Summary
تركز isoelectric الشعرية أسلوب المستندة إلى جسم، أولتراسينسيتيفي، وارتفاع إنتاجية، مما يتيح وصف مفصل للبروتينات وما إيسوفورمس من عينات بيولوجية ضئيلة للغاية. فيما يلي وصف لوضع بروتوكول للكشف والتحديد الكمي لبروتينات محددة وعلى إيسوفورمس بطريقة تلقائية و robotized.
Abstract
وقد أصبح Immunoblotting تقنية روتينية في العديد من المختبرات لتوصيف البروتين من العينات البيولوجية. ويوفر البروتوكول التالي استراتيجية بديلة، الشعرية isoelectric التركيز (سيف)، مع العديد من المزايا بالمقارنة مع إيمونوبلوتينج التقليدية. هذا هو أسلوب القائم على جسم الآلي والسريع، والكمية التي إجراء blotting غربية كاملة تجري داخل الشعرية سامسونج. هذا الأسلوب لا يتطلب هلام لنقل إلى غشاء، تجريد من البقع، أو الأشعة السينية الأفلام، الذي يشترط عادة ل immunoblotting التقليدية. وهنا يتم فصل البروتينات وفقا للتهمة (isoelectric نقطة؛ pI)، استخدام أقل من ميكروليتير (400 nL) من مجموع البروتين ليستي. بعد التفريد، البروتينات هي معطلة على جدران الشعيرات الدموية بالأشعة فوق البنفسجية العلاج الخفيفة، تليها الابتدائية والثانوية (الفجل البيروكسيديز (HRP) مترافق) حضانة الأجسام المضادة، يتم الكشف عن الذين ملزمة من خلال تعزيز تشيميلومينيسسينسي (الممنوعين)، توليد إشارة خفيفة يمكن التقاطها وتسجيلها بكاميرا جهاز اقتران (CCD). الصور الرقمية يمكن تحليلها وقياسها كمياً (منطقة الذروة) باستخدام البرمجيات. يمكن التعامل مع هذا الإجراء إنتاجية عالية 96 عينة في وقت واحد؛ هي حساسة للغاية، مع الكشف عن البروتين في مجموعة حلول؛ وتنتج النتائج استنساخه بدرجة عالية بسبب التشغيل الآلي للمكاتب. كل هذه الجوانب قيمة للغاية عندما تكون كمية العينات (مثلعينات الأنسجة والخزعات) عاملاً مقيداً. التقنية بالتطبيقات الأوسع نطاقا، بما في ذلك فحص للمخدرات أو الأجسام المضادة، واكتشاف العلامات البيولوجية، وأغراض التشخيص.
Introduction
تركز isoelectric الشعرية (سيف) هو المناعة التلقائية المستندة إلى الشعرية، الذي يحل البروتينات على أساس هذه التهمة1،2،3. أنها استنساخه للغاية وقادرة على حل البروتينات و isoforms بوستترانسلاتيونالي المعدلة سرعة كما وكيفا. وهو يقدم بديلاً للأساليب التقليدية مثل النشاف الغربية. وفي حين النشاف الغربية جيدة جداً لتأكيد وجود وفرة من البروتينات في عينات متاحة؛ تقلب واستهلاك الوقت وجميع الحاضرين دقيقة كوانتيتيشن تحديات، ولا سيما عند فحص عينات الأنسجة البيولوجية. في الواقع، تقلب مشكلة متأصلة في النشاف الغربية، كما أن هناك العديد من الخطوات المعنية، مثل تحميل وتشغيل من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية، ونقل البروتينات إلى غشاء، حضانة مع الكواشف المختلفة (على سبيل المثال. والابتدائي والثانوي الأجسام المضادة، القامة)، والتنمية على الأشعة السينية الفيلم4. في الوقت الحاضر، هو تحسين تقنية blotting الغربية بتنفيذ التسجيل الرقمي للإشارات تشيميلومينيسسينت (الغرب الرقمية). في الآونة الأخيرة، نظام blotting غربية قد وضعت، إلا وهي شعري الغربي، ونظام أكثر خالية اليدين وخالية من جل. فحص كامل آليا بعد تحميل لوحة عينة (عينات مع جميع الكواشف اللازمة) إلى3،نظام4. الصك الذي سيتم تنفيذ كافة الخطوات مثل فصل البروتين، يغسل التثبيت بروتينات على الجدار الشعرية، والأجسام المضادة إينكوبيشنز، بين الخطوات المختلفة، والتنمية، والتقدير الكمي للإشارات تشيميلومينيسسينت. وهكذا، يوفر الإجراء سيف الذي قدم هنا أعلى من القرار وحساسية.
