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Chemistry

पता लगाना और प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम के जलीय लाल रक्त कोशिकाओं में ठहराव तनु कुल प्रतिबिंब अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी और बहुभिंनरूपी डेटा विश्लेषण द्वारा

doi: 10.3791/56797 Published: November 2, 2018

Summary

यहां, हम पता लगाने और संक्रमित जलीय लाल रक्त कोशिकाओं में प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम के ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान एक तनु कुल प्रतिबिंब अवरक्त स्पेक्ट्रोमीटर और बहुभिंनरूपी डेटा विश्लेषण का उपयोग कर ।

Abstract

हम ठहराव का एक तरीका है और जलीय लाल रक्त कोशिकाओं में परजीवी का पता लगाने का प्रदर्शन (RBCs) एक सरल benchtop का उपयोग करके तनु कुल परावर्तन रूपान्तर स्पेक्ट्रोमीटर डेटा विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में अवरक्त (एटीआर-स्विचेज) बहुभिंनरूपी रूपांतरण ( MVDA) । 3D7 P. फाल्सीपेरम 10% parasitemia अंगूठी चरण परजीवी को प्रसंस्कृत थे और ताजा दाता अलग RBCs के बीच एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला बनाने के लिए 0-1% कील थे । 10 प्रत्येक नमूने के µ एल एटीआर हीरे की खिड़की के केंद्र पर रखा स्पेक्ट्रम प्राप्त किया गया । नमूना डेटा शोर अनुपात करने के लिए संकेत में सुधार करने के लिए और पानी के योगदान को दूर करने के लिए इलाज किया गया था, और फिर दूसरी व्युत्पंन वर्णक्रमीय सुविधाओं को हल करने के लिए लागू किया गया था । डेटा तो MVDA के दो प्रकार: पहले मुख्य घटक विश्लेषण (पीसीए) का उपयोग कर किसी भी outliers निर्धारित करने के लिए और फिर आंशिक कम वर्गों प्रतिगमन (PLS-R) ठहराव मॉडल बनाने के लिए विश्लेषण किया गया ।

Introduction

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मलेरिया हमारे समय के सबसे विनाशकारी रोगों के बीच है; आधी से अधिक आबादी स्थानिकमारी वाले क्षेत्रों में जोखिम में रहती है और यह अधिकतर बोझ गरीब1,2,3,4। इस मुद्दे का एक बड़ा हिस्सा स्पर्शोन्मुख वाहक और प्रारंभिक चरण के रोगियों है कि मच्छर वैक्टर5के लिए जलाशयों के रूप में कार्य, गीला मौसम के दौरान संक्रमण के spikes के कारण और यह समुदायों में जारी रखने के लिए अनुमति देता है । मलेरिया पाँच प्लाज्मोडियम परजीवी के कारण होता है, जिनमें से सर्वाधिक घातक पी. फाल्सीपेरम है जो रोग के सबसे गंभीर रूप2का कारण बनता है.

वर्तमान में, मलेरिया के निदान के लिए तकनीक सही से कम कर रहे हैं । ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी, वर्तमान सोने के मानक, केवल 62-88 परजीवी का पता लगा सकते है/µ एल विधि के आधार पर6का इस्तेमाल किया । इसके अलावा, गहन और उच्च कौशल की आवश्यकता के कारण, कई क्षेत्रों में सूक्ष्म निदान > 50% मामलों के, विशेष रूप से कम parasitaemia2स्तर है, जो सीधे क्षेत्र और परिणामों में संसाधनों की कमी के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है के साथ उन में विरोधी मलेरिया दवाओं का दुरुपयोग । अंय 2 मुख्य नैदानिक तरीकों रैपिड नैदानिक परीक्षण (RDTs), जो पता लगाने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं, और पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) परख, जो भेदभाव और डीएनए से परजीवी मात्रा । वर्तमान में, RDTs ही कर रहे है पी फाल्सीपेरम और पी vivax का पता लगाने के कम १०० परजीवी/µ एल के रक्त रोग के दुर्लभ रूपों में जिसके परिणामस्वरूप इलाज किया जा रहा है । 7 , 8 इसके विपरीत, पीसीआर परख भेदभाव और 0.0004 की एक संवेदनशीलता-5 परजीवी/µ एल रक्त में प्लाज्मोडियम की विभिंन प्रजातियों को बढ़ाता है । हालांकि, यह महंगा रिएजेंट, उपकरण और तकनीकी कौशल की आवश्यकता है, और इस प्रकार क्षेत्र आवेदन के लिए उपयुक्त नहीं है ।

