Summary
Dit protocol beschrijft een methode om stabiele integratie van een gen van belang in het menselijk genoom door het transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty -systeem. Voorbereiding van de integratie van defecte lentivirale vectoren, de in vitro -transductie van menselijke cellen en de moleculaire test op getransduceerde cellen worden gemeld.
Abstract
De Schone slaapster (SB) transposon is een niet-virale integratie systeem met bewezen werkzaamheid voor genenoverdracht en functionele genomica. Voor het optimaliseren van de SB transposon machine, zijn een transcriptionally gereglementeerde hyperactief transposase (SB100X) en T2 gebaseerde transposon tewerkgesteld. Typisch, de transposase en de transposon Transient worden geleverd door plasmide transfectie en SB100X expressie wordt aangestuurd door een constitutief promotor. Hier beschrijven we een efficiënte methode om te leveren van de SB-componenten aan menselijke cellen die resistent zijn tegen verschillende transfectie van fysische en chemische methoden, om te controleren SB100X expressie en stabiel integreren een gen van belang (Indiase) door middel van een "cut and paste" SB mechanisme. De expressie van hyperactieve transposase is streng gecontroleerd door het Tet-ON systeem, op grote schaal gebruikt om te bepalen van genexpressie sinds 1992. Het gen van belang wordt geflankeerd door omgekeerde herhalingen (IR) van de T2 transposon. Beide componenten SB zijn verpakt in integratie defecte lentivirale vectoren Transient geproduceerd in HEK293T cellen. Menselijke cellen, cellijnen of primaire cellen van menselijk weefsel, zijn in vitro Transient getransduceerde met virale vectoren. Bij toevoeging van doxycycline (dox, tetracycline analoge) in het kweekmedium, een fijnafstemming van transposase expressie wordt gemeten en leidt tot een duurzame integratie van het gen van belang in het genoom van de behandelde cellen. Deze methode is efficiënt en die gelden voor de cellijn (bijvoorbeeld HeLa cellen) en primaire cellen (bijvoorbeeld menselijke primaire keratinocyten), en vormt aldus een waardevol instrument voor genetische manipulatie en therapeutische genenoverdracht.
Introduction
Het hyperactieve SB100X transposase gekoppeld aan de T2 gebaseerde transposon is reeds gebruikt in preklinische gene therapie toepassingen1,2,3, genoom wijzigingen4,5, en Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)6,7te herprogrammeren. Typisch, de SB-componenten worden Transient verstrekt door plasmide transfectie en een sterke constitutieve promotor rijdt de uitdrukking van de transposase. Echter, ondanks de verbeterde nieuwe methoden van transfectie, levering van de tweecomponenten systeem blijft een uitdaging voor vele toepassingen. De ontwikkeling van een nieuw protocol voor de levering heeft dus steeds meer belangstelling. Naast de methoden van de transfectie voor plasmide8 en mRNA9, virale levering gebaseerd op adenovirale10,11, adeno-geassocieerde virale (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral,14 en lentivirale vectoren15 heeft voorgesteld in het verleden. Met name moet het systeem van keuze garanderen een voorbijgaande aflevering van de SB-onderdelen zonder integratie van de virale vector. Toch roept de constituerende uitdrukking van transposase bezorgdheid over de veiligheid als gevolg van het risico van een onbeheersbare rehopping van het transposon.
Daarom, transcriptionele regulering van SB100X door een verfijnde Tet-ON systeem is de eerste uitdaging. Een gemodificeerde Tet-responsieve promotor, verkregen door te vervangen door de oorspronkelijke promotor van het ontwikkelde minimale cytomegalovirus (CMV) met de minimale promotor (-81) van het gen Timidine Kinase (TK) van Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1)16, wordt gekloond stroomopwaarts van de SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). De gemuteerde omgekeerde-tetracycline-transactivator rtTA2s-M217 onder de controle van de sterke constitutieve promotor (fosfoglyceraat promotor, PGK) gekloond in een verschillende plasmide wordt uitgedrukt (pCCL-PGKrtTA2S-M2). Wanneer toegevoegd aan het kweekmedium, dox bindt de rtTA2s-M2 modulator en aanbinden van de promotor van de Tet complexe of, resulterend in strak gereguleerde inductie van SB100X expressie18.
De tweede belangrijke uitdaging vloeit voort uit de inefficiënte transfectie van menselijke primaire cellen door verschillende fysische en chemische methoden. Om efficiënt transposase in menselijke cellen resistent tegen transfectie, de SB100X en de rtTA2s-M2 expressie cassettes worden verpakt in twee integratie defecte lentivirale vectoren (IDLVs)19: IDLVTKSB en IDLVrtTA2s- M2. Virale vectoren worden Transient geproduceerd als derde generatie vectoren in HEK293T cellen20 en pseudotyped met de glycoproteïne G van het Vescicular Stomatitis Virus (VSV-G), die een breed spectrum van infectie verleent. Vector deeltjes worden geconcentreerd door ultracentrifugatie en getitreerd met HIV-1 Gag p24 immunocapture. Als u wilt transduce cellijnen en primaire cellen, vector deeltjes zijn complexvorm met polybrene en worden geïncubeerd met de doelcellen in de aanwezigheid of afwezigheid van dox. Drug-afhankelijke activering van SB100X expressie in getransduceerde cellen wordt gemeten door kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR)18.
