Summary
केशिका isoelectric फोकस एक एंटीबॉडी आधारित, ultrasensitive, उच्च प्रवाह तकनीक है, अत्यंत छोटे जैविक नमूनों से प्रोटीन और उनके isoforms के विस्तृत लक्षण वर्णन को सक्षम करने से । निम्नलिखित एक स्वचालित और रोबोट तरीके से विशिष्ट प्रोटीन और उनके isoforms का पता लगाने और ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है ।
Abstract
Immunoblotting जैविक नमूनों से प्रोटीन लक्षण वर्णन के लिए कई प्रयोगशालाओं में एक नियमित तकनीक बन गया है । निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक वैकल्पिक रणनीति प्रदान करता है, केशिका isoelectric ध्यान केंद्रित (cIEF), पारंपरिक immunoblotting की तुलना में कई फायदे के साथ. यह एक एंटीबॉडी आधारित, स्वचालित, तेजी से, और मात्रात्मक विधि जिसमें एक पूरा पश्चिमी सोख्ता प्रक्रिया एक ultrathin केशिका के अंदर जगह लेता है । इस तकनीक को एक झिल्ली में स्थानांतरित करने के लिए जेल की आवश्यकता नहीं है, दाग के अलग करना, या एक्स-रे फिल्मों, जो आम तौर पर पारंपरिक immunoblotting के लिए आवश्यक हैं । यहां, प्रोटीन उनके चार्ज (isoelectric बिंदु; pI), कुल प्रोटीन lysate के एक microliter (४०० nL) से कम का उपयोग कर के अनुसार अलग कर रहे हैं । ट्रो के बाद, प्रोटीन पराबैंगनी प्रकाश उपचार द्वारा केशिका दीवारों पर स्थिर कर रहे हैं, प्राथमिक और माध्यमिक (सहिजन peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित) एंटीबॉडी की मशीन, जिसका बंधन बढ़ाया के माध्यम से पता चला है द्वारा पीछा किया chemiluminescence (ECL), एक प्रकाश संकेत है कि कब्जा कर लिया जा सकता है और एक चार्ज युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा द्वारा दर्ज उत्पादन । डिजिटल छवि और विश्लेषण किया जा सकता है quantified (पीक क्षेत्र) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । इस उच्च प्रवाह प्रक्रिया एक समय में ९६ नमूने संभाल कर सकते हैं; अत्यधिक संवेदनशील है, picogram रेंज में प्रोटीन का पता लगाने के साथ; और स्वचालन के कारण अत्यधिक reproducible परिणाम पैदा करता है । इन पहलुओं के सभी अत्यंत मूल्यवान है जब नमूनों की मात्रा (जैसे, ऊतक के नमूनों और बायोप्सी) एक सीमित कारक है । तकनीक व्यापक अनुप्रयोगों के रूप में अच्छी तरह से, दवाओं या एंटीबॉडी, unmarker खोज, और नैदानिक प्रयोजनों के स्क्रीनिंग सहित है ।
Introduction
केशिका isoelectric (cIEF) एक स्वचालित, केशिका आधारित immunoassay है जो अपने चार्ज1,2,3के आधार पर प्रोटीन को हल करता है । यह अत्यधिक reproducible और प्रोटीन का समाधान करने में सक्षम है और उनके पद-अनुवाद संशोधित isoforms तेजी से और मात्रात्मक । यह पश्चिमी सोख्ता के रूप में पारंपरिक तरीकों के लिए एक विकल्प प्रस्तुत करता है । जबकि पश्चिमी सोख्ता आसानी से सुलभ नमूनों में प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए बहुत अच्छा है; परिवर्तनशीलता, समय की खपत, और सटीक quantitation सभी वर्तमान चुनौतियों, विशेष रूप से जब जैविक ऊतक नमूनों की जांच । वास्तव में, परिवर्तनशीलता पश्चिमी सोख्ता में एक अंतर्निहित समस्या है, के रूप में वहाँ कई कदम शामिल हैं, इस तरह के लोड हो