एक अति संवेदनशील, विश्वसनीय और सस्ती तकनीक निदान समय में सुधार करने के लिए आवश्यक है, और इस प्रकार रोगी परिणामों में सुधार, और रोग उन्मूलन संभव बनाने. तनु कुल प्रतिबिंब रूपान्तर रूपांतर (एटीआर-स्विचेज) स्पेक्ट्रोस्कोपी इस समस्या का एक संभावित समाधान प्रदान करता है । पिछले काम से पता चला है कि यह संभव था पता लगाने के लिए और मेथनॉल में P. फाल्सीपेरम मात्रा तय रक्त फिल्मों < 1 परजीवी/µ एल रक्त (< 0.0002% parasitemia)9, जो पीसीआर तरीकों के बराबर है की पहचान की सीमा को प्राप्त करने । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि यह पता लगाने और जलीय नमूनों में परजीवी मात्रा और इस तरह निर्धारण कदम को खत्म करने के लिए संभव है । हालांकि, जल वाष्प, वर्णक्रमीय शोर और डेटा उपचार के रूप में कारकों इष्टतम परिणाम10के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए ।

इस प्रोटोकॉल के लिए नए उपयोगकर्ताओं को कैसे एटीआर-स्विचेज स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए और फाल्सीपेरम का पता लगाने के लिए एक प्रतिगमन मॉडल तैयार जलीय लाल रक्त कोशिकाओं से (आरबीसी)10नमूनों को दिखाने के लिए करना है ।

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Protocol

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कृपया उचित सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श करें और उपयुक्त सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल-2) प्रशिक्षण की तलाश । सभी संवर्धन कदम एक बीएसएल में किया जाना चाहिए-2 अपूतित तकनीक का उपयोग कर कैबिनेट, जिसका अर्थ है हानिकारक यूवी विकिरण के लिए जोखिम के एक जोखिम है संक्रमण कदम, सुई स्टिक चोटों, और संभावित जैविक जोखिम और संक्रमण अगर परजीवी संस्कृति कोई चोट में प्रवेश करती है । इसके अलावा, रक्त बैंकों से स्टॉक रक्त केवल कुछ रोगों और रक्त जनित रोगों के प्रसार के लिए क्षमता के लिए जांच की है एक संभावित जोखिम है । चोट की घटना में तत्काल चिकित्सा सहायता लेनी चाहिए ।

1.3D7 प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम परजीवी कमजोर पड़ने श्रृंखला की तैयारी और माप

नोट: प्लाज्मोडियम एसपी. संस्कृति अति संवेदनशील है । ताज़ा/अनसमस रिएजेंट का उपयोग करें और मीडिया को बदलकर नियमित रूप से परजीवी खिलाएं । 5% parasitemia हर दूसरे दिन नीचे फ़ीड संस्कृतियों; दिन में एक या दो बार 6-10% parasitemia के बीच संस्कृतियों फ़ीड; और 11 के बीच संस्कृतियों फ़ीड-20% अप करने के लिए 4 बार एक दिन । परजीवी है कि भूखे अपने आकार खो देंगे और अनुबंध शुरू करने के लिए शुरू कर रहे हैं । ऐसी स्थिति में, मीडिया को बदल कर और स्टॉक RBCs को जोड़ते हुए तुरंत फ़ीड और पतला करें । पहले 6 एच के भीतर थक्कारोधी और माप के रूप में हेपरिन युक्त रक्त संग्रह ट्यूबों में दाता रक्त इकट्ठा ।