Zodra het Tet-gereglementeerde SB100X expressie wordt aangetoond, volgt omzetting van de Indiase overheid (bijvoorbeeld groen fluorescent proteïne, GFP) in het genoom van de cel doelgroep de moleculaire gebeurtenissen die duidelijk geschematiseerde door Bak en Mikkelsen21. Een derde IDLV vector uitvoering een expressie cassette voor de Indiase overheid gekloond tussen de T2-transposon IRs (IDLVT2) moet worden gebouwd en verpakt zoals hierboven vermeld. Ten slotte, de drie IDLV vectoren kunnen worden gebruikt om efficiënt menselijke cellen (bv. primaire keratinocyten) in vitro transduce en integreren van de Indiase overheid in aanwezigheid van doxycycline18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plasmiden werkzaam
Opmerking: Plasmide pCCL-PGKrtTA2S-M2 werd vriendelijk geleverd door Prof. Zappavigna (Universiteit van Modena en Reggio Emilia, Modena, Italië). De pCMVSB100X plasmide uitvoering de codering opeenvolging van hyperactieve transposase en pT2/BH transposon plasmide werden beschikbaar gesteld door Prof Z. Ivics (Paul Ehrlich Instituut, Langen, Duitsland) en Prof. Z. Izvak (Max Delbruck Center for Molecular Medicine, Berlin, Duitsland).
- Voor alle klonen in Escherichia Coli (E. coli), volg de klonen strategie van keuze en restrictie-enzym procedure of PCR versterking van het fragment dat moet worden gekloond.
Opmerking: Tabel 1 geeft een overzicht van alle van de plasmiden, werkzaam in dit protocol. Een beschrijving en verwijzingen voor elke plasmide zijn verstrekt.
2. virale vector productie
Opmerking: Alle van de virale vectoren worden geproduceerd in een biohazard kap op een BSL2 bioveiligheid beheersingsniveau, volgens institutionele regels en voorschriften.
- Cultuur aanhangend HEK293T cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium aangevuld met 10% HyClone serum, 100 U/mL penicilline-streptomycine en 2 mM glutamine.
- Dag 0: Bereiden vijf 15 cm platen/virale voorbereiding en zaad 5.5x106 cellen in 30 mL van het medium.
- Dag 1: transfectie
- Voordat u begint transfectie, opstellen van 100 mL 2 x HEPES buffer zoutoplossing (HBS):
NaCl (5 M) 5,6 mL
HEPES (1 M) 10,0 mL
NB2HPO4 (0,5 M) 0.3 mL
Steriel water 84,1 mL
Aanpassen aan pH 7.1 met 37% HCl.
Opmerking: 2 x HBS kan worden achtergelaten bij 4 ° C. Een exacte pH is uiterst belangrijk voor efficiënte transfectie. De optimale pH bereik is 7.10 aan 7.12. - Verwijder van middellange en voeg 22.5 mL/plaat van verse middellange 4 h voor Transfectie.
- Transfect HEK293T cellen met de plasmide overdracht, het pMD.Lg/pRRE.D64VInt verpakking plasmide, de pMD2.G envelop-encoding plasmide en de pRSV-Rev (tabel 1) volgens de volgende bedrag/plaat:
overdracht van de plasmide 25,00 µg
pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 µg
pMD2.G 8,75 µg
pRSV-Rev 6.25 µg
Opmerking: De ANI van de plasmide zijn bereid volgens de CsCl protocol beschreven door Maniatis22 of met behulp van een plasmide endotoxine-gratis reiniging kit.- Resuspendeer 56.25 µg DNA (mix van 4 plasmiden) in 1.125 mL steriel water en voeg 125 µL van 2,5 M CaCl2 (oplossing A).
- Voeg 1.250 mL 2 x HBS tot een steriele 15 mL conische centrifugebuis (oplossing B).
- Voeg oplossing een (1.250 mL) naar B (1.250 mL) ontkleuring terwijl borrelen met een 1 of 2 mL Pipet (transfectie oplossing, totaal volume 2.500 mL).
- Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Met behulp van een P1000 micropipet, alle van de transfectie oplossing (2.500 mL) voor de cel enkelgelaagde ontkleuring distribueren.
- Na een nacht bebroeden in een cel cultuur incubator bij 37 ° C, 5% CO2.
- Voordat u begint transfectie, opstellen van 100 mL 2 x HEPES buffer zoutoplossing (HBS):
- Dag 2: Verwijder het medium en voeg toe 15 mL verse voedingsbodem (zie stap 2.1).
- Dag 3: Verzamelen en concentreren van het lentivirale deeltje-bevattende supernatant.
- Alle supernatant (~ 70 mL) ophalen (n = 5) transfected cel platen, filtreer door een 0,45 µm PESS filteren en vul 2 polyallomer buizen (1-inch x 3,5 inch) / virale voorbereiding.
- Het concentreren van de vector deeltjes door ultracentrifugatie bij 106.000 x g gedurende 2,5 h, bij 15 ° C met rem.
- Onmiddellijk na het stoppen van de ultracentrifugatie (Voorkom resuspensie van de pellet in de buis), zachtjes giet het supernatant in een container met 10% bleekwater en de 2 nauwelijks zichtbaar pellets op te schorten in 100 µL van 1 x PBS (+ 1% BSA). Dit is normaal als de pellet duidelijk en zeer klein is. De geconcentreerde vector vers bereide of aliquoot gebruiken en opslaan van virale preparaten bij-80 ° C.
Let op: Het supernatant bevat lentivirale deeltjes die grondig voordat de teruggooi in de biohazard afval moeten worden gebleekt.
- Om Titreer de virale vector-voorbereiding, een HIV-1 Gag p24 immunocapture kit volgens protocol van de fabrikant te gebruiken.
Opmerking: Om te standaardiseren de productie van virale vector, liposomen gebaseerde reagentia kon worden ingezet. De virale vector-titer is echter sterk afhankelijk van transfectie efficiëntie en zuiverheid van de plasmide DNA.
