt.
  2. Fügen Sie 30 µL Lyse-Reagenz (siehe Tabelle der Materialien), um jedes Rohr und die Röhrchen bei 37 ° C für 15 min inkubieren.
  3. 0,2 mL Bindung Puffer (Harnstoff 10 M, 6 M Guanidin-HCl, 10 mM Tris-HCl, 20 % Triton x-100, pH 4,4) hinzugeben und Proteinase K (100 µg/mL) für jedes Rohr und inkubieren Sie die Rohre bei 70 ° C für 10 min. hinzufügen 100 µL Isopropanol für jedes Rohr.
  4. Der Extrakt-Lösungen in Glasfaser Filterschläuche (700 µL Kapazität) in 2 mL Röhrchen gelegt und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 x g für 30 s bei 22 ° C. Verwerfen Sie die Röhrchen zu und die Filterschläuche in neue 2 mL Röhrchen.
  5. Jedes Rohr 0,5 mL Inhibitor Entfernung Puffer (5 M Guanidin-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6,6, 38 % Ethanol) hinzu und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 x g für 30 s bei 22 ° C. Verwerfen Sie die Röhrchen zu und die Filterschläuche in neue 2 mL Röhrchen.
  6. Jedes Rohr 0,5 mL Waschpuffer (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80 % Ethanol) hinzu und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 x g für 30 s bei 22 ° C. Verwerfen Sie die Röhrchen zu und die Filterschläuche in neue 2 mL Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang.
  7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 x g für eine zusätzliche 1 min bei 22 ° C, alle restlichen Waschpuffer zu entfernen. Entsorgen Sie die Röhrchen und die Filterschläuche in neue Röhrchen.
  8. Addieren Sie 100 µL (≥70 ° C) Elution Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) für jede Röhre warm und inkubieren sie bei Raumtemperatur für ca. 1-2 min. Zentrifuge die Röhrchen bei 20.000 x g für 30 s bei 22 ° C. Übertragen Sie die leeren Filter-Rohre zu einem sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und erneut bewerben Sie Eluaten aus Schritt 3,8. Inkubation bei Raumtemperatur für ca. 1-2 min. Zentrifuge bei 20.000 x g für 30 s bei 22 ° C.
    Hinweis: Eluate verwendet werden sofort für Schritt 4 oder bei-20 ° C bis zum Gebrauch gespeichert. Genomischer DNA gelagert werden bis zu einem Jahr bei-20 ° C. Es wird empfohlen, dass DNA bei-80 ° C gelagert werden, wenn langfristige Speicherung erforderlich ist.