रहा है और एसडीएस के चलने के रूप में-पृष्ठ जैल, झिल्ली पर प्रोटीन का हस्तांतरण, विभिन्न रिएजेंट के साथ मशीन (जैसे, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी, ECL), और विकास पर एक्स-रे फिल्म4. वर्तमान में, पश्चिमी सोख्ता तकनीक chemiluminescent संकेतों (डिजिटल पश्चिमी) के डिजिटल रिकॉर्डिंग के कार्यांवयन के साथ सुधार है । हाल ही में, एक स्वचालित पश्चिमी सोख्ता प्रणाली विकसित की गई है, अर्थात् केशिका पश्चिमी, जो एक अधिक हाथों से मुक्त और जेल मुक्त प्रणाली है । पूरे परख एक नमूना प्लेट की लोडिंग प्रणाली3,4में सभी आवश्यक रिएजेंट के साथ (नमूने) के बाद स्वचालित है । साधन प्रोटीन जुदाई के रूप में सभी कदम प्रदर्शन करेंगे, केशिका दीवार पर प्रोटीन के स्थिरीकरण, एंटीबॉडी की मशीन, विभिन्न चरणों के बीच बहाकर, और विकास और chemiluminescent संकेतों के ठहराव. इस प्रकार, cIEF प्रक्रिया यहां प्रस्तुत उच्च संकल्प और संवेदनशीलता प्रदान करता है ।
इस विधि संवेदनशील है, के रूप में संकेत उत्पन्न किया जा सकता है और प्रोटीन की picograms से quantified1. उत्कृष्ट reproducibility के साथ उच्च संवेदनशीलता इस प्रौद्योगिकी बहुत नैदानिक नमूनों के विश्लेषण के लिए उपयोगी बनाता है । यह पता लगाने के साथ ही पोस्ट शोधों संशोधन (जैसे, प्रोटीन के विभिंन phosphorylated प्रोटीन isoforms) भेद कर सकते हैं । इस तकनीक को सफलतापूर्वक कैंसर3में नए चिकित्सकीय विकसित करने के लिए लक्ष्य नैदानिक अध्ययन में अलग संकेतन रास्ते4,5 काटना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और यह प्रोटीन के लिए महान क्षमता है, और दवा की खोज .
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Protocol
1. सेल संस्कृति, उत्तेजना, और Lysis
नोट: यह विधि कई कक्ष प्रकारों के साथ उपयोग किया जा सकता है । विधि को समझाने के लिए, एक उदाहरण मानव गर्भनाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) का उपयोग कर वर्णन किया गया है ।
- संस्कृति जिलेटिन पर HUVECs-लेपित, 10 सेमी पेट्री व्यंजन में endothelial सेल बेसल माध्यम उचित पूरकता के साथ ( सामग्री की तालिकादेखें), और भी 5% FCS, एपिडर्मल वृद्धि कारक (5 एनजी/एमएल), संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़: ०.५ एनजी/एमएल), बुनियादी FGF (10 एनजी/एमएल), इंसुलिन जैसे विकास कारक (20 एनजी/एमएल), hydrocortisone (०.२ µ g/एमएल), और ascorbic एसिड की (1 µ g/एमएल) ।
- endothelial सेल बेसल मध्यम के साथ रात भर भूखे कोशिकाओं 1% FCS और कोई वृद्धि कारक पूरक के साथ पूरक ।
- सभी माध्यम महाप्राण, एक डिश (नियंत्रण) में वृद्धि कारकों (भुखमरी माध्यम) के बिना endothelial सेल संस्कृति मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें, तो भुखमरी संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर में ५० एनजी/एमएल वीईजीएफ़ 7 मिनट के लिए एक दूसरे पकवान में जोड़ें ।
- मध्यम और धो कोशिकाओं महाप्राण 10 मिलीलीटर कमरे का तापमान पंजाब के साथ 2 बार ।
- सुनिश्चित करें कि पेट्री व्यंजन बर्फ पर है और इस कदम से उंहें वहां रख रहे हैं ।