  1. संस्कृति 3D7 तनाव प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम के 30 मिलीलीटर की कुल मानक प्रोटोकॉल के अनुसार परजीवी जब तक parasitemia 10% के छल्ले तक पहुंचता है ।
  2. परजीवी का तुल्यकालन
    1. 11 h परजीवी जीवनचक्र में shizogeny के बाद, संस्कृति को पुनर्स्थगित करें और एक स्वचालित पिपेट का उपयोग करके ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरण ।
    2. 300 पर संस्कृति केंद्रापसारक-400 x जी और मानक प्रयोगशाला शर्तों (25 डिग्री सेल्सियस और १०० केपीए) 5 मिनट के लिए ।
    3. यह एक पिपेट के साथ ड्राइंग द्वारा supernatant निकालें या गोली परेशान बिना एक वैक्यूम करने के लिए संलग्न एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर । अपशिष्ट मीडिया को 10% ब्लीच समाधान में छोड़ें ।
    4. धीरे जोड़ें 12 – गोली करने के लिए 4% सोर्बिटोल समाधान के 15 मिलीलीटर एक स्वचालित पिपेट का उपयोग और संस्कृति समरूप है जब तक कैपिंग और ट्यूब पलटना द्वारा संस्कृति मिश्रण.
    5. 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर संस्कृति की मशीन ।
    6. 300 में संस्कृति केंद्रापसारक-400 x जी और 5 मिनट के लिए मानक प्रयोगशाला की स्थिति ।
    7. चरण 1.2.3 में बताए अनुसार supernatant निकालें ।
    8. जोड़ें 10-०.९% की 15 मिलीलीटर गोली को खारा और कैपिंग और ट्यूब औंधा जब तक संस्कृति समरूप है द्वारा समाधान मिश्रण ।
    9. दोहराएं कदम 1.2.6-1.2.8 दो बार और अधिक सोर्बिटोल के सभी अवशेष धोने के लिए ।
  3. parasitemia कमजोर पड़ने की श्रृंखला की तैयारी
    1. धो स्टॉक RBCs के रूप में कदम 1.2.6 – 1.2.9 ।
    2. मानक प्रयोगशाला की स्थिति में संस्कृति केंद्रापसारक, शेयर RBCs पर 300-400 x जी 5 मिनट के लिए और supernatant त्यागें चरण 1.2.3 में के रूप में ।
    3. लेबल microcentrifuge ट्यूबों के रूप में 0%, ०.०१०%, ०.०२५%, ०.०७५%, ०.१००%, ०.२५०%, ०.७५०% और १.०००%, और जोड़ 0 µ एल, 1 µ एल, २.५ µ एल, ७.५ µ एल, 10 µ एल, 25 µ एल, ७५ µ एल और संस्कृति के १०० µ एल क्रमशः एक 0.2-20 µ l पिपेट का उपयोग कर ।