هذا الأسلوب الحساسة، كما يمكن إنشاء إشارات وكمية من بيكوغرامات من البروتينات1. حساسية عالية مع إمكانية تكرار نتائج ممتازة يجعل هذه التكنولوجيا مفيدة للغاية لتحليل العينات السريرية. يمكن الكشف عن فضلا عن التمييز بين وظيفة التعديل متعدية الجنسيات (مثلاً، isoforms مختلفة من البروتين فوسفوريلاتيد) من البروتينات. هذه التكنولوجيا قد استخدمت بنجاح لتشريح مختلفة مما يشير إلى مسارات4،5 في الدراسات السريرية التي تهدف إلى تطوير علاجات جديدة في سرطان3، وأنه يتمتع بإمكانات كبيرة لاكتشاف العلامات البيولوجية والمخدرات البروتين .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الثقافة والتحفيز، وتحلل الخلية
ملاحظة: يمكن استخدام هذا الأسلوب مع العديد من أنواع الخلايا. ويرد لتوضيح الأسلوب، مثال على استخدام الخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيكس).
- والثقافة هوفيكس على المغلفة بالجيلاتين، أطباق بيتري 10 سم في المتوسط غشائي الخلايا القاعدية بمكملات مناسبة (انظر الجدول للمواد)، وأيضا يحتوي على 5 ٪ السفح، عامل نمو البشرة (5 نانوغرام/مل)، عامل نمو غشائي الأوعية الدموية (VEGF: 0.5 نانوغرام/ملليلتر) الأساسية صندوق الأجيال القادمة (10 نانوغرام/مل)، مثل الأنسولين عامل النمو (20 نانوغرام/ملليلتر)، الهيدروكورتيزون (0.2 ميكروغرام/مل)، وحمض الأسكوربيك (1 ميكروغرام/مل).
- تجويع الخلايا بين عشية وضحاها مع غشائي الخلايا القاعدية المتوسطة تستكمل مع السفح 1% ولا الملحق عامل النمو.
- نضح المتوسطة جميع، وإضافة 2 مل من الخلية البطانية الثقافة المتوسطة دون عوامل النمو (المجاعة المتوسطة) في صحن واحد (التحكم)، ثم إضافة 50 نانوغرام/مل VEGF في 2 مل من المجاعة الثقافة المتوسطة في طبق ثان لمدة 7 دقائق.
- نضح المتوسطة ويغسل خلايا مرات 2 مع درجة حرارة الغرفة 10 مل برنامج تلفزيوني.
- التأكد من أن أطباق بيتري على الجليد وإبقائهم هناك من هذه الخطوة فصاعدا.
- إضافة 250-400 ميليلتر من الجليد الباردة تحلل المخزن المؤقت (بيسين/الفصول؛ انظر الجدول للمواد) المانع حوزتي مائي تحتوي على مزيج ومزيج المانع [دمس] (مثبطات الفوسفاتيز؛ انظر الجدول للمواد) لكل لوح 10 سم. دوامة اللوحة ضمان التغطية المناسبة والاحتفاظ بها لمدة 10 دقائق على الجليد.
ملاحظة: ينبغي أن يكون تركيز النهائي من مبطلات ومزيج المانع [دمس] س 1. - تتخلص الخلايا من الطبق مكشطة الخلية ونقل إلى برود قبل [ميكروفوج] أنابيب. "الماصة؛" أعلى وأسفل 5 مرات الخلايا.
- باختصار sonicate الخلايا عند 4 درجة مئوية. تعيين سونيكاتور النحو التالي: عدد الدورات = 5، الطاقة = منخفض، على = 5 sec، قبالة = 30 ق. وترد هذه الخطوة كسر الأحماض النووية، وعدم الخلايا.
ملاحظة: يجب أن يكون سونيكيشن خفيفة لمنع تمسخ البروتينات. - دوامة الأنبوب 5 s (إلا بشكل مستمر)، 2 s في وقت (3 مرات)، والحفاظ على الجليد.