4. Verstärkung der Pilz ribosomalen DNA

  1. Verwenden Sie universal Pilz Primer, um seine Regionen 1 und 2 aus den extrahierten gDNA zu verstärken.
    Hinweis: Für dieses Protokoll der Primer paar Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ") werden verwendet, um die größte Abdeckung der ITS Regionen4,5. Anderen Primer-Sets, wie diejenigen, die allein ITS1 oder ITS2 Regionen verstärken können verwendet werden.
    1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für jede Probe in dreifacher Ausfertigung 50 µL Reaktionen in sterile 0,5 mL PCR-Röhrchen oder 96-Well-PCR-Platten wie folgt einrichten: 5 µL des extrahierten Schablone DNA (aus Schritt 3), 33,3 µL des PCR-Grade Wasser, 5 µL 10 X PCR Puffer , 1,5 µL 50 mM MgCl2, 1 µL 10 mM 2' Deoxynucleoside 5'-Triphosphate 0,5 µL 20 µM Fun18Sf vorwärts Grundierung, 0,5 µL 20 µM ITS4R rückwärts-Primer und 0,2 µL Taq -DNA-Polymerase.
    2. Reaktionen in einem Thermocycler durchführen: Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 6 Zyklen der Denaturierung (96 ° C, 30 s) Glühen (50 ° C, 45 s) und Primer Extension (72 ° C, 3 min); 20 Zyklen der Denaturierung (96 ° C, 30 s), Glühen (50 ° C, 45 s), und Primer Extension (72 ° C, 1 min); und Grundierung Erweiterung bei 72 ° C für 10 min. halten die reaktionsgemischen bei 4 ° C bis zum nächsten Schritt.
  2. Kombinieren Sie die dreifacher PCR-Reaktionen zu reinigen mit einem Kieselsäure Membran-basierten Reinigung-Kit.
    Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht die Entfernung von PCR-Komponenten (Primer, dNTPs, Enzyme, Salze, etc.) und andere Schadstoffe aus der amplifizierten DNA-Vorbereitungen.
    1. Kombinieren Sie die drei Reaktionen für jede Probe (insgesamt 150 µL) in sterilen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie Bindung Puffer (5 M Guanidin-HCl, 30 % Isopropanol hinzu) auf einem 5 X Volumen (750 µL) und mischen Sie die Lösung durch nach oben und unten zehnmal pipettieren.
    2. Fügen Sie 450 µL der Mischung zu drehen Sie Spalten in Röhrchen gelegt und Zentrifugieren der Rohre bei 17.900 x g 30 S. verwerfen die Filtrate. Die Spalten der verbleibenden 450 µL hinzu und Zentrifugieren bei 17.900 x g für 30 s bei 22 ° C.
      Hinweis: Die Spin-Spalten enthalten eine Silica-Membran, die Adsorption von der DNA auf die Spalten ermöglicht.
    3. Verwerfen Sie der Filtrate und fügen Sie 750 µL-waschen-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80 % Ethanol hinzu) auf die Spin-Spalten. Zentrifugieren Sie die Spalten bei 17.900 x g für 30 s bei 22 ° C.
      Hinweis: Dieser Vorgang entfernt die Schadstoffe aus der oben genannten PCR-Reaktion.
    4. Das Filtrat verwerfen und Zentrifugieren der leeren Spalten bei 17.900 x g für 1 min bei 22 ° C.
      Hinweis: Dieser Schritt ist, entfernen alle verbleibenden Waschpuffer die downstream-Anwendungen beeinträchtigen könnten.
    5. Übertragen Sie die Spin-Spalten auf sterile 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 45 µL Elution Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) und inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 5 min. Zentrifuge die Spin-Spalten bei 17.900 x g für 1 min bei 22 ° C.
    6. Verwenden die eluierten DNA sofort für die Schritte 4 und 5 oder bis zur Verwendung bei-20 ° C lagern.
      Hinweis: Der Amplifikate gelagert werden bis zu einem Jahr bei-20 ° C. Es wird empfohlen, dass DNA bei-80 ° C gelagert werden, wenn langfristige Speicherung erforderlich ist.

5. Überprüfung der Pilz ITS-Amplifikation mit Agarose-Gelelektrophorese

  1. Besetzung einer 1 % Agarose-gel mit 1 µg/mL Interkalation Bromid. Agarose in kochendem 1 x Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer zu lösen. Sobald die Lösung auf etwa 50 ° C abgekühlt ist, fügen Sie die Interkalation Bromid und Gießen Sie Gel gegossen.
  2. Nachdem das Agarosegel erstarrt ist, Tauchen Sie das Gel in 1 X TAE und bereiten die Amplifikate auf das Gel geladen werden. 8 µL der amplifizierten DNA fügen Sie 2 µL Ladepuffer 5-fach hinzu.
    Hinweis: Diese Bände ist abhängig von der Konzentration des Puffers gewünschte laden einstellbar.
  3. Laden Sie die Proben, alle 10 µL auf das Gel zusammen mit einer DNA-Leiter Größe zu Referenzzwecken. Führen Sie das Gel bei 75 V (6 V/cm) für ca. 90 min und visualisieren Bands, gesehen in der Regel zwischen 750 und 1.000 Basenpaare, mit ultraviolettem Licht (siehe Abbildung 5).

6. die Sequenzierung und Analyse von Pilz ITS Regionen

  1. Sequenz der extrahierten gDNA oder verstärkten Pilzbefall ITS-Regionen und die Sequenzen mit aktuellen und geeignete Methoden zu analysieren.

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Representative Results

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Die Artenverteilung in einem Umfeld kann mit relative Häufigkeit durch Bestimmung der Anzahl der Klone von jeder OTU identifiziert in den Luftproben beurteilt werden. Abbildung 6 ist ein Krone-Diagramm aus der taxonomisch platzierten Arten in Innenräumen nach 60 min von Luftproben. Es ist festzustellen, dass die Umwelt enthält eine Vielzahl von Arten innerhalb der zwei großen Pilz Stämme, Schlauchpilze und Basidiomycota sowie Arten, die Zugehörigkeit zu den Phylum Zygomycota (Edelschimmel Microsporus). Traditionelle Methoden der Bewertung sind in Richtung einzelligen Arten, voreingenommen, da viele Basidiomycota nicht kultivierbarer oder kann nicht mit Mikroskopie-basierte Methoden unterschieden werden. Sequenzierung der Pilz ITS Regionen ermöglicht die Erkennung von zahlreichen Pilzarten, speziell einige Basidiomycota, die oft unerkannt. Analyse dieser Umgebung zeigt, dass 68 % der Pilzen Sequenzen identifiziert gehörte zu den Basidiomycota mit die meisten von ihnen in der Reihenfolge Polyporales platziert.