    4. जोड़ १०० µ l, ९९ µ l, ९७.५ µ l, ९२.५ µ l, ८० µ l, ७५ µ l, 25 और 0 µ l के शेयर RBCs को ट्यूबों बला 0%, ०.०१०%, ०.०२५%, ०.०७५%, ०.१००%, ०.२५०%, ०.७५०%, और १.०००%, क्रमशः ।
    5. १,२०० x जी और 10 मिनट के लिए मानक प्रयोगशाला शर्तों पर थक्कारोधी ट्यूबों में एकत्र ताजा दाता रक्त केंद्रापसारक ।
    6. यह एक पिपेट के साथ ड्राइंग और चरण 1.2.3 में वर्णित के रूप में त्याग के द्वारा प्लाज्मा निकालें ।
    7. प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब में अलग RBCs के ९०० µ एल जोड़ें और 10x औंधा द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
  4. वर्णक्रमीय अधिग्रहण
    1. साथ वर्णक्रमीय अधिग्रहण कार्यक्रम का उपयोग करना, "साधन सेट अप" पर क्लिक करें और निम्न करने के लिए डेटा संग्रह पैरामीटर सेट: पृष्ठभूमि के लिए १२८ स्कैन; ३२ नमूना के लिए स्कैन; और साधन के अधिकतम नमूना सीमा से अधिक 8/सेमी करने के लिए संकल्प ।
    2. निर्माता की सिफारिश या रातोंरात प्रति एटीआर-स्विचेज स्पेक्ट्रोमीटर के तापमान सेट करें ।
    3. धीरे एक परिपत्र गति में झाड़ी से साफ एक प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछे ultrapure पानी से भीगा का उपयोग कर क्रिस्टल । फिर अच्छी तरह से एक और एक प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछ प्रयोग शुष्क ।
    4. "पृष्ठभूमि माप" पर क्लिक करके हवा की एक पृष्ठभूमि माप ले लो । हर 20 मिनट, कदम 1.4.3 में के रूप में क्रिस्टल साफ और इस माप को दोहराने ।
    5. "पूर्वावलोकन" पर क्लिक करके लाइव देखें खोलें. एक समतल, क्षैतिज आधार रेखा है कि इंगित करता है कि क्रिस्टल साफ है निरीक्षण ।
    6. पिपेट 10 µ एल के लिए सीधे क्रिस्टल के बीच पर और क्लिक करें "उपाय नमूना" । हर पांचवे सैंपल के बाद इस वॉटर माप को दोहराएँ ।
    7. एक एक प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछ और एक सौंय परिपत्र गति का उपयोग क्रिस्टल सूखी ।
    8. पिपेट 10 µ l का नमूना और क्लिक करें "नमूना उपाय".
    9. के रूप में चरण 1.4.3 में नमूनों के बीच क्रिस्टल साफ ।
    10. दोहराएँ जब तक 3 प्रतिकृति प्राप्त कर रहे हैं, दोनों नमूनों और प्रतिकृति के आदेश यादृच्छिक करने के लिए सुनिश्चित कर रहे हैं.