- बर्फ शीत lysis बफर के 250-400 µ एल जोड़ें (Bicine/लोग; सामग्री की तालिकादेखें) जलीय चिढ़ाना अवरोधक मिश्रण और DMSO अवरोधक मिश्रण से युक्त (फॉस्फेट अवरोधकों; सामग्री की तालिकादेखें) प्रत्येक 10 सेमी प्लेट के लिए । प्लेट भंवर उचित कवरेज सुनिश्चित करने के लिए और यह बर्फ पर 10 मिनट के लिए रहते हैं ।
नोट: अंतिम एकाग्रता की और DMSO अवरोधक मिश्रण 1x होना चाहिए । - एक सेल खुरचनी और एक पूर्व ठंडा microfuge ट्यूब के हस्तांतरण के साथ पकवान से कोशिकाओं परिमार्जन । पिपेट अप और लाइसे कोशिकाओं को 5 बार नीचे ।
- 4 ° c पर कोशिकाओं को संक्षेप में sonicate । sonicator निम्नानुसार सेट करें: चक्र की संख्या = 5, पावर = कम, = 5 सेकंड पर, बंद = 30 एस. यह चरण न्यूक्लिक एसिड को तोड़ने के लिए शामिल किया गया है, और कोशिकाओं लाइसे करने के लिए नहीं ।
नोट: Sonication प्रोटीन की विकार को रोकने के लिए हल्के होना चाहिए । - भंवर 5 एस के लिए ट्यूब (लगातार नहीं), एक समय में 2 एस (3 बार), और बर्फ पर रखो ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १४,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा lysate स्पष्ट है, तो तुरंत एक साफ पूर्व ठंडा microfuge ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण ।
- एक Bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख किट4का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता उपाय ।
- 10 µ l aliquots बनाओ, सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन में स्नैप फ्रीज, और पर स्टोर-८० ° c उपयोग तक ।
2. नमूना मिश्रण तैयारी (१५० µ एल नमूना मिश्रण के लिए गणना)
- सबसे पहले, DMSO अवरोधक मिश्रण (स्टॉक 50x) और 2 µ (स्टॉक 25x) के 1 µ l को जोड़ने के द्वारा एक नमूना मंदक मिश्रण तैयार नमूना µ के ४७ मंदक l को ( सामग्री की तालिकादेखें), इसलिए कि DMSO अवरोधकों और चिढ़ाने के अवरोधकों के अंतिम एकाग्रता 1x बन जाता है । अगला, प्रोटीन lysates नमूना मंदक मिश्रण का उपयोग करने के लिए वांछित सांद्रता प्राप्त करने के लिए पतला (२.३ कदम देखें) ।
- ३.३२५ µ l मानक सीढ़ी जोड़ने के द्वारा ampholyte/सीढ़ी/DMSO अवरोधक मिश्रण तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें; stock 60x), 6 µ l of छेड़ने वाले अवरोधक (25x), 3 µ l के DMSO (50x) अवरोधक को १३७.६७५ µ l ampholyte premix ( तालिका देखें सामग्री) । भंवर ट्यूब एक समय (3-4 बार), और बर्फ पर रखने में कम से कम 15 एस कुल, 5 एस ।
- एक 1:3 अनुपात में २.१ और २.२ कदम से समाधान मिश्रण, इतना है कि DMSO के अंतिम सांद्रता, चिढ़ाने अवरोधकों, और pI मानक सीढ़ी 1x हो, और केशिका में प्रोटीन अंतिम वांछित सांद्रता तक पहुंचने (जैसे, ५० µ g/एमएल के लिए इस्तेमाल किया गया था चित्रा 2) ।
नोट: प्रोटीन केशिका में एकाग्रता और अच्छी तरह से एक ही हैं । - लोड 10 µ उपयुक्त अच्छी तरह से नमूना मिश्रण के एल, ३८४ के अनुसार अच्छी तरह से प्लेट परख टेम्पलेट लेआउट (चरण 3 और चित्रा 1देखें) और बर्फ पर प्लेट रखने के लिए.
- प्राथमिक (pERK1/2, 1:50 पतला; ERK1/2, 1:100; HSP ७०, 1:500) और माध्यमिक एंटीबॉडी (1:300) एंटीबॉडी मंदक के साथ ( सामग्री की तालिकादेखें) और पिपेट के 10 µ एल प्राथमिक और एक अच्छी तरह से माध्यमिक एंटीबॉडी के 15 µ एल.