Die taxonomischen Daten Sequenzierung-basierte Ansätze können verwendet werden, um die taxonomische Diversität innerhalb einer Umgebung zu bestimmen. Vielfalt-Indizes, wie Sie in Tabelle 1 dargestellt zu bestimmen, wie Reich die Umgebung ist die beschreibt die Anzahl der Arten in jeder Probe identifiziert, sowie wie vielfältig die Umwelt ist, die berücksichtigt die Anzahl der Arten und der Fülle von jeder. Tabelle 1 zeigt die Chao 1 Reichtum Indizes und Shannon Vielfalt Indizes für zwei indoor-Umgebungen. Die Indizes zeigen höhere Reichtum und die Vielfalt in klimatisierten Umgebungen im Vergleich zu evaporative Kühler Umgebungen. Bray-Curtis Unähnlichkeit Koeffizienten sind ebenfalls vorhanden. Diese beschreiben, wie unterschiedliche Proben in der Umgebung sind in Bezug auf die Arten, die in jeder Probe identifiziert. Die Proben in beiden Umgebungen in Tabelle 1 beschrieben werden bzw. bei 98 % und 97 % für Klimaanlage und evaporative Kühler Umgebungen sehr unähnlich.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung einer dreiteiligen Filter Kassette Versammlung. Die FILTERKASSETTE besteht aus drei Teilen: ein Top oder Kappe Stück (Einlass), eine Erweiterung Motorhaube und ein base Stück (Steckdose). Eine Unterstützung Pad und Filter werden auf die gerasterten Oberfläche des Basis platziert. Die Erweiterung Motorhaube wird dann auf den Belag mit einem manuell oder pneumatisch Presse versiegelt. Für die Verwendung mit der NIOSH Bioaerosol Zyklon Sampler das Oberteil ist während der Probenahme aufgehört und wird dann für Lagerung und Transport ersetzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung der NIOSH Bioaerosol Zyklon Sampler. Der NIOSH Zyklon Aerosol Sampler sammelt zerstreute Partikel indem er Luft in den Sampler durch den Einlass, und produziert einen Zyklon, der Partikel an der Wand der Probenröhrchen Einlagen. Luft wird zunächst in ein 15 mL Polypropylen Röhrchen gezogen, wo große Partikel (> 4 µm) an den Wänden des Schlauches sammeln. Dann Luft wird fließt aus der ersten Röhre und zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, wo kleinere Partikel (1 bis 4 µm) zu sammeln. Die restlichen Partikel (< 1 µm) auf einem PTFE-Filter zu sammeln, wie die Luft aus dem Sampler gezeichnet wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Beispiel einer statischen Sampler Aufstellung. Das Bild zeigt Sampler für statischen Bereich Probenahme eingerichtet. NIOSH-Sampler setzen repräsentieren Höhen eines sitzenden und stehenden Erwachsenen, jeweils bis zu sammeln 40 Zoll (102 cm) und 60 Zoll (152 cm) aus dem Boden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Beispiel einer persönlichen Sampler Versammlung. Die Abbildung zeigt einen NIOSH-Sampler von einer Person auf einem Rucksack getragen. Der Sampler und Power-Schalter befinden sich an den Trägern des Packs während die Probenahme Pumpe innerhalb der Rucksack selbst befindet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Beispiel für ein Agarose-Gel-Visualisierung verstärkt seine DNA aus Luftproben. Das Bild zeigt DNA-Bänder zwischen 750 und 1000 Basenpaare. Diese Bänder repräsentieren verstärkte Pilzbefall ITS Regionen aus Abluft Proben. SEINE Regionen variieren in ihrer Größe je nach Spezies Herkunft. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Beispiel Krone Diagramm präsentiert taxonomisch platziert Pilzarten in Innenräumen identifiziert. Das Krone-Diagramm zeigt die relative Häufigkeit der Pilzarten in 4 Proben aus Häusern, die nach einer 60 min Luft Probenahme mit der NIOSH Bioaerosol Zyklon Sampler gefunden. 68 % der identifizierten Arten gehören zu den Phylum Basidiomycota mit den restlichen Zugehörigkeit zu der Schlauchpilze (33 %) und Zygomycota (1 %). Die am häufigsten vorkommende ITS-Sequenzen in diesem Umfeld gehörte der Ordnung Polyporales und wurden als Phanerodontia Chrysosporium und Gelatoporia Dichroaidentifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Chao-1 Reichtum Shannon-Vielfalt Bray-Curtis-Entfernung
Mittelwert (min, max) Mittelwert (min, max) Mittelwert (min, max)
Klimaanlage (n = 9) 33.86 (15,0, 102,0) 1.39 (0,68, 2,51) 0.9778 (0.8313, 1.00)
Verdampfungskühler (n = 10) 25.46 (12,5, 49,5) 1.10 (0,50, 1,72) 0.9624 (0.3804, 1.00)