2. बहुभिंनरूपी डाटा एनालिसिस (MVDA)

नोट: डेटा उपचार पूरे डेटासेट पर किया जाना चाहिए ताकि शोर से बचने के लिए और गैर जैविक मूल की चोटियों के अलावा. इसके विपरीत, जैविक रूप से प्रासंगिक क्षेत्रों पर विश्लेषण करें: 2980-2800/मुख्यमंत्री और 1750-850/

  1. डेटा उपचार
    नोट: दो सॉफ्टवेयर, उदाहरण के लिए, Matlab (बाद में सॉफ्टवेयर 1 के रूप में संदर्भित) और Unscrambler एक्स (इसके बाद सॉफ्टवेयर 2 के रूप में संदर्भित) MVDA के लिए उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है । सॉफ्टवेयर 1 एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (GUI) के अलावा बिना MVDA प्रदर्शन करने की क्षमता है । हालांकि, यह एक जीयूआई (सामग्री की मेज) खरीद की सिफारिश की है । निंन निर्देश जब 1 सॉफ़्टवेयर की चर्चा करते हुए कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध GUI toolbox के साथ संयोजन के रूप में है, और उदाहरण डेटा उपचार स्क्रिप्ट संलग्न किया गया है मान जाएगा ।
    1. उपयुक्त बहुभिंनरूपी डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें, "डेटा आयात करें" पर क्लिक करके विश्लेषण के लिए फ़ाइल का प्रकार चुनें.
      1. सॉफ्टवेयर 1 में, इनपुट "विश्लेषण" आदेश विंडो में जीयूआई खोलने के लिए । दायां क्लिक करें X बॉक्स को खोजने के लिए "डेटा आयात" ।
      2. सॉफ्टवेयर 2 में, टैब पर क्लिक करें "फ़ाइल" खोजने के लिए "आयात".
    2. आयात नमूना, पानी और आधार रेखा स्पेक्ट्रा प्रत्येक सेट में सभी स्पेक्ट्रा का चयन करके कार्यक्षेत्र में डेटा सेट के रूप में अलग और क्लिक "खुला" और प्रत्येक सेट एक छोटा नाम दे, उदाहरण के लिए , ' वाट ' के डेटासेट के लिए पानी स्पेक्ट्रा.
    3. नई तालिका/मैट्रिक्स पर क्लिक करके चुनें "नई मैट्रिक्स/वेक्टर" और उत्पंन एक n × 1 सदिश, जहां n नमूनों की संख्या है । प्रत्येक नमूने के parasitemia को इनपुट करें और वेक्टर को ' parasitemia ' नाम दें ।
      1. सॉफ़्टवेयर 1 में, आदेश विंडो में "नया चर" क्लिक करें ।
      2. सॉफ्टवेयर 2 में, आइकन पर क्लिक करें "नया मैट्रिक्स".
    4. "प्लॉट डेटा आइकन" पर क्लिक करके डेटा प्लॉट करें. पानी वाष्प प्रभाव के लिए स्पेक्ट्रा पर क्लिक करके निरीक्षण करें "ज़ूम" और ज़ूमिंग पर 1800-1400/cm; सबसे स्पष्ट रूप से, मैं के बीच और द्वितीय बैंड के बीच की ढलानों के साथ छोटे, तेज, संकीर्ण चोटियों के रूप में मनाया ।
    5. चरम जल वाष्प के मामलों में, संपादित करें/पूर्व प्रक्रिया डेटा टैब खोलें, और "स्मूथिंग" का चयन करें । नमूना और पानी स्पेक्ट्रा चिकनी या एक जल वाष्प सुधार विधि का उपयोग करने के लिए 25 अंक का उपयोग करके सुचारू रूप से शोर और/
    6. गैर-क्षैतिज आधार रेखा सुधार एल्गोरिथ्म का उपयोग करते हुए उपयुक्त, यदि समान संपादित करें/पूर्व-प्रक्रिया डेटा टैब के अंतर्गत चरण 2.1.4 में सही है ।
    7. औसत पानी स्पेक्ट्रा और एक n × मीटर मैट्रिक्स नमूना dataset करने के लिए समकक्ष में पंक्तियों की प्रतिलिपि बनाएँ और इसे ०.७ से गुणा करके ७०% तीव्रता को कम.