नोट: सामांय में, एंटीबॉडी के उच्च एकाग्रता के रूप में पारंपरिक पश्चिमी दाग की तुलना में cIEF परख के लिए आवश्यक हैं । - मिश्रण Luminol और पेरोक्साइड XDR (1:1 अनुपात; सामग्री की तालिकादेखें) एक साथ और पिपेट 15 µ एल में एक अच्छी तरह से ।
नोट: उपयोग करने से पहले हर बार ताजा इन समाधान मिश्रण और बर्फ पर रखने के लिए । - एक बार के नमूने और सभी एजेंट प्लेट में pipetted हैं, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २,५०० x g पर प्लेट केंद्रापसारक नीचे तरल स्पिन और बुलबुले को दूर । यदि बुलबुले अभी भी मौजूद है, उंहें मैंयुअल रूप से एक पतली पिपेट टिप का उपयोग कर हटा दें ।
नोट: प्रति अच्छी तरह से नमूना या रिएजेंट के 20 से अधिक µ एल लोड न करें; अन्यथा साधन पिपेट को ठीक से धोया नहीं जा सकता । सभी रिएजेंट तैयार करने के लिए निर्माता से अनुदेश पुस्तिका का पालन करने के लिए सुनिश्चित करें ।
3. डिजाइनिंग एक नई प्रणाली सॉफ्टवेयर के साथ परख टेंपलेट (1 चित्रा)
- सिस्टम सॉफ़्टवेयर खोलें और फ़ाइल मेनू से "नया" क्लिक करें ।
- लेआउट फलक पर जाएं और एक ३८४ वेल-प्लेट में रिएजेंट और नमूनों के लिए स्थान असाइन करें । ३८४ प्रति ९६ कुओं की एक अधिकतम करने के लिए उपयोग अच्छी तरह से थाली ।
- ब्लॉक में कहीं भी एक अच्छी तरह से क्लिक करके एक एजेंट असाइनमेंट बनाओ । 12 कुओं प्रत्येक के एक पंक्ति ब्लॉक का चयन करें । वेल्स, उदा., 1-12 या 13-24 से, डिफ़ॉल्ट रूप से एक ब्लॉक के रूप में असाइन किए जाते हैं.
- लेआउट फलक उपकरण पट्टी पर जाएं और या तो कोई रिक्त पंक्ति ब्लॉक या कोई नमूना, प्राथमिक, द्वितीयक, या luminol पंक्ति खंड संमिलित करें । प्रत्येक ब्लॉक एक अलग रंग सौंपा है, तो वे अंतर करने के लिए आसान कर रहे हैं ।
नोट: जब एक अच्छी तरह से क्लिक करते हैं, एक काली सीमा ब्लॉक जहां नए ब्लॉक फलक में डाला जाएगा चारों ओर देखा जा सकता है । एक पंक्ति ब्लॉक भी हटाया जा सकता है । - प्रोटोकॉल फलक पर जाएं और प्लेट में एक रिएजेंट स्थान का चयन करें । फिर, नमूना स्तंभ में किसी कक्ष पर क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से एजेंट चुनें ।
- इस एक ही फैशन में, प्राथमिक, माध्यमिक, और प्रत्येक चक्र के लिए luminol के लिए रिएजेंट स्थानों का चयन करें ।
- कक्षों को क्लिक करें, एक बार में एक, प्राथमिक या द्वितीयक एंटीबॉडी स्तंभ में, और यदि आवश्यक हो, तो मशीन समय बदलें ।
नोट: प्रत्येक चक्र के लिए प्रवेश नोट्स भी जोड़ा जा सकता है. - प्रोटोकॉल अनुभाग में ' जोड़ें ' बटन पर क्लिक करके चक्र जोड़ें । 1 चक्र, 4 चक्र, या सभी चक्र (8 चक्रों की एक अधिकतम प्रोटोकॉल के लिए जोड़ा जा सकता है).