- توضيح ليستي بالطرد المركزي في 14,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، ثم نقل المادة طافية على الفور إلى أنبوب نظيفة مبردة مسبقاً [ميكروفوج].
- قياس تركيز البروتين باستخدام حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي) بروتين الإنزيم طقم4.
- جعل 10 ميليلتر مختبرين، الأداة تجميد في الثلج الجاف أو النتروجين السائل، وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2-نموذج إعداد مزيج (حساب 150 ميليلتر عينة ميكس)
- أولاً، إعداد مزيج مادة عينة بإضافة 1 ميليلتر من مزيج المانع [دمس] (الأسهم 50 x) و 2 ميليلتر من مثبطات البروتياز (الأسهم 25 x) إلى 47 ميكروليتر من عينة مخفف (انظر الجدول للمواد)، حيث أن الأخيرة تركيز مثبطات [دمس] ومثبطات البروتياز يصبح 1 x. وبعد ذلك، يضعف ليساتيس البروتين باستخدام مزيج مادة العينة للحصول على التركيزات المطلوبة (راجع الخطوة 2، 3).
- إعداد مزيج مثبط البروتياز/أمفوليتي/سلم المانع/[دمس] عن طريق إضافة سلم 3.325 ميليلتر القياسية (انظر الجدول للمواد؛ الأسهم 60 x)، 6 ميليلتر من مثبطات البروتياز (25 س)، 3 ميليلتر من [دمس] (50 س) المانع لمواده أمفوليتي ميليلتر 137.675 (انظر الجدول من المواد). دوامة s الأنبوبة على الأقل 15 مجموع 5 s في وقت واحد (3-4 مرات)، والحفاظ على الجليد.
- مزيج الحلول من الخطوات 2.1 و 2.2 بنسبة 1:3، حيث أن التركيزات النهائية [دمس]، ومثبطات البروتياز، وسلم القياسية pI أصبح 1 X، والبروتينات في شعري الوصول إلى النهائي التركيزات المطلوبة (مثلاً، 50 ميكروغرام/مل واستخدمت ل الشكل 2).
ملاحظة: تركيز البروتين في الشعرية وكذلك هي نفسها. - تحميل 10 ميليلتر من مزيج عينة في البئر المناسبة، وفقا لتخطيط قالب المقايسة لوحة 384-جيدا (راجع الخطوة 3 و الشكل 1) والحفاظ على لوحة على الجليد.
- تمييع الأولية (pERK1/2، 01:50؛ ERK1/2، 1: 100؛ HSP 70، 1: 500) والأجسام المضادة الثانوية (رافعة) مع جسم مخفف (انظر الجدول للمواد) و "الماصة؛" 10 ميليلتر من الابتدائي و 15 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوية في كل بئر.
ملاحظة: بشكل عام، تركيز أعلى من الأجسام المضادة المطلوبة لفحوصات سيف بالمقارنة مع البقع الغربية التقليدية. - مزيج لومينول وأكسيد الشديد (نسبة 1:1؛ انظر الجدول للمواد) معا "الماصة؛" 15 ميليلتر في كل بئر.
ملاحظة: تخلط هذه الحلول جديدة كل مرة قبل الاستخدام، والحفاظ على الجليد. - مرة واحدة هي بيبيتيد العينات وجميع المواد الكاشفة في اللوحة، الطرد المركزي اللوحة في 2,500 س ز لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية إزالة الفقاعات وتدور أسفل السائل. إذا كانت لا تزال توجد فقاعات، إزالتها يدوياً باستخدام تلميح ماصة رقيقة.
ملاحظة: لا تقم بتحميل أكثر من 20 ميكروليتر من عينة أو الكواشف الواحدة جيدا؛ خلاف ذلك، لا يمكن أن تغسل ماصة الصك بشكل صحيح. تأكد من اتباع دليل التعليمات من الشركة المصنعة لإعداد جميع المواد الكاشفة.
3-تصميم قالب مقايسة جديدة مع برامج النظام (الشكل 1)
- فتح برامج النظام وانقر فوق "جديد" من القائمة ملف.
- انتقل إلى جزء تخطيط وتعيين مواقع الكواشف وعينات في صفيحة جيدا 384. استخدام ما يصل إلى حد أقصى آبار 96 كل لوح 384-جيدا.