3. transductie van menselijke cellijnen (bijvoorbeeld HeLa cellen)
Opmerking: HeLa cellen worden gekweekt in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 100 U/mL penicilline-streptomycine en 2 mM glutamine. Tabel 1 geeft een overzicht van alle van de vectoren werkzaam in dit protocol. Een beschrijving voor elke vector wordt gegeven. Transductie van HeLa cellen kan verificatie van het transcriptionele Reglement van SB transposase in de beste dosis combinatie van de twee IDLV vectoren. Variatie van IDLV doses kan worden gerelateerd aan de vector deeltje titratie en doeltype van de cel.
- Dag 0: Zaad 2 x 105 cellen in 3 mL medium voor elk putje van de plaat van een 6-well. Maak 4 putten.
- Dag 1: Transductie van HeLa cellen.
- Voor elke voorwaarde, Verdun lentivirale vectoren tot een eindvolume van 1 mL medium (zie bovenstaande opmerking) in aanwezigheid van 10 μL van polybrene (eindconcentratie 8 μg/mL):
Verdunning voor goed #1: bespotten getransduceerde cellen (negatieve controle).
Verdunning voor goed #2: IDLVTKSB vector (2.600 ng van p24).
Verdunning voor putten #3, #4: IDLVTKSB vector (2.600 ng van p24) + IDLVrtTA2s-M2 vector (9600 ng van p24). - Verwijder het medium van elk putje waar HeLa cellen werden verguld op dag 0 en voeg lentivirale vector verdunningen aan de corresponderende goed.
- Spinoculate de 6-well plaat duikt met 754 x g gedurende 45 minuten bij 20-25 ° C, en vervolgens transfer de 6-well plaat naar een cel cultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Na 6 uur, vervang de middellange met vectoren met verse medium in alle putjes en doxycycline toevoegen aan 1 μM in goed #4. Zet de plaat in een cel cultuur incubator bij 37 ° C gedurende 48 uur.
- Voor elke voorwaarde, Verdun lentivirale vectoren tot een eindvolume van 1 mL medium (zie bovenstaande opmerking) in aanwezigheid van 10 μL van polybrene (eindconcentratie 8 μg/mL):
- Dag 3: Voorbereiding van cel pellet RNA extractie.
- Vóór het loskoppelen van cellen, bereiden een trypsine werkoplossing (1 x):
2,5% trypsine (10 x) 5,0 mL
500 mM EDTA (eindconcentratie = 5 mM) 0,5 mL
1 x PBS 44,5 mL - Warme trypsine werkende oplossing bij 37 ° C vóór gebruik. Bewaar de werkoplossing trypsine bij 4 ° C.
- Verwijderen van middellange en wassen van cellen met 1 x PBS. Voeg 0,5 mL van de werkoplossing voor voorverwarmde 37 ° C trypsine aan elk putje en Incubeer bij 37 ° C gedurende 7 min. (in een cel cultuur incubator).
- Na de incubatie, Voeg 0,5 mL serum-bevattende middellange aan elk putje aan de inactivering van trypsine en verzamelen cellen in een centrifugebuis. Spoel na elk nou eenmaal met 3 mL 1 x PBS en de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 240 x g centrifugeren.
- Cellen met 5 mL 1 x PBS, centrifuge voor 5 min op 240 x g wassen en weggeworpen. Gebruik vers verzameld is cel pellets of Bewaar bij-80 ° C. Uittreksel totaal RNA van pellets uit te voeren van semi-kwantitatieve RT-PCR (zie stap 6).
- Vóór het loskoppelen van cellen, bereiden een trypsine werkoplossing (1 x):
4. transductie van menselijke primaire cellen (bijvoorbeeld keratinocyten)
Opmerking: Menselijke primaire keratinocyten worden overgeënt op dodelijk bestraalde 3T3-J2 cellen (feeder layer)23, een soort geschenk van Yan Barrandon (EPFL, Lausanne, Zwitserland).
- Groeien Zwitserse muis 3T3-J2 cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium aangevuld met 10% donor runderserum, 50 U/mL penicilline-streptomycine en 4 mM glutamine (3T3 medium).
- Groeien van keratinocyten op cellen van de dodelijk bestraalde 3T3-J2 in cFAD medium, van een Dulbecco bewerkt Eagle Medium en Ham van F12 media mengsel (3:1) met foetale runderserum (10%), glutamine (2%), penicilline-streptomycine (1%) en insuline (5 µg/mL), adenine (verguld 0.18 mM), hydrocortison (0.4 µg/mL), cholera-toxine (0,1 nM), en trijodothyronine (2 nM).
- Dag 0: Zaad 3 x 10,5 bestraald dodelijk 3T3-J2 cellen, eerder verdund tot 3T3 medium om een eindconcentratie van 1 X 105 cellen/mL, in elk putje van de plaat 6-well. 9 putten voor te bereiden.
- Dag 1: Transductie van primaire keratinocyten
Opmerking: Transductie van keratinocyten kunt kwantificering van de transcriptionele regulering van SB transposase in de beste dosis combinatie van de twee IDLV vectoren (door qRT-PCR) en om te controleren of de integratie van de Indiase overheid (GFP) in de doelcellen (door cytofluorimetric analyse).- Vóór het loskoppelen van cellen, bereiden de werkoplossing trypsine:
0,5% trypsine-EDTA (10 x) 5,0 mL
500mM EDTA (eindconcentratie = 5 mM) 0,5 mL
1 x PBS 44,5 mL - Warme trypsine werkende oplossing bij 37 ° C vóór gebruik. Bewaar de werkoplossing trypsine bij 4 ° C.