      1. सॉफ़्टवेयर 1 में, ऐसा आदेश विंडो में निम्न स्क्रिप्ट "AverageWater = माध्य (WaterDataset)" का पालन करके ऐसा करते हैं । फिर कॉपी-नमूना डेटा सेट से मेल करने के लिए पंक्तियों को पेस्ट करें । तीव्रता को कम करने के लिए, इनपुट "AverageWater70 = AverageWater * 0.70" ।
    8. प्रत्येक नमूना स्पेक्ट्रम से औसत पानी स्पेक्ट्रा घटाना.
      1. सॉफ़्टवेयर 1 में, निम्न स्क्रिप्ट "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70" को लगा कर आदेश विंडो में ऐसा करते हैं ।
    9. कोई दूसरा व्युत्पन्न फ़ंक्शन लागू करने के लिए संपादित करें/पूर्व-प्रक्रिया डेटा टैब खोलें, और उसके बाद एकल सामान्य variate (SNV) फ़ंक्शन का चयन करके डेटा को सामान्य और केंद्र डेटा का अर्थ है ।
      1. सॉफ्टवेयर 1 में, एक जाने में ऐसा करते हैं । पहले का चयन करें "व्युत्पंन", और इनपुट स्मूथिंग के 25 अंक, नमूना सेट पर 3 और व्युत्पंन आदेश के बहुपद आदेश चिकनी और एक Savitzky-Golay समारोह के 25 अंक का उपयोग कर । फिर "SNV" और "मतलब केंद्र" का चयन करें । क्लिक करें "ठीक है/
    10. संपादित करें/पूर्व प्रक्रिया डेटा टैब खोलें और "स्तंभ चर" में, का चयन करें 2980 – 2800/cm और 1750 – 850/मुख्यमंत्री केवल उनके बक्से टिक कर रहे हैं सुनिश्चित करके.
  2. डेटा विश्लेषण
    1. प्रिंसिपल घटक विश्लेषण (पीसीए)
      1. क्लिक करें "विश्लेषण । अपघटन "और पीसीए का चयन करें ।
        1. में सॉफ्टवेयर 1, क्लिक करें "मॉडल बनाएं" ।
        2. सॉफ्टवेयर 2 में, इनपुट पीसीए तरीकों । मुख्य घटक (PCs) की उपयुक्त संख्या इनपुट-इस काम में, 7-और १०० पुनरावृत्तियों की एक अधिकतम, और सत्यापन विधि के लिए क्रॉस-मांयता का चयन करें । क्लिक करें "भागो" ।
      2. PC1 और PC2 के बीच स्कोर साजिश पर ९५% विश्वास सीमा, धराशायी अंगूठी, निरीक्षण ।
      3. नमूना स्पेक्ट्रा "का चयन करें स्पेक्ट्रा उपकरण" का उपयोग करते हुए संभावित outliers के रूप में सीमा के बाहर होने वाले स्कोर के साथ चिह्नित ।
      4. यदि चिह्नित स्पेक्ट्रा उच्च Hotellings टी2 मूल्यों और उच्च क्ष अवशिष्टों है उंहें आगे विश्लेषण से बाहर ।
    2. आंशिक कम वर्गों प्रतिगमन (PLS-R)
      1. क्लिक करें "विश्लेषण । प्रतिगमन "और चुनें" PLS-आर "।
        1. में सॉफ्टवेयर 1, दायां क्लिक करें Y ब्लॉक और वेक्टर का चयन "Parasitemia । मॉडल का निर्माण "।
        2. में सॉफ्टवेयर 2, इनपुट PLS-R तरीके । "Y संदर्भ" और नमूना dataset के रूप में "X डेटा सेट" के रूप में वेक्टर "Parasitemia" का चयन करें और मांयता विधि के रूप में क्रॉस-मांयता का चयन करें । क्लिक करें "भागो" ।
      2. प्रतीपगमन मॉडल का विश्लेषण करें । R2 ०.८० से अधिक मान और रूट माध्य वर्ग त्रुटि क्रॉस-मांयता (RMSECV) मान से कम ०.१% parasitemia हैं जो स्वीकार्य मॉडल हैं ।
      3. प्रतिगमन वेक्टर का विश्लेषण और जैविक बैंड की पहचान ।