- جعل مهمة كاشف بواسطة النقر فوق بئر في أي مكان في الكتلة. حدد كتلة 12 بئرا في كل صف. الآبار، مثلاً، من 1-12 أو 13-24، يتم تعيينها ككتلة بشكل افتراضي.
- انتقل إلى جزء من تخطيط شريط الأدوات وإدراج كتلة صف فارغ أو عينة، والابتدائية، والثانوية، أو كتلة الصف لومينول. يتم تعيين كل كتلة بلون مختلف، حيث تكون سهلة للتمييز.
ملاحظة: عند النقر فوق بئر، يمكن رؤية حد أسود حول الكتلة حيث سيتم إدراج كتلة جديدة في الجزء. يمكن أيضا حذف كتلة صف. - انتقل إلى جزء البروتوكول وحدد موقع كاشف في اللوحة. ثم، انقر فوق خلية في العمود نموذج وحدد الكاشف من القائمة المنسدلة.
- في هذا الشكل نفسه، حدد مواقع كاشف للابتدائي والثانوي، ولومينول لكل دورة.
- انقر فوق الخلايا، واحد في كل مرة، في العمود جسم أولية أو ثانوية، وتغيير أوقات الاحتضان، إذا لزم الأمر.
ملاحظة: تلاحظ دخول لكل دورة يمكن أيضا أن تضاف. - إضافة دورات عن طريق النقر فوق الزر 'إضافة' في قسم البروتوكول. 1 دورة أو دورات 4 دورات كل (يمكن إضافتها كحد أقصى 8 دورات في البروتوكول).
ملاحظة: من الممكن لنسخ ولصق المعلومات بدوره في هذه الخطوة: حدد دورة، انتقل إلى تحرير، ونسخ ولصق. - قم بإدخال المعلومات المتعلقة بالعينة، مثل هوية الأجسام المضادة الأولية والثانوية، وإعداد كتالوج وتخفيف،، إلخفي جزء القالب. هذا هو خطوة اختيارية مفيد أثناء تحليل ما بعد التشغيل.
- حفظ ملف الفحص الجديد. قبل النقر فوق الزر 'ابدأ'، بسرعة التحقق من التخطيط للتأكد من أن كل شيء الصحيح.
4-البروتوكول المتعلق بسيف "إعداد الصك"
- تعيين التفريد التركيز isoelectric الشعرية شروط الانفصال. ينبغي أن تكون هذه µW 000 15 و 40 دقيقة، وينبغي أن يكون وقت التثبيت الأشعة فوق البنفسجية 80 s. بيد أن الوقت التثبيت الأشعة فوق البنفسجية يمكن تعيين ضمن نطاق s 80-140 وقد تحتاج إلى الأمثل لبروتين الفائدة.
ملاحظة: يمكن تعيين نقطة وقت للأشعة فوق البنفسجية التثبيت لكل دورة، ولكن ليس لكل شعري. - مجموعة يغسل يغسل 1 إلى 2، 150 ق كل الغسيل (افتراضي)، وحضانة جسم الابتدائي لمدة 120 دقيقة.
- مجموعة يغسل يغسل 2 إلى 2، 150 ق كل الغسيل (افتراضي)، وحضانة جسم الثانوية لمدة 60 دقيقة.
- تعيين الغسيل 3، الذي ينبغي أن يغسل 2، 150 ق كل يغسل (افتراضي).
- تعيين أوقات التعرض متى سيتم الكشف عن تشيميلومينيسسينسي؛ وينبغي أن تكون هذه 30، 60، 120 و 240، 490، و 960 ق. ستنفذ في شعري واحد جميع الخطوات (1-8).
5-تشغيل الملف الإنزيم
- مرة واحدة كل شيء جاهزاً، انقر فوق ابدأ لبدء التشغيل. سيطالبك البرنامج بإزالة النفايات، لإعادة ملء الماء ومربع الشعرية، لإضافة الأنوليت والكاتوليت إلى علبة المورد، لإضافة المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، وأخيراً لتحميل اللوحة إلى علبة تبريد العينة.
ملاحظة: إزالة الغطاء من مربع الشعرية، ولكن لا تقم بإزالة الغطاء من لوحة المقايسة. يمكن إزالة الغطاء من اللوحة تلقائياً بالصك عند الضرورة. وهذا يساعد على منع تبخر كاشف. - تم بدء تشغيل بضع دقائق بعد التشغيل، سيتم عرض شريط المعلومات صك على شاشة الكمبيوتر. مركز الرسائل وأشرطة التقدم يمكن رؤية المقابلة للصك المرحلة الراهنة.