- Als u wilt loskoppelen subconfluent keratinocyten in cultuur, medium verwijderen en wassen van cellen met 1 x PBS 1 mL van de werkoplossing voorverwarmde trypsine toevoegen aan elk putje. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min. in de cel cultuur incubator.
- Na de incubatie resuspendeer de cellen van een goed grondig en de celsuspensie overbrengen in een centrifugebuis met 2 mL serum-bevattende medium (als vele cellen nog steeds verbonden zijn, Incubeer gedurende een extra minuten bij 37 ° C). Spoel elke nou eenmaal met 3 mL 1 x PBS of verse medium en de spoelen-oplossing toevoegen aan de centrifugebuis met de celsuspensie.
- Centrifugeer gedurende 5 min op 580 x g en verwijder het supernatant.
- Cellen met 5 mL 1 x PBS, centrifuge voor 5 min op 580 x g wassen en verwijder het supernatant.
- In een polypropyleen tube van 15 mL, Verdun 1.6x105 keratinocyten in 1 mL van cFAD medium, één verdunning voor elke voorwaarde.
- Verdun lentivirale vectoren in 1 mL van cFAD medium in aanwezigheid van 20 μL van polybrene (eindconcentratie van 8 µg/mL bij een eindvolume van 2 mL):
Verdunningen voor putten #1, #2, #3: getransduceerde cellen (negatieve controle zonder vectoren) bespotten.
Verdunningen voor putten #4, #5: IDLVTKSB vector (13.000 ng van p24) + IDLVrtTA2s-M2 vector (48.000 ng van p24).
Verdunningen voor putten #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB vector (13.000 ng van p24) + IDLVrtTA2s-M2 vector (48.000 ng van p24) + IDLVT2 vector (9,160 ng van p24). - Transduce cellen in suspensie door elke lentivirale vector verdunning (1 mL) toe te voegen tot de overeenkomstige Keratinocyt schorsing (1.6x105 keratinocyten in 1 mL).
- Verwijder het medium van dodelijk bestraalde 3T3-J2 cellen ontpit op dag 0 en plaat getransduceerde keratinocyten (1.6x105 keratinocyten in 2 mL) op hen. Na een goed transducing gaat u verder met de volgende.
- Incubeer bij 25 ° C gedurende 30 minuten, en breng de cellen tot 37 ° C in de cel cultuur incubator voor 6 uur.
Opmerking: Doe niet spinoculate primaire keratinocyten, zoals levensvatbaarheid en proliferatie zal sterk worden beïnvloed. - Na 6 uur, voeg 1 mL van cFAD medium aan elk putje. Voeg 1 μM doxycycline (eindconcentratie) in putten #5, #8 en #9. Cellen retourneren tot 37 ° C.
- Vóór het loskoppelen van cellen, bereiden de werkoplossing trypsine:
- Dag 2: Vervang cFAD medium met 3 mL KC medium met 10 ng/mL EGF.
- Dag 3: Trypsinize en wassen van cellen uit putten #1, #4 en #5 zoals beschreven (zie 4.4.1 aan 4.4.6). Bevriezen van cel pellets bij-80 ° C tot het extract van de totale RNA voor qRT-PCR analyse (zie stap 7).
- Trypsinize van cellen uit goed #2 #6 en #8, zoals beschreven in stappen 4.4.1 aan 4.4.5 en cytofluorimetric analyses uit te voeren voor GFP expressie (zie stap 5).
- Houd de cultuur uit putten #3, #7 en #9 voor ten minste 3-4 verdubbelingen, voldoende om te verdunnen un-geïntegreerde IDLVT2 vector (5 dagen voor menselijke primaire keratinocyten verguld op feeder laag).
- Dag 6: Ongeveer 5 dagen post signaaltransductie, trypsinize cellen (Zie stappen 4.4.1 aan 4.4.5) uit putten #3, #7 en #9 tot en met cytofluorimetric analyses uit te voeren voor GFP expressie (zie stap 5).
Opmerking: De timing en transductie efficiëntie Experiment zijn sterk beïnvloed door primaire celtype en variabiliteit van verzamelde monsters.
5. Cytofluorimetric analyse op getransduceerde primaire keratinocyten
Opmerking: Een stroom cytometer geconfigureerd met een blauwe laser (488 nm), een rode laser (633 nm) en filters voor detectie van GFP en APC fluorescentie werkzaam is (Zie Materialen tabel).
- Om te discrimineren keratinocyten uit 3T3-J2 feeder laag, label getransduceerde keratinocyten vrijstaand op dag 3 en dag 6 (zie stap 4.7 en 4.9) met muis monoclonal APC-geconjugeerd antilichaam van de anti-Feeder.
- 4 mL buffer voor elk monster kleuring voor te bereiden:
5% FBS 200 ΜL
500 mM EDTA (eindconcentratie = 2,5 mM) 20 μL
PBS 1 x 3780 μL - Wassen vrijstaande cellen met 1 mL buffer kleuring. Centrifugeer gedurende 5 min op 580 x g en verwijder het supernatant.
- In een buis voor stroom cytometry verwerving, 5 x 104 cellen in 100 μl van kleuring buffer resuspendeer en voeg 2 μL van anti-Feeder antilichaam (1:50). Meng goed en incubeer gedurende 30 min op ijs in het donker.
- Na 30 min, wassen met 2 mL buffer kleuring. Centrifugeer gedurende 5 min op 580 x g en verwijder het supernatant. Resuspendeer in 200 μL van de kleuring van de buffer.
- Verwerven van APC en GFP signalen door cytofluorimetric analyse18. De Fractie van de cel GFP+ van de APC- -celpopulatie wordt aangegeven getransduceerde keratinocyten.