नोट: यह इस चरण में चक्र जानकारी की प्रतिलिपि बनाएँ और चिपकाएँ करने के लिए संभव है: एक चक्र का चयन करें, संपादित करें पर जाएँ और कॉपी और पेस्ट. - इस तरह के प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की पहचान, उनकी सूची संख्या और कमजोर पड़ने, आदि, टेम्पलेट फलक में, नमूना से संबंधित जानकारी दर्ज करें । यह एक वैकल्पिक चरण है जो पोस्ट-रन विश्लेषण के दौरान उपयोगी है ।
- नई परख फ़ाइल सहेजें । ' स्टार्ट ' बटन पर क्लिक करने से पहले, जल्दी से सुनिश्चित करें कि सब कुछ सही है लेआउट की जांच करें ।
4. cIEF साधन की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल
- सेट केशिका isoelectric फोकस ट्रो पृथक्करण शर्तें । ये १५,००० µW और ४० मिनट होना चाहिए, और यूवी स्थिरीकरण समय ८० एस होना चाहिए । हालांकि, यूवी स्थिर समय 80-140 एस की सीमा के भीतर सेट किया जा सकता है, और ब्याज की प्रोटीन के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
नोट: यूवी स्थिरीकरण के लिए एक समय बिंदु प्रत्येक चक्र के लिए सेट किया जा सकता है, लेकिन प्रत्येक केशिका के लिए नहीं. - सेट धो 1 से 2 बहाकर, के लिए १५० एस प्रत्येक धोने (डिफ़ॉल्ट), और १२० मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी की मशीन ।
- सेट धो 2 से 2 बहाकर, के लिए १५० एस प्रत्येक धोने (डिफ़ॉल्ट), और ६० मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी की मशीन ।
- 3 धोने सेट, जो 2 बहाकर होना चाहिए, के लिए १५० s प्रत्येक धोने (डिफ़ॉल्ट) ।
- सेट एक्सपोजर बार जब chemiluminescence का पता लगाया जाएगा; ये 30, ६०, १२०, २४०, ४९०, और ९६० एस होना चाहिए । सभी कदम (1-8) एक एकल केशिका में किया जाएगा ।
5. परख फ़ाइल रनिंग
- एक बार सब कुछ तैयार है, क्लिक करें शुरू करने के लिए रन शुरू । सॉफ्टवेयर आप कचरे को हटाने के लिए, पानी और केशिका बॉक्स फिर से भरना करने के लिए, संसाधन ट्रे के लिए anolyte और catholyte जोड़ने के लिए, धोने बफर जोड़ने के लिए और अंत में ठंडा नमूना ट्रे में प्लेट लोड करने के लिए संकेत देगा ।
नोट: ढक्कन केशिका बॉक्स से निकालें, लेकिन ढक्कन परख थाली से दूर नहीं है । थाली से ढक्कन स्वचालित रूप से जब आवश्यक उपकरण द्वारा हटाया जा सकता है । यह एजेंट वाष्पीकरण को रोकने में मदद करता है । - एक दो मिनट के बाद चलाने शुरू कर दिया गया है, एक उपकरण स्थिति पट्टी कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रदर्शित किया जाएगा । स्थिति संदेश और प्रगति सलाखों के उपकरण के वर्तमान चरण के लिए इसी के अनुरूप देखा जा सकता है ।
नोट: शुरू में, साधन अगर सब कुछ अलग ट्रे में anolyte और catholyte पिपेट करने के लिए आगे बढ़ने से पहले, 12 केशिकाओं के पहले ब्लॉक उठा, प्लेट के ढक्कन को हटाने, और नमूने से नमूनों रखने की जांच करेगा प्लेट केशिकाओं में, और फिर अंत में ट्रो के लिए जुदाई चैंबर में । - दो फलक देखने के लिए सारांश चलाएं स्क्रीन पर क्लिक करें: स्थिति और पृथक्करण । उपयोगकर्ताओं को चलाने की प्रगति देख सकते हैं, और जुदाई की फिल्में (प्रत्येक चक्र के 12 केशिकाओं) जब प्रत्येक चक्र के ट्रो कदम पूरा हो गया है संग्रहीत किया जा सकता है । एक केशिका में ट्रो जुदाई का पालन करने के लिए, वांछित चक्र पर क्लिक करके उस केशिका के लिए जुदाई फिल्म खेलने के लिए और फिर नियंत्रण कक्ष में खेलने के बटन ।
- रन फ़ाइल के पूरा होने पर स्वचालित रूप से संग्रहीत किया जा सकता है ।
6. डेटा का विश्लेषण (आंकड़ा एस1)
- चलाएं फ़ाइल खोलें और विश्लेषण स्क्रीन टैब का चयन करें । चित्रा S1Aमें, नमूना ग्राफ में (चोटियों) दिखाया डेटा चयनित केशिका (यानी, चक्र 1 से 4वें केशिका) से है ।
- संपादित करेंक्लिक करें, और उसके बाद विश्लेषण (आरेख S1B) । इस स्तर पर, उपयोगकर्ता pI श्रेणी परिवर्तित कर सकते हैं, किसी दिए गए प्रयोग के लिए उपयुक्त pI मानक लागू करें, एक पीक फ़िट जोड़ें, और एक पीक नाम जोड़ें ।