ملاحظة: في البداية، هذا الصك سوف تحقق إذا كان كل شيء صحيحاً قبل الشروع في "الماصة؛" الأنوليت والكاتوليت في علبة الورق العازل وانتقاء أول كتلة من الشعيرات الدموية 12 وإزالة غطاء اللوحة ووضع العينات المأخوذة من العينة اللوحة إلى الشعيرات الدموية، ومن ثم أخيرا إلى غرفة الفصل الكهربي. - انقر فوق تشغيل الشاشة ملخص لمشاهدة الجزئين: حالة والانفصال. يمكن للمستخدمين عرض التقدم التشغيل، ويمكن تخزين أفلام الفصل (12 الشعيرات الدموية لكل دورة) عند اكتمال الخطوة التفريد لكل دورة. لمراقبة فصل التفريد في مسرحية شعرية، فصل الفيلم لأن شعري بواسطة النقر فوق دورة المطلوب، ومن ثم على زر التشغيل في لوحة التحكم.
- ويمكن تخزين ملف التشغيل تلقائياً عند انتهاء التشغيل.
6-تحليل البيانات (S1 الشكل)
- فتح ملف التشغيل وقم بتحديد علامة التبويب شاشة التحليل. في S1A الشكل، من البيانات المعروضة (قمم) في نموذج الرسم البياني الشعرية المحددة (أي، الشعريةال 4 من دورة 1).
- انقر فوق تحرير، ومن ثم تحليل (S1B الشكل). في هذه المرحلة، المستخدمين يمكن تغيير نطاق بي تطبيق معيار بي مناسبة لتجربة معينة، إضافة إلى ذروة ملائمة وإضافة اسم ذروة.
ملاحظة: عند استخدام أمفوليتي درجة حموضة 5-8 بريمكس (كما الحال هنا)، سلم القياسية الموصى بها لاستخدام واحد مع الببتيدات المسمى فلوريسسينتلي مع pIs من 4.9 و 6.0، 6.4، 7.0 و 7.3، وعند استخدام الرقم الهيدروجيني مواده 3-10، سلم الموصى به واحد مع pIs 4.0 ، 4.9، 6.0، 6-4، و 7.3. 2 - يتم عرض النتائج في علامة التبويب قمم؛ القيم المعروضة للعينات هي موقف pI، ذروة الارتفاع والمنطقة، % المنطقة، ذروة العرض وإشارة إلى الضوضاء (S/N) (رقم S1C). اختر البيانات المراد استخدامها، وتصدير البيانات لمزيد من التحليل.
ملاحظة: يمكن فقط تصدير البيانات بعد وضع العلامات في الذروة (الشكل S1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التصميم مقايسة جديدة: ويبين الشكل 1Aبتخطيط لوحة فحص. أقصى حد ممكن، يمكن استخدام الآبار 96 من لوحة 384-جيدا في كتل من 12 بئرا لكل شرط (الأجسام المضادة). يمكن أن تبدأ كل كتلة من 12 بئرا من A1-A12 أو A13-A24. الصفوف تم تلوينها تسمح بالتمييز بين العينات أو المواد الكاشفة عن بعضها البعض. في قالب المقايسة (الشكل 1B)، المعلومات ذات الصلة التي يمكن تخزينها مقايسة خاصة، التي يمكن استخدامها في مراحل لاحقة لتحليل النتيجة. ويبين الشكل 1 موجزاً للبروتوكول.