Opmerking: Indien gewenst herstellen het gebeitst monster vóór stroom cytometry met 2% paraformaldehyde in PBS 1 x en winkel bij 4 ° C in het donker tot de run.
- 4 mL buffer voor elk monster kleuring voor te bereiden:
- Stroom cytometry gegevens analyseren door het uitzetten van de verhouding tussen het percentage van GFP+cellen op het eindpunt (5 dagen) en het percentage van GFP+cellen 2 dagen post signaaltransductie, genormaliseerd naar residuele niveau van de IDLVT2-getransduceerde cellen.
6. semi-kwantitatieve RT-PCR
Opmerking: Gebruik een PCR thermische cycler.
- Uittreksel totaal RNA van getransduceerde of controle cellen met behulp van een RNA zuivering kit, volgens protocol van de fabrikant.
Opmerking: Totale RNA kan worden opgeslagen bij-80 ° C. - Synthetiseren van cDNA in een 20 µL-reactie met 100 ng van totale RNA en een reverse-transcriptase-kit, volgens protocol van de fabrikant.
Opmerking: cDNA kan worden opgeslagen bij-20 ° C. - Ontwerp primers specifiek voor SB100X, rtTA2s-M2 en GAPDH (een huishouden-gen).
Voorgestelde designs:
SB toekomen primer: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
SB reverse primer: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
rtTAM2 toekomen primer: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
rtTAM2 reverse primer: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
GAPDH toekomen primer: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
GAPDH reverse primer: 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3' - PCR in een volume van de uiteindelijke reactie van 50 µL uitvoeren. In het bijzonder monteren in elke buis PCR de volgende reactie:
cDNA (in de verdunning 1:5) (uit stap 6.2) 1,00 µL
Toekomen primer (10 µM stock) 1,00 µL
Omgekeerde primer (10 µM stock) 1,00 µL
dNTPs (10 µM stock) 1,00 µL
Buffer (+ MgCl2) (10 x stock) 5,00 µL
Taq polymerase (5 U/µL stock) 0,25 µL
Steriel water 40.75 µL - Het volgende programma van de thermische cycler gebruiken: 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 5 minuten vervolgens doorgaan met 95 ° C gedurende 30 s, 58 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 30 s voor 34 cycli voor SB100X, 32 cycli voor rtTA2s-M2 , en 25 cycli voor GAPDH.
- Bereiden 1% agarose gel. Los 1 g agarose in 100 mL TBE 1 x (10 x voorraad verdund in steriel water), in een maatkolf of bekerglas. Smelten in een magnetron, zwenken van elke minuut totdat de agarose volledig is opgelost. De gesmolten agarose afkoelen tot ongeveer 50 ° C is bereikt, en voeg vervolgens 5 µL van ethidiumbromide (10 mg/mL stockoplossing). Giet gesmolten agarose in een lade van de geassembleerde gel met een kam, voor het gieten van de gel.
- Monsters (van elk 10 µL) van de belasting op de agarose gel en het uitvoeren van elektroforese.
- Indien gewenst, verwerven van gel foto en densitometric analyses uit te voeren op de PCR banden.
7. kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR)
Opmerking: Een commerciële Sequence-detectiesysteem wordt gebruikt. PCR de inleidingen en 6-carboxyfluorescein (FAM) sonde voor glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) worden commercieel gekocht.
- Zie stap 6.2 voor retro-transcriptie.
- Het gebruik van software voor het ontwerpen van inleidingen en specifieke sonde voor SB100X.
Voorgestelde ontwerp:
SB.2 toekomen primer: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
SB.2 reverse primer: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
sonde SB FAM: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3' - Real-Time PCR uitvoeren in 96-wells-platen met een Master van de PCR-Mix en inleidingen + sonde mix, in een laatste reactie volume van 25 µL. In het bijzonder rekening houden met de volgende reactie voor elk putje:
cDNA (1:10 verdunning in steriel water) 1,00 µL
2 x Master Mix 12,50 µL
Inleidingen + 20 x sonde Meng 1,25 µL
Steriel water 10.25 µL
Opmerking: Alle reacties in drievoud uitvoeren. Voorkom pipetting fouten en bereiden een mix voor minstens n + 3 Reacties (zonder cDNA). Aliquot met behulp van een meerkanaalspipet. - Uitvoeren van PCR in real time met behulp van het volgende programma: 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 10 minuten, dan 40 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 minuut en houd bij 4 ° C.
- QRT-PCR gegevens analyseren door de relatieve uitdrukking (RQ-waarde) van de SB100X naar het niveau van GAPDH van cDNA hetzelfde monster door de 2-ΔΔCT kwantificering, met behulp van de software van de analyse van de typische gegevens normaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de procedure die hier, drie IDLV vectoren uitvoering de gereglementeerde SB-onderdelen (SB100X, rtTA2S-M2 en T2-GFP transposon) waren verpakt en gebruikt voor het efficiënt leveren en strak regelen de SB-systeem in menselijke cellen. Figuur 1A blijkt een regeling voor de in vitro transductie van HeLa cellen, die werd uitgevoerd voor de evaluatie van de transcriptionele regulering van SB transposase met de beste dosis combinatie van de twee IDLV vectoren (opgenomen in tabel 2). De transcriptionele regulering van SB100X werd gemeten door qRT-PCR (figuur 1B) en uitgezet als een relatieve hoeveelheid (RQ) waarde met betrekking tot de uit-toestand (IDLVTKSB alleen RQ = 1). In getransduceerde HeLa cellen, werd een 8-fold activering (+ dox) van SB100X expressie op de achtergrond (IDLVTKSB) verkregen. Met name cotransduced HeLa cellen in de afwezigheid van dox toonde transposase expressie vergelijkbaar is met de uit Staten, die aangeeft een strakke controle van de promotor van de TetTK door rtTA2s-M2 modulator.