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Representative Results

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आंशिक ंयूनतम वर्ग (PLS-R) साजिश और उसके जुड़े प्रतिगमन वेक्टर, आंकड़ा 1a और 1b क्रमशः, पता चलता है कि परजीवी से संकेत काफी RBCs से अलग है कि वे एक रैखिक प्रतिगमन के लिए इस्तेमाल किया जा मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है भविष्य डेटा सेट में परजीवी की भविष्यवाणी ।

एक मजबूत, रैखिक PLS-r मॉडल ०.८७ के एक आर चुकता मूल्य के साथ उत्पंन किया गया था और एक जड़ मतलब ०.१३% parasitemia, आंकड़ा 1aके पार मांयता त्रुटि (RMSECV) चुकता । parasitemia स्तर में वृद्धि मुख्यतः न्यूक्लिक एसिड बैंड के साथ जुड़े रहे हैं, विशेष रूप से १०४२, १०८३ और 1226/मुख्यमंत्री, जो ν को सौंपा (सी = हे) आरएनए ribose समूह से, νएस(पीओ4-) और ν(पीओ4-) क्रमशः, और फार्म प्रतीपगमन वेक्टर के प्रमुख नकारात्मक भाग । इसका कारण यह है RBCs एक नाभिक की कमी है और इस प्रकार न्यूक्लिक एसिड परजीवी के लिए मजबूत संकेतक हैं । इसके अलावा, 1226/मुख्यमंत्री बैंड इंगित करता है कि संरचना एक बी डीएनए फार्म है, जो जलीय राज्य12में मापने के महत्व पर प्रकाश डाला गया है । इसके विपरीत, परजीवी आरबीसी घटकों का उपभोग, मुख्य रूप से हीमोग्लोबिन, और इस प्रकार लिपिड अनुपात करने के लिए एक उच्च प्रोटीन संक्रमित RBCs में उम्मीद के रूप में लिपिड बैंड द्वारा संकेत के रूप में २९१३, २८७९ और १३९७ सेमी-1 और १६३१ और १५५५ सेमी-1 से मैं और बीच में द्वितीय यसमा१२,१३

अलग बैंड स्पष्ट रूप से पता चलता है कि संकेतों को सच जैविक बजाय गैर के नकली बैंड जैसे जल वाष्प है, जो संकीर्ण और तीव्र बैंड के रूप में मौजूद के रूप में जैव मूल बैंड हैं । विशेष रूप से, डीएनए बैंड, 1 तालिकाकी उपस्थिति, सीधे परजीवी11,12,13के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । सामांय में, प्रतीपगमन वेक्टर पीसीए में लोड करने के लिए एक समान तरीके से व्याख्या की जा सकती है । बैंड अच्छी तरह से बैंड और मूल स्पेक्ट्रा की पाली के साथ सहसंबंधी होना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1: PLS-R प्रतीपगमन प्लॉट, (a), RBCs का 0 – 1% parasitemia और संबंधित प्रतीपगमन गुणांक के बीच नुकीला, (b)। प्रतीपगमन प्लॉट प्रत्येक नमूने में parasitemia, x-अक्ष पर ज्ञात parasitemia और y-अक्ष पर अनुमानित parasitemia के साथ भविष्यवाणी करने के लिए मॉडल की क्षमता को प्रदर्शित करता है । प्रतीपगमन गुणांक मॉडल के पूर्वानुमान क्षमता के लिए प्रत्येक बैंड के योगदान का वर्णन करता है, और अधिक तीव्र बैंड है और यह मॉडल के लिए योगदान देता है और इस तरह कैसे परजीवी रक्त की रासायनिक संरचना बदल । reproduced और मार्टिन, एम. एट अल से संशोधित । 10 रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रतीपगमन गुणांक बैंड (cm-1) Assignment25-27
२९२९ νaCH2 से लिपिड, परजीवी
२९१३ लिपिड से νaCH2, लाल रक्त कोशिका
२८७९ लिपिड से νsCH3, लाल रक्त कोशिका
२८६१ νsCH2 से लिपिड, परजीवी
१७०७ B-dna/A-डीएनए बेस जोड़ी कंपन νC = O और νC = N, परजीवी
१६५२ मैं α से छुटकारे-कुंडलित प्रोटीन, परजीवी
१६३१ मैं β-pleated शीट प्रोटीन, लाल रक्त कोशिका से छुटकारे
१५८४ νC = N न्यूक्लिक अम्ल, परजीवी में imidazoles से
१५५५ प्रोटीन, लाल रक्त कोशिका से द्वितीय के बीच
१५३० द्वितीय, परजीवी के बीच
१४२३ B-डीएनए Deoxyribose, परजीवी
१३९७ ν (सीओओ-) लिपिड, लाल रक्त कोशिका से
१२२६ νaPO4-से बी-डीएनए, परजीवी
११८४ B-डीएनए Deoxyribose, परजीवी
१०८३ νaPO4-डीएनए से, परजीवी
१०४२ νC = आरएनए ribose से हे, परजीवी