नोट: जब एक पीएच 5-8 ampholyte premix का उपयोग कर (जैसा मामला यहां है), की सिफारिश की मानक सीढ़ी का उपयोग करने के लिए ४.९, ६.०, ६.४, ७.०, और ७.३ के पीआईएस के साथ फ्लोरोसेंट लेबल पेप्टाइड्स के साथ एक है, और जब एक पीएच 3-10 premix का उपयोग कर, की सिफारिश की सीढ़ी ४.० के पीआईएस के साथ एक है , ४.९, ६.०, ६.४, और ७.३. 2 - परिणाम चोटियों टैब में प्रदर्शित कर रहे हैं; नमूनों के लिए प्रदर्शित मानों की स्थिति, pI, पीक ऊंचाई और क्षेत्र,% क्षेत्र, पीक चौड़ाई, और शोर करने के लिए संकेत (S/N) (चित्रा S1C) हैं । उपयोग करने के लिए डेटा चुनें, और आगे के विश्लेषण के लिए डेटा निर्यात करें ।
नोट: डेटा केवल पीक (figure S1C) को लेबल करने के बाद निर्यात किया जा सकता है ।
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Representative Results
एक नई परख के डिजाइन: एक परख प्लेट लेआउट चित्र 1aमें दिखाया गया है । अधिक से अधिक, ९६ कुओं से ३८४ अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है प्लेट प्रत्येक हालत (एंटीबॉडी) के लिए 12 कुओं के ब्लॉक में । 12 कुओं के प्रत्येक ब्लॉक A1-A12 या A13-A24 से या तो शुरू कर सकते हैं । रंग कोडित पंक्तियाँ एक नमूने या एजेंट एक दूसरे से भेद करने के लिए अनुमति दें । परख में टेंपलेट (आंकड़ा 1b), कि विशेष रूप से परख के लिए प्रासंगिक जानकारी संग्रहीत किया जा सकता है, जो परिणाम विश्लेषण के बाद के चरणों में इस्तेमाल किया जा सकता है । चित्रा 1C प्रोटोकॉल का सारांश दिखाता है ।
phosphorylated और unphosphorylated extracellular विनियमित कळेनासे (pERK1/2 और ERK1/HUVEC lysate में प्रोटीन का पता लगाने वीईजीएफ़ के साथ प्रेरित: सामांय में, इस तरह के phosphoproteins के रूप में अनुवाद संशोधित प्रोटीन, पोस्ट, उनकी कम मात्रा और क्षणिक प्रकृति की वजह से पता लगाने के लिए मुश्किल है, और विशिष्ट एंटीबॉडी की कमी है । संवहनी Endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) उत्तेजना निंनलिखित सीरम भुखमरी रिसेप्टर tyrosine कळेनासे (VEGFR2) है कि MAPK ERK में और मार्ग को सक्रिय करने के लिए सुराग सक्रिय करता है । HUVECs का उपयोग कर प्रयोगों के लिए, के साथ या बिना वीईजीएफ़ के लिए उत्तेजित कोशिकाओं से lysates 7 मिनट के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया. चित्रा 2a ± वीईजीएफ़-उत्तेजित lysates से pERK1/2 के electropherogram से पता चलता है । जाहिर है, वीईजीएफ़ के साथ वहां phosphorylated प्रोटीन की बहुत उच्च प्रेरण (चोटियों लाल में उल्लिखित) है । इनसेट अंतर्जात लोडिंग नियंत्रण HSP ७० (चित्रा 2a इनसेट), दोनों अनुपचारित और इलाज के नमूनों के लिए नमूनों की इसी तरह लदान का संकेत दिखाता है । पारंपरिक immunoblot में (चित्रा 2cबाएँ पैनल) केवल दो बैंड का पता लगाया गया (phosphoERK1; pERK1 और pERK2). हालांकि, pERK1/2 प्रोटीन के लिए 4 चोटियों में हल किया गया ppERK2, pERK2, ppERK1, और pERK1 द्वारा cIEF विश्लेषण (चित्रा 2a) । इसी प्रकार, चित्रा 2 बी ± वीईजीएफ़ से ERK1/२ के electropherogram से पता चलता है-उत्तेजित lysates । इनसेट समानांतर में इस्तेमाल एक ही लोडिंग नियंत्रण दिखाता है । एक पारंपरिक immunoblot केवल दो बैंड ERK1 और ERK2 के लिए इसी से पता चलता है (चित्रा 2cसही पैनल) जबकि cIEF के साथ, pERK1/ERK2 6 चोटियों में हल किया गया था (चित्रा 2 बी) सभी 4 अलग phosphorylated के लिए इसी चोटियों और 2 unphosphorylated चोटियों, ERK1 और ERK2. यह cIEF के साथ लाभ में से एक को दर्शाता है, अर्थात् है कि प्रोटीन isoforms हल किया जा सकता है और दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन । इसके अलावा, यह प्रोटीन कोर करने के लिए निर्देशित एक एंटीबॉडी से phosphorylated isoforms की मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए संभव है, के बजाय posttranslational संशोधन.