Figuur 1: Transductie van HeLa cellen voor de expressie van transcriptionally-gereglementeerde SB transposase uitgevoerd door IDLV vectoren. (A) een regeling voor de in vitro transductie van HeLa cellen met IDLVs voor de expressie van transposase. (B) qRT-PCR analyse van HeLa cellen getransduceerde met IDLVTKSB (2.600 ng van p24) in de aanwezigheid (+) of afwezigheid (-) van IDLVrtTA2S-M2 (9600 ng van p24) en 1 µM doxycycline (dox). De stippellijn verbindt monsters met aanzienlijk verschillende waarden (*** P < 0.005). Het experiment werd uitgevoerd in drievoud. Bedoel S.E.M wordt weergegeven als de foutbalken. (Figuur aangepast ten opzichte van Cocchiarella, F. et al., 201618). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Als voorbeeld, in afbeelding 2 wordt de dosis variërend van experiment instellen voor het bereiken van de optimale transcriptionele regulering van transposase. HeLa cellen werden getransduceerde met toenemende doses (130, 260 en 2.600 ng van p24) van IDLVTKSB in combinatie met IDLVrtTA2s-M2 (960 en 9.600 ng van p24), in de aanwezigheid of afwezigheid van dox. Semi-kwantitatieve RT-PCR analyse toont duidelijk aan dat hoge doses van beide IDLVs dienden te sterk induceren SB100X expressie. Celtype van verschillende doelgroepen en variaties in de virale vector titratie kunnen resulteren in sup-optimale SB expressie, en daarom aangeraden dosering instelling experimenten uitvoeren.
Figuur 2: IDLV dosis instelling experiment in HeLa cellen te bepalen van de optimale dosis combinatie van de twee IDLVs. Semi-kwantitatieve analyse van de RT-PCR op HeLa cellen samen getransduceerde met verschillende doses van IDLVTKSB vector (130, 260 en 2.600 ng van p24) in de afwezigheid of de aanwezigheid van IDLVrtTA2s-M2 vector (960 en 9.600 ng van p24) en dox. De GAPDH werd versterkt als een standaardbesturingselement. SB100X transposase en rtTA2s-M2 expressie worden gemeld in alle geteste omstandigheden; NC = negatieve controle. (Figuur aangepast ten opzichte van Cocchiarella, F. et al., 201618). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Het transcriptionele gereguleerde SB systeem kan ook worden gebruikt in primaire cellen, met name in die cellen resistent tegen verschillende transfectie methoden, zoals menselijke primaire keratinocyten. Figuur 3 toont een schema voor transductie van primaire keratinocyten dodelijk op gekweekt bestraald 3T3-J2 feeder laag, met IDLV vectoren die de gereglementeerde SB-onderdelen, in de aanwezigheid of afwezigheid van dox ertoe SB100X expressie.
Figuur 3: transductie in suspensie van menselijke primaire keratinocyten met IDLV vectoren voor de expressie van transcriptionally-gereglementeerde SB transposase en transposon. Een regeling voor de in vitro transductie van menselijke primaire keratinocyten met IDLVs uitdrukken transcriptionally-gereglementeerde SB transposase en transposon, in de aanwezigheid of afwezigheid van 1 µM dox. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De qRT-PCR analyse in figuur 4A toont dat de beste combinatie van transposase en modulator vectoren, vermeld in tabel 2, dosis resulteerde in 15-fold activering van SB meningsuiting over de uit-toestand (-dox). De omzetting experiment werd uitgevoerd in keratinocyten getransduceerde met de drie vectoren van de IDLV (IDLVTKSB, IDLVrtTA2s-M2 en IDLVT2) in de aanwezigheid of afwezigheid van dox. Expressie van de Indiase overheid (GFP) beared door T2-transposon, in het compartiment van de APC- , werd gemeten door stroom cytometer analyse 2 dagen na transductie (dpt) en op de endopoint van de cultuur (5 dagen voor menselijke primaire keratinocyten). Het eindpunt werd bereikt toen beroepopleiding T2-GFP transposon gedaald tot een nauwelijks waarneembare niveau (gemiddeld 0,6%) als gevolg van de celdeling-afhankelijke verdunning. Figuur 4B toont de verhouding tussen het percentage van GFP+ cellen in het compartiment van de APC- op het eindpunt en 2 dagen post signaaltransductie, genormaliseerd naar de residuele niveau van het transposon alleen. Dit geeft het percentage cellen hosting ten minste 1 kopie van de geuite GOI stabiel geïntegreerd in hun genoom, beoordeeld op 12% voor menselijke primaire keratinocyten.