Tabelle 1: Beispieldaten präsentiert Vielfalt und Arten Reichtum Indizes vergleichen Innenumwelt. Die Tabelle zeigt Chao 1 Reichtum Indizes (Anzahl der Arten je Probe), Shannon-Vielfalt-Indizes (Anzahl der Arten) und Fülle der einzelnen und Bray-Curtis Unähnlichkeit Koeffizienten (wie unähnlich ist die Artenverteilung zwischen Proben auf einer Skala von 0 - 1). Diese Daten zeigen höhere Reichtum und die Vielfalt in klimatisierten Umgebungen und hohe Unähnlichkeit zwischen Proben in beiden Umgebungen. Diese Tabelle wurde von Zitronen Et al.modifiziert. 10 mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry.

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Discussion

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Bestimmung der Pilzen Vielfalt im beruflichen Umfeld durch Sequenzierung-basierte Ansätze hat Pilz Gefährdungsabschätzung Identifikation und Belichtung verbessert. Mit diesem Ansatz hat für den Nachweis von vielen zusätzlichen Pilzarten, die oft nicht erkannt werden mit Kultur oder Mikroskopie-basierte Methoden der Bewertung erlaubt. Ein Verfahren für die Probenahme von bioaerosolen aus beruflichen und indoor-Umgebungen und die Extraktion von genomischer DNA aus Luftproben für seine Amplifikation und Sequenzierung wird hier vorgestellt. Bestimmungen der Pilz Vielfalt mit diesen Methoden ist stark abhängig von: (1) erfolgreich und vollständige Extraktion von genomischer DNA aus der Luft Proben, (2) Verstärkung der gDNA mit Primern, die für den Vergleich von der verstärkten seine Sequenzen zu überhöht ermöglichen Sequenzen in der Datenbank und Limit Verstärkung Vorurteile und (3) korrekte taxonomische Identifizierung der Sequenzen innerhalb der Datenbanken.

Erfolgreiche genomische DNA-Extraktion ist abhängig von der Extraktion Methoden und Reagenzien in einer Studie beschäftigt. Wie im Protokoll erwähnt wird, ein Großteil der Bioaerosole und anderen biologischen und nicht-biologischen Partikel gesammelt in den Rohr-Phasen der NIOSH zweistufigen Zyklon Sampler sammeln an der Spitze des Rohres. Es ist sehr wichtig, dass die Rohre vorsichtig geöffnet werden, wenn den Lyse-Puffer nicht zu verlieren, Partikel hinzufügen und sie verwirbelt in einer Weise, dass für alle Partikel in der Lyse-Puffer (rechts oben und den Kopf nach unten) fallen können. Es ist auch wichtig, dass der Filter sorgfältig behandelt mit aseptischen Methoden nicht zu jedem Bioaerosole beeinträchtigen, die auf der Oberfläche vor der Extraktion gesammelt haben oder kontaminierende DNA einzuführen. Es wurde nachgewiesen, dass gibt es eine große Menge an Variation zwischen vielen der im Handel erhältlichen genomische DNA Extraktion Kits15. Einige Extraktion Verfahren Voreingenommenheit gegenüber bestimmten Pilzarten und führen zu unterschiedlichen DNA ergibt20. Wenn die DNA-Ausbeute nach Extraktion niedrig ist, können höhere PCR Reaktion Wiederholungen durchgeführt werden. Nicht nur die Gewinnung Erträge variieren, aber viele der Kits tragen eine erhebliche Menge an DNA Verkeimung. Aus diesem Grund ist es wichtig, geeignete Kontrollen während des Verfahrens zu identifizieren und entfernen mögliche Reagenz Verunreinigungen aus der Analyse zu berücksichtigen.