चित्रा 1 : सॉफ्टवेयर में परख प्लेट लेआउट की डिजाइनिंग । (A) ३८४-अच्छी तरह से प्लेट लेआउट सभी रिएजेंट की स्थिति को परिभाषित । रंग-कोडित 12 अच्छी तरह से नमूनों, एंटीबॉडी, और chemiluminescent रिएजेंट के लिए स्थान दिखा पंक्तियाँ. (ख) एक परख व्यक्तिगत रूप से अच्छी तरह से प्रासंगिक जानकारी दिखा टेंपलेट । (ग) चक्र 1 और 2 के लिए सभी प्रासंगिक जानकारी दिखा प्रोटोकॉल । 1 चक्र में (रंगीन बॉक्स में दिखाया गया के रूप में 12 केशिकाओं), साधन a1 से नमूना लेता है (वेल्स a1-A12 से) b1 से प्राथमिक एंटीबॉडी के बाद (वेल्स b1-बी-12 से), (d1-D12 से वेल्स) माध्यमिक एंटीबॉडी d1 से, और अंत में luminol: XDR से पेरोक्साइड J1 (कुओं से J1-J12). 2चक्र में, सब कुछ पहले चक्र के रूप में एक ही है, सिवाय इसके कि c1 से प्राथमिक एंटीबॉडी लेता है (वेल्स c1-C12 से). यह आंकड़ा Aspinall-O'Dea एट अल. २०१५2से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : cIEF परख और पारंपरिक immunoblot परख द्वारा phosphorylated और कुल Mitogen-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (ERK 1/2) प्रोटीन का पता लगाना । (क) pERK1 के लिए प्रतिनिधि electropherogram/2 और प्रोटीन के लिए HUVECs इलाज ± VEGFA cIEF परख द्वारा पीछा किया, pERK1/2 एंटीबॉडी के लिए जांच की । नीली रेखा (उत्तेजित) और लाल रेखा (उत्तेजित) । चोटियों अलग phosphorylated पर्क/2 isoforms उनके isoelectric अंक के आधार पर अलग दिखा । इनसेट अंतर्जात नियंत्रण HSP70 समानांतर में चलाने के एक ही lysate के साथ दिखाता है । (ख) प्रतिनिधि electropherogram दिखा ERK1/2 ± VEGFA-उत्तेजित lysate । इनसेट अंतर्जात नियंत्रण HSP70 कि समानांतर में चला गया था दिखाता है । electropherogram के लिए, ५० µ जी/एमएल lysate सांद्रता इस्तेमाल किया गया, जो केशिका में कुल प्रोटीन के 20 एनजी के बराबर है । (ग) pERK1 के लिए परम्परागत immunoblotting/2 और ERK1/2 प्रोटीन पर ± VEGFA (५० एनजी/एमएल) उत्तेजित HUVEC कोशिका lysate । कुल lysate प्रति लेन के 10 µ g का उपयोग immunoblotting के लिए कया गया था. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
पूरक आंकड़ा एस s: परिणाम विश्लेषण के चरणों
(क) परिणामों को ब्याज की केशिका से देखें । (ख) संपादित करें/परख फ़ाइल में विभिंन मापदंडों जोड़ें । (ग) यह आगे विश्लेषण के लिए डेटा निर्यात करने से पहले चोटियों के लिए चोटी के नाम जोड़ने के लिए संभव है. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
संवेदनशीलता और प्रोटीन के संकल्प जैविक नमूनों पर proteomic अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं । वहां महान मूल्य में प्रोटीन जो कोशिकाओं में मिनट मात्रा में मौजूद है का पता लगाने में सक्षम किया जा रहा है । cIEF प्रोटीन और उनके isoforms4का पता लगाने के लिए बेहतर संवेदनशीलता और संकल्प की पेशकश कर सकते हैं ।