Figuur 4: analyse van de uitdrukking van transposase en GFP in getransduceerde menselijke primaire keratinocyten. (A) qRT-PCR-test op primaire keratinocyten getransduceerde met IDLVTKSB en IDLVrtTA2S-M2 in de aanwezigheid of afwezigheid van 1 µM dox. (B) mede transductie van primaire keratinocyten met IDLVT2 transposon en IDLVs voor transposase expressie in aanwezigheid of afwezigheid van dox. Op y-as, cellen % GFP+ 5dpt / % GFP+ cellen 2 dpt * 100 (bedoel ± SEM van twee experimenten). ** Toon aanzienlijk verschillende waarden (P < 0,05). (Figuur aangepast ten opzichte van Cocchiarella, F. et al., 201618). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Plasmide | Beschrijving | Verwijzingen |
| pCCL-TetOTKSB | Overdracht plasmide gebruikt voor het genereren van IDLVTKSB vector. Deze plasmide afgeleid van pTetOTKSB, na TetOTKSB in de lentivirale backbone van pCCL klonen. | 18, 20 |
| pCCL-PGKrtTA2S-M2 | Overdracht van de plasmide gebruikt voor het genereren van IDLVrtTA2s-M2 vector. | geboden door Prof. V. Zappavigna |
| pCCL-T2GFP | Overdracht plasmide gebruikt voor het genereren van IDLVT2 vector. Deze plasmide afgeleid van pT2GFP, na het klonen van het GFP tussen de T2-transposon IRs in de pCCL lentivirale ruggengraat. | 18, 20 |
| pMD.Lg/pRRE.D64VInt | Verpakking plasmide voor het genereren van IDLV vector. | 19 |
| pMD2.G | Plasmide codering voor VSV-G envelop voor het genereren van lentivirale vector. | 20 |
| pRSV-Rev | Rev plasmide voor het genereren van lentivirale vector. | 20 |
| Vector | Beschrijving | |
| IDLVTKSB | Integratie met gebreken lentivirale speerpunt voor de expressie van de SB100X onder de controle van Tet-responsieve TK promotor. | |
| IDLVrtTA2s-M2 | Integratie met gebreken lentivirale speerpunt voor de expressie van de rtTA2s-M2 modulator onder de controle van PGK promotor. | |
| IDLVT2 | Integratie met gebreken lentivirale speerpunt voor de expressie van de Indiase overheid gekloond tussen de T2-transposon IRs. | |
Tabel 1: plasmiden en vectoren werkzaam in dit protocol. Beschrijvingen en verwijzingen worden geleverd.
| Vectoren | HeLa (2 x 10,5 cellen) | Keratinocyten (1.6x105 cellen) |
| IDLVTKSB | 2.600 ng p24 | 13.000 ng p24 |
| IDLVrtTA2s-M2 | 9.600 ng p24 | 48.000 ng p24 |
| IDLVT2 | 9,160 ng p24 |
Tabel 2: Geoptimaliseerde vector doses voor transductie van HeLa cellen en menselijk primaire keratinocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een breed toegankelijke methodologie om een Indiase stabiel te integreren in het genoom van doelcellen door Doornroosje-gemedieerde omzetting. Hoewel de SB-systeem werd ontwikkeld om een nonviral methode voor het bewerken van het genoom te bieden, is efficiënte levering van de machines van de integratie (transposase en T2 transposon) verplicht. Daarom gebruiken de SB-systeem op nauwelijks transfectable primaire cellen, werd een virale levering van SB componenten voortgezet in de afgelopen jaren10,12,15. Echter, geen van de virale vectoren werkzaam tot nu de kwestie van constituerende uitdrukking van transposase die leiden het risico tot kan van een onbeheersbare rehopping van het transposon.
Transcriptionally reguleren transposase expressie, profiteerde we van een gemodificeerde Tet-ON systeem16. De minimale TK promotor gesmolten voor het TetO element, na binding aan de rtTA2s-M2 modulator in aanwezigheid van dox, verleende een fijnafstemming van transposase activering op de achtergrond (af-staat, bij gebrek aan dox). De regelgevende prestatie hangt af van de juiste IDLVs (IDLVTKSB en IDLVrtTA2s-M2) vector dosis combinatie en celtypes (bijvoorbeeld HeLa cellen en menselijk primaire keratinocyten). Onafhankelijk van doelcellen, de vector dosis moet zorgen voor het hoogste niveau van de transductie van de doelcellen zonder de levensvatbaarheid van de cellen, dus een escalerende dosis-combinatie experiment in HeLa cellen (of andere cellijnen) om te bepalen van de optimale doses, door semi-kwantitatieve RT-PCR, wordt sterk aangeraden.
Omzetting van de Indiase overheid evalueerden in primaire cellen. Menselijke primaire keratinocyten ontpit op dodelijk bestraalde 3T3-J2 feeder laag waren getransduceerde met 3 IDLVs (IDLVTKSB, IDLVrtTA2s-M2 en IDLVT2) bij de experimenteel gedefinieerde doses. Een duidelijke dox-afhankelijke activering van de transposase werd aangetoond door qRT-PCR. Bovendien, stabiele integratie van de Indiase overheid werd aangetoond door analyse van de cytofluorimetric van GFP expressie in cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van dox, met vermelding van de mogelijkheid om het IDLV platform aan voertuig de transcriptionally gereglementeerde SB tewerk te stellen getransduceerde onderdelen aan de primaire cellen, en de succesvolle integratie van een Indiase in het genoom van de doelcellen.
De kritische stappen in het protocol zijn IDLV vector productie en transductie van doelcellen op de optimale efficiëntie en vector dosis combinatie. Lage transfectie efficiëntie van HEK293T cellen kan leiden tot lage vector opbrengst. De definitie van doses van IDLVTKSB en IDLVrtTA2s-M2 is noodzakelijk om te voorkomen dat een onbalans van Tet-ON-componenten die leiden hoge leakiness in de afwezigheid van de modulator of in lage vouw inductie van de promotor van de TetOTK op dox behandeling tot kunnen. Deze kritische stappen kunnen worden aangepakt door kleine wijzigingen. Bijvoorbeeld, kon het protocol van de transfectie worden herleid met behulp van commerciële transfectie reagentia. Het protocol transductie moet worden aangepast volgens celtype van belang, met name gezien of spinoculation verhoogt de efficiëntie van de transductie zonder de levensvatbaarheid van de cellen. Vectoren en polybrene kunnen worden toegevoegd aan het kweekmedium van de doelcellen en vervangen door verse medium na een incubatieperiode van 6 h of 's nachts. Het is ook vermeldenswaard dat het percentage van GFP+ 5 dagen nadat transductie kan worden beïnvloed door de integratie van de achtergrond van IDLVs cellen.