الكشف عن البروتين فوسفوريلاتيد وأونفوسفوريلاتيد خارج الخلية التنظيم كيناز (pERK1/2 و ERK1/2) في هوفيك ليستي حفزت مع فيجف: وبصفة عامة، وظيفة البروتينات المعدلة ترانسلاتيونالي، مثل فوسفوبروتين، يصعب كشفها بسبب كميتها قليلة وطبيعة عابرة، وعدم وجود أجسام مضادة محددة. التحفيز عامل نمو غشائي (VEGF) الأوعية الدموية عقب المجاعة مصل ينشط مستقبلات التيروزين كيناز (VEGFR2) يؤدي إلى تنشيط المسار MAPK وينتج عنه الفسفرة إيرك. لإجراء تجارب باستخدام هوفيكس، يمكن استخدامها ليساتيس من خلايا حفز مع أو بدون فيجف لمدة 7 دقائق، كما هو مبين في الشكل 2. ويبين الشكل 2A اليكتروفيروجرام من pERK1/2 من ± حفزت VEGF ليساتيس. ومن الواضح مع VEGF هناك تحريض عالية جداً من البروتينات فوسفوريلاتيد (الحدود القصوى المحددة باللون الأحمر). اقحم يعرض عنصر التحكم تحميل الذاتية 70 HSP (الشكل 2A اقحم)، مما يشير إلى تحميل مشابهة لعينات لعينات غير المعالجة والمعالجة على حد سواء. في إيمونوبلوت التقليدية (الشكل 2، وترك الفريق) شريطين فقط تم الكشف عنها (phosphoERK1؛ pERK1 و pERK2). ومع ذلك، تم حل البروتينات pERK1/2 إلى قمم 4 ppERK2، pERK2، ppERK1، و pERK1 بتحليل سيف (الشكل 2A). وبالمثل، يبين الشكل 2 اليكتروفيروجرام ERK1/2 من ± حفزت VEGF ليساتيس. ويبين اقحم نفس تحميل عنصر تحكم المستخدم في نفس الوقت. Immunoblot تقليدية يظهر نطاقات اثنين فقط المقابلة ل ERK1 و ERK2 (الشكل 2، واللوحة اليمنى) بينما مع سيف، تم حل pERK1/ERK2 إلى 6 قمم (الشكل 2) المقابلة لكل 4 مختلفة فوسفوريلاتيد القمم وقمم أونفوسفوريلاتيد 2، ERK1 و ERK2. وهذا يدل على واحدة من المزايا مع سيف، وهما يمكن حلها أن isoforms البروتين وتقييمها كمياً ونوعيا. وباﻹضافة إلى ذلك، فمن الممكن الحصول على المعلومات الكمية من isoforms فوسفوريلاتيد من جسم مضاد موجه إلى صميم البروتين، بدلاً من تعديل بوستترانسلاشونال.
الشكل 1 : تصميم تخطيط لوحة الفحص في البرمجيات- (أ) تخطيط لوحة 384-جيدا تحديد موقف جميع المواد الكاشفة. عرض موقع عينات، والأجسام المضادة، والكاشفات تشيميلومينيسسينت مرمزة الصفوف جيدا 12. (ب) مقايسة قالب عرض المعلومات ذات الصلة مع بئر الفردية. (ج) بروتوكول إظهار جميع المعلومات ذات الصلة لدورة 1 و 2. في دورة 1 (12 الشعيرات الدموية كما هو موضح في المربع الملون)، الصك يأخذ عينة من A1 (الآبار من A1-A12) متبوعاً بجسم أساسي من B1 (الآبار من B1-B12)، جسم الثانوية من D1 (الآبار من D1-D12)، وأخيراً luminol:peroxide الشديد من J1 (الآبار من J1-J12). في 2دورة، كل شيء هو نفس الدورة الأولى، إلا أنه يأخذ جسم أساسي من C1 (الآبار من C1-C12). لقد تم تعديل هذا الرقم مع إذن من اوديا Aspinall et al. عام 20152. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الكشف عن فوسفوريلاتيد ومجموع البروتينات "ميتوجيناكتيفاتيد البروتين كيناز" (إيرك 1/2) بمقايسة سيف والتقليدية immunoblot مقايسة. (A) اليكتروفيروجرام ممثل pERK1/2 والبروتينات في هوفيكس تعامل ±VEGFA متبوعاً بمقايسة سيف، سبر لأجسام pERK1/2. (أونستيمولاتيد) الخط الأزرق والخط الأحمر (حفز). وتظهر قمم isoforms بيرك/2 فوسفوريلاتيد بشكل مختلف فصل على أساس نقطة isoelectric بها. اقحم يعرض عنصر التحكم الذاتية HSP70 تشغيل جنبا إلى جنب مع نفس ليستي. (ب) اليكتروفيروجرام الممثل عرض ± ERK1/2 فيجفا-وحفز ليستي. ويبين اقحم الرقابة الذاتية HSP70 التي تم تشغيلها في نفس الوقت. اليكتروفيروجرام، استخدمت 50 ميكروغرام/مل تركيزات ليستي، وهو ما يعادل 20 نانوغرام من مجموع البروتينات في شعري. (ج) immunoblotting التقليدية pERK1/2 والبروتينات ERK1/2 في ±VEGFA (50 نانوغرام/ملليلتر) حفز الخلية هوفيك ليستي. استخدمت 10 ميكروغرام من إجمالي الواحد لين إيمونوبلوتينج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية S1 الشكل: مراحل تحليل النتيجة
(A) عرض النتائج من الشعرية اهتمام. (ب) إضافة/تحرير معلمات مختلفة للملف المقايسة. (ج) فمن الممكن إضافة أسماء الذروة إلى القمم قبل تصدير البيانات لمزيد من التحليل. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حساسية والقرار من البروتينات ذات أهمية حاسمة لبحوث البروتين في عينات بيولوجية. هناك قيمة كبيرة في كونه قادراً على الكشف عن البروتينات التي موجودة بكميات دقيقة في الخلايا. يمكن أن نقدم سيف تحسين حساسية والقرار للكشف عن البروتينات وعلى إيسوفورمس4.