इस तकनीक का सफलतापूर्वक इस्तेमाल कई proteomic रिसर्च रिपोर्ट5,6,7में किया गया है । फिर भी, कई सीमाएं इसके साथ जुड़े रहे हैं, इस तथ्य के रूप में है कि नहीं सभी प्राथमिक एंटीबॉडी एक संकेत भी अगर वे अच्छी तरह से पारंपरिक immunoblots में काम दे सकते हैं । वहां है, के रूप में अभी तक, मांय एंटीबॉडी की कोई सूची cIEF में समारोह के लिए दिखाया गया है, क्योंकि इस तकनीक काफी नया है । अंत में, साधन से कम 12 नमूनों या एक समय में ९६ से अधिक नमूनों को संभाल नहीं कर सकते ।
cIEF पारंपरिक immunoblotting के लिए एक वैकल्पिक तकनीक है, लेकिन यह समान परिणाम नहीं दे सकता है । cIEF को संवेदनशीलता और संकल्प के संदर्भ में परम्परागत immunoblotting से दूर तक श्रेष्ठ दिखाया गया है. इसके अलावा, cIEF उच्च प्रवाह है, मजबूत, स्वचालित, रोबोट, और अति संवेदनशील, कम से 25 कोशिकाओं से संकेत उपज प्रोटीन पर निर्भर करता है1का विश्लेषण किया । यह मात्रात्मक और अत्यधिक reproducible है, हैंडलिंग के रूप में छोटा है । इसी तरह के आकारों के विभिन्न प्रोटीन isoforms का पता लगाना आसानी से सुलझाया जा सकता है । इस प्रकार, एक ही एंटीबॉडी नमूना4की नैनोग्राम मात्रा से phosphorylated और unphosphorylated प्रोटीन रूपों पर मात्रात्मक जानकारी दे सकते हैं । हालांकि दोनों पारंपरिक immunoblot और cIEF एंटीबॉडी आधारित chemiluminescent पता लगाने पर निर्भर करते हैं, कुछ महत्वपूर्ण मतभेद हैं, जैसे कि पारंपरिक immunoblotting में, प्रोटीन उनके आणविक वजन के आधार पर अलग कर रहे हैं, जबकि cIEF में, जुदाई प्रोटीन चार्ज पर आधारित है । अंत में, प्रोटीन immunoblot में विकृत कर रहे हैं, जबकि वे cIEF में अपने पैतृक राज्य में संरक्षित कर रहे हैं । यह अंतिम बिंदु कारण है कि एक ही एंटीबॉडी हो सकता है या दोनों तरीकों से काम नहीं कर सकते ।
कई विभिन्न अध्ययनों ने मानव रोगी नमूनों से प्रोटीन फास्फारिलीकरण अध्ययन करने के लिए cIEF के आवेदन का प्रदर्शन किया है3, मानव बृहदांत्र कैंसर के नमूने4,8, माउस ट्यूमर ऊतक9, या विभिन्न सेल लाइनों 10. इस विधि को अपनाने proteomic अनुसंधान में दवा की खोज, नैदानिक प्रयोजनों, के रूप में कई क्षेत्रों में तेजी से प्रगति को बढ़ावा देने के सकता है खोज, और संकेत अध्ययन ।
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Disclosures
लेखक ने कोई खुलासे नहीं किए हैं ।
Acknowledgments
लेखक धंयवाद प्रो लीना क्लैसन-वेल्श, उपसाला विश्वविद्यालय, इस परियोजना के विकास के लिए उसके समर्थन के लिए स्वीडन । इसके अतिरिक्त, लेखक धंयवाद रॉस स्मिथ और लीना क्लैसन-वेल्श, उपसाला विश्वविद्यालय उनके महत्वपूर्ण पढ़ने और सुझावों के लिए पांडुलिपि में सुधार के लिए ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
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