Een kleine beperking van deze methode is dat de IDLV vectoren Transient worden geproduceerd door de transfectie van HEK293T cellen. Afhankelijk van de vector herhaalde doses worden gebruikt, vector producties zijn vereist. Een tweede beperking is gerelateerd aan de lengte van de Indiase overheid, aangezien de laadruimte van de vector IDLV ongeveer 8 kb is.
Kortom, kunt deze methode hier de integratie van een Indiase via transcriptionally gereglementeerde SB onderdelen verpakt in IDLV vectoren, die, onder de bestaande methoden te leveren SB systeem, een breed scala van tropisme en efficiëntie van de hoge signaaltransductie tonen. Bovendien, het gemodificeerde Tet-ON systeem toelaat een transcriptionele regulering van de expressie van de SB100X, een relevante kwestie in het risico van transposon opnieuw hoppen of in meerdere seriële omzetting gebeurtenissen als deze nodig zijn. Mogelijke toepassingen van deze methode omvatten genoom engineering van cellijnen (bijvoorbeeld HeLa cellen, HEK293 cellen) om stabiele verpakking cellen voor virale vectoren en de integratie van therapeutische genen op klinische relevante primaire cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Prof. Zappavigna, Universiteit van Modena en Reggio Emilia, Modena, Italië voor het verstrekken van ons met de pCCL-PGKrtTA2S-M2 plasmide. Wij erkennen ook Prof Z. Ivics (Paul Ehlrich Instituut, Langen, Duitsland) en Prof. Z. Izvak (Max Delbruck Center for Molecular Medicine, Berlin, Duitsland) voor pCMVSB100X en pT2/BH plasmiden. Dit werk werd gesteund door DEBRA internationale en Italiaanse ministerie van Universiteit en onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine | Lonza | BE12-614F | Cell culture medium. |
| HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production. |
| Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml | Lonza | DE17-602E | Reagents for cell culture medium. |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | Reagent for cell culture medium. |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline | Lonza | BE17-737E | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5% | Merck | 106580 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Sterile water for injection | Fresenius Kabi | - | Reagent for HBS 2X preparation. |
| 0.45 µm PESS filter | Whatman | 10462100 | Filters used to remove cell debris from viral supernatant. |
| Polyallomer Beckman tubes | Beckman Coulter | 326823 | Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation. |
| PBS-1X w/o Ca, Mg | Lonza | BE17-516F | Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | (Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension. |
| HIV-1 Gag p24 immunocapture kit | Perkin Elmer | NEK50001KT | Kit for IDLV particle titration. |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | Reagent to enhance transduction efficiency. |
| Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg | GIBCO | BE17-160E | Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted). |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | 100938B | AnalaR BDH | Reagent for trypsin working solution preparation. |
| 0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X) | GIBCO | 15400-054 | Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted). |
| Donor Bovine Serum, New Zealand Origin | GIBCO | 16030-074 | Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer). |
| Ham’s F12 media | GIBCO | 21765 | Medium for keratinocytes. |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | Serum for HeLa cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin | GIBCO | 10099-141 | Serum for human primary keratinocyte culture medium. |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Adenine | VWR | 1152-25 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Hydrocortisone | VWR | 3867-1 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T5516 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Human EGF | Austral Biological | GF-010-9 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody | Miltenyi Biotech | 130-096-099 | To label feeder layer. |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | RNA purification kit. |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18080051 | Reverse transcriptase kit. |
| Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP) | Sigma-Aldrich | D7295 | Reagent for semi-quantitative PCR. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | (any) | - | Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR. |
| GoTaq G2 Hot Start Polymerase | Promega | M740B | Taq polymerase. |
| Agarose, for molecular biology | Sigma-Aldrich | A9539 | Reagent for agarose gel electrophoresis. |
| UltraPure TBE Buffer, 10X | Invitrogen | 15581028 | Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O. |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Reagent for agarose gel electrophoresis. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D-9891 | drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4304437 | TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe. |
| 15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon Corning | 352096 | Tubes for cell collection and vector dilution preparation. |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile | Falcon Corning | 353025 | Cell culture dish for viral production. |
| 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile | Falcon Corning | 353046 | Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction. |
| Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 | Tubes for dilution preparation. |
| Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL | Eppendorf | 0030 120.094 | Tubes for dilution preparation. |
| 0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free | (any) | - | Tubes for semi-quantitative PCR. |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystem | 4346906 | 96-well for qRT-PCR. |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap | BD Falcon | 352052 | Tubes for flow cytometry acquisition. |
| Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes) | (any) | - | Pipettes for sterile tissue culture applications. |
| Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes) | (any) | - | Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications. |
| pH meter | (any) | - | Equipment for measurement of HBS 2X pH. |
| PCR Thermal cycler | (any) | - | Equipment for semi-quantitative PCR. |
| Agarose gel electrophoresis equipment | (any) | - | Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR. |
| BD FACS Canto II 2LSR 4/2 | BD | - | Flow cytometer. |
| 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 7900HT | Equipment for qRT-PCR. |
| Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets. | (any) | - | Centrifuge for cell culture processing and spinoculation. |
| Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor | Beckman Coulter | - | Ultracentrifuge for lentiviral particle production. |
| Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid). | |||
| Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction. |
References
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
- Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
- Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
- Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
- Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712 (2014).
- Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
- Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
- Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344 (2013).
- Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771 (2013).
- Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
- Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
- Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
- Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
- Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
- Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
- Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. , 4th edition, (2012).
- Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).