DIE Verstärkung ist ein weiterer wichtiger Schritt des Protokolls. Die Extraktion Methoden variieren in ihrer Fähigkeit, PCR-Inhibitoren aus der Umweltproben zu entfernen. Dies ist insbesondere bei ökologischen Staub Proben21. PCR-Amplifikation der Proben mit der hier vorgestellten Methode extrahiert stellte einige PCR-Hemmung nach Zugabe von 10 mg Staub15. Obwohl PCR Inhibition von größter Bedeutung im ökologischen Staubproben ist, sollte es noch eine Überlegung sein, wenn aus Luftproben für die Bestimmung der Pilz Vielfalt extrahierte DNA zu verstärken. Der PCR-Primer setzen in dieser Methode verwendet bietet eine Berichterstattung über die ITS 1 und ITS 2 Regionen. Dies ermöglicht Vergleich vieler die Sequenzen in den Sequenzdatenbanken gelegt. Wie bei der Extraktionsverfahren wurden viele Verstärkung und Primer Vorurteile zuvor beschriebenen22. Die pilzartige Genom-Größe und gen Kopienzahl kann auch seine Verstärkung23beeinflussen. Diese Vorurteile sollte berücksichtigt werden, wenn die resultierende Sequenzdaten interpretieren. Taxonomische Identifizierung von seine Sequenzen ist vielleicht die wichtigste Komponente dieser Methode. Es ist wichtig, Identifikation Kriterien konsistent zu halten. Die Fähigkeit, seine Sequenzen zu identifizieren ist abhängig von der Sequenzen, die in den Datenbanken überhöht. Viele Sequenzen werden nicht auf Artniveau identifiziert. Bestimmte Kriterien ist bei der taxonomischen Identifikationen basierend auf geneigte Sequenzen, wie Prozentsatz Identität Abschaltungen, entscheidend für Datasets von Studie zu Studie konsistent halten.

Im Vergleich zu traditionellen Bewertung Ansätze, bietet extrahieren und Sequenzierung Pilz DNA aus beruflichen Luftproben eine vollständigere Darstellung der Pilz Vielfalt innerhalb einer Umgebung. Neben der oben beschriebenen Einschränkungen ist darauf hinzuweisen, dass die Ergebnisse solcher Analysen sind semi-quantitativen im Gegensatz zu Kultur, Spore zählt oder quantitative PCR-24 , die quantitative Daten liefern können. Sequenzierung Daten lässt sich bestimmen, relative Häufigkeit pro Probe sowie Pilz Vielfalt Metriken zu berechnen. Diese Methoden können in Verbindung mit anderen Methoden wie qPCR, verwendet werden, um weitere quantifizierbaren Daten zu erhalten. Die Datasets erstellt, mit diesen Ansätzen lässt sich ein besseres Verständnis der Pilz Gefahren in bestimmten beruflichen Umgebungen in arbeitsmedizinischen Untersuchungen. Entwicklung mehr standardisierte Ansätze der Extraktion und Primer Auswahl sind notwendig, um besser zu charakterisieren und Sequenzierung-basierten Studien der Pilz Vielfalt zu vergleichen.

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Disclosures

Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind diejenigen der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die offizielle Position des nationalen Instituts für Arbeitssicherheit und Gesundheit, Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde zum Teil durch eine interinstitutionelle Vereinbarung zwischen NIOSH und NIEHS (AES12007001-1-0-6) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler NIOSH BC251 The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps Fisher Scientific 02-681-373 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352096 15 mL polypropylene tubes for air sampling
Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width McMaster-Carr 76505A1 sealing tape
Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm SKC Inc. 225-3LF 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs
PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm EMD Millipore FSLW03700 Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads
Fisherbrand filter forceps Fisher Scientific 09-753-50 filter forceps
Model 502 Precision PanaPress PanaVise 502 pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press
Scotch Super 33+ vinyl electrical tape McMaster-Carr 76455A21 19 mm tape
Multi-purpose Calibration Jar, Large SKC Inc. 225-112 calibration jar
Universal PCXR4 Sample Pump SKC Inc. 224-PCXR4 sampling pump
Mass Flowmeter 4140 TSI Inc. 4140 flow meter
Roche High Pure PCR Template Kit Roche Diagnostics 11796828001 Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes
Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps Fisher Scientific 15340162 2 mL reinforced tubes for bead homogenization
Glass beads, acid washed, 212-300 µm Sigma-Aldrich G1277 glass beads
Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer Fisher Scientific 15-340-163 bead homogenizer
CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X Sigma-Aldrich C8740 lysis reagent
Platinum Taq polymerase Invitrogen 10966-018 Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender
dNTP Mix Invitrogen 18427-088 10 mM dNTP mix
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye
Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System Thermo Fisher B1 or B2
TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder Thermo Fisher 10488-085 DNA ladder

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References

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Erfassung und Gewinnung von betrieblichen Luftproben für Analyse der Pilz DNA
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Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).More

Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).

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