هذه التكنولوجيا قد استخدمت بنجاح في العديد من البروتين بحوث تقارير5،،من67. ومع ذلك، العديد من القيود المرتبطة به، مثل حقيقة أن ليس كل الأجسام الأولية يمكن أن تعطي إشارة حتى ولو كانت تعمل بشكل جيد في إيمونوبلوتس التقليدية. هناك، حتى الآن، لا توجد قائمة بالأجسام المضادة تم التحقق من صحتها تبين أن يعمل في سيف، نظراً لهذه التقنية الجديدة تماما. أخيرا، لا يمكن معالجة الصك أقل من 12 عينات أو نماذج أكثر من 96 في وقت واحد.
سيف وتقنية بديلة ل immunoblotting التقليدية، بل أنها قد لا تعطي نتائج متطابقة. سيف وقد ثبت تفوق كثيرا immunoblotting التقليدية من حيث الحساسية والقرار. وعلاوة على ذلك، هو سيف الإنتاجية العالية، قوية، التلقائي، robotized، وحساسة للغاية، تسفر عن إشارات من خلايا أقل من 25 تبعاً للبروتين تحليل1. أنها الكمية واستنساخه بدرجة عالية، كما يتم تصغير المناولة. الكشف عن مختلف isoforms البروتين من أحجام مماثلة يمكن حلها بسهولة. وهكذا، يمكن أن تعطي جسم نفس المعلومات الكمية عن أشكال البروتين فوسفوريلاتيد وأونفوسفوريلاتيد من كميات نانوجرام من العينة4. على الرغم من أن إيمونوبلوت التقليدية وسيف الاعتماد على جسم على أساس الكشف عن تشيميلومينيسسينت، وهناك بعض الاختلافات الهامة، مثل في إيمونوبلوتينج التقليدية، يتم فصل البروتينات على أساس الوزن الجزيئي بينما في سيف، ويستند الفصل المسؤول عن البروتين. وأخيراً، البروتينات هي التشويه والتحريف في إيمونوبلوت، في حين أنهم يتم الحفاظ عليها في حالتها الأصلية في سيف. هذه النقطة الأخيرة هي السبب لماذا جسم نفسه قد أو قد لا تعمل في كلا الأسلوبين.
وقد أثبتت الدراسات المختلفة العديد من تطبيق سيف على دراسة الفسفرة البروتين من عينات المرضى البشرية3عينات سرطان القولون البشري4،8، الماوس ورم الأنسجة9أو خطوط الخلايا المختلفة 10-اعتماد هذا الأسلوب يمكن أن تعزز التقدم السريع في بحوث البروتين في العديد من المجالات مثل اكتشاف المخدرات وأغراض التشخيص، واكتشاف المؤشرات الحيوية، ويشير إلى دراسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد صاحب البلاغ لا الكشف.
Acknowledgments
صاحب البلاغ وذلك بفضل الأستاذ لينا كلايسون-الويلزية، جامعة أوبسالا، السويد عن تأييدها لتطوير هذا المشروع. بالإضافة إلى ذلك، فضل صاحب البلاغ روس سميث ولينا كلايسون-الويلزية، جامعة أوبسالا لقراءة نقدية واقتراحات لتحسين هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
- O'Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O'Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