तालिका 1: प्रतीपगमन गुणांक बैंड की PLS-R पर स्पेक्ट्रा मलेरिया नुकीला RBCs के असाइनमेंट। PLSR में, parasitemia मान किसी स्पेक्ट्रम के साथ संबद्ध प्रतीपगमन वेक्टर द्वारा reprocessed स्पेक्ट्रम गुणा करके परिकलित है । इसलिए, प्रतिगमन वेक्टर महत्व और हीनता में IR बैंड की दिशा को दर्शाया गया है । स्पेक्ट्रा दूसरा व्युत्पंन का उपयोग कर रहे थे, क्योंकि सकारात्मक बैंड एक कम parasitemia के साथ जुड़े होते हैं, जबकि नकारात्मक बैंड एक उच्च parasitemia के साथ जुड़े रहे हैं । reproduced और मार्टिन, एम. एट अल से संशोधित । 10 रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ ।

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Discussion

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PLS-R मॉडल एक निगरानी बहुभिंनरूपी विधि है कि एक रैखिक संबंध पाता है, y = bX + ई, के बीच पूर्वानुमान चर X (यहां, प्रत्येक wavenumber पर अवशोषक) और एक सतत चर y (यहां, parasitemia स्तर) । संक्षेप में, मॉडल एक्स में चर को जोड़ती है अव्यक्त चर (LVs) का एक नया सेट है कि y के साथ संबद्ध एक्स पर कब्जा प्रसरण, और एक प्रतीपगमन सदिश की गणना करता है (b) कि y मान का आकलन में एक नया स्पेक्ट्रम परिणामों से गुणा । मॉडल की ताकत दो मूल्यों से लिया जा सकता है: आर2 मान और जड़ क्रॉस सत्यापन (RMSECV) मूल्य के वर्ग त्रुटि मतलब है । पूर्व मॉडल की रैखिकता का वर्णन करता है और इस तरह मजबूती (करीब 1 के लिए बेहतर है) और एक आर2 मूल्य से कम ०.८ के साथ मॉडलों के लिए डेटा outliers और शोर डेटा के लिए ध्यान से समीक्षा की जानी चाहिए । RMSECV मान उस त्रुटि का वर्णन करता है जिसमें पूर्वानुमान किया जा सकता है । यह हमेशा के लिए प्रयास करें और outliers को बाहर करने के लिए सुनिश्चित करके जितना संभव हो के रूप में इस संख्या को कम करने के लिए सबसे अच्छा है, ध्यान से डेटा का इलाज और सुनिश्चित करें कि वहां के रूप में कई जैविक प्रतिकृति के रूप में संभव है बना ।

यह इस प्रकार है कि अच्छी गुणवत्ता के डेटा मॉडल के निर्माण के लिए अधिग्रहण कर रहे है जरूरी है । कमजोर पड़ने श्रृंखला की तैयारी महत्वपूर्ण है; विशेष रूप से सुनिश्चित करें कि प्रत्येक आरबीसी नमूना के रूप में संभव के रूप में समरूप है बना रही है । पिपेट का उपयोग करके आकर्षित करने के लिए और RBCs को बाहर निकालने के लिए कुछ समय जबकि घूमता या धीरे microcentrifuge ट्यूब के अंत को झाड़ने 5 – 10 बार, विसंगतियों से बचना होगा । एक ऐसी ही नस में, यह भी एक संक्रमण को रोकने के लिए नमूने के बीच क्रिस्टल साफ महत्वपूर्ण है । अल्ट्रा शुद्ध पानी और एक प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछे का उपयोग करने के लिए क्रिस्टल साफ और जांच है कि आधार रेखा फ्लैट है कि वहां कोई अवशेषों कि अगले नमूना माप दूषित हो जाएगा रहे है सुनिश्चित करता है ।

फ़ील्ड में लागू होने वाले किसी मॉडल के लिए आवश्यक जैविक नमूनों की संख्या, प्रति शर्त ंयूनतम 30 है जो समान संख्या के डेटा सेट के साथ मांय है । यह काफी मात्रा में एक महत्वपूर्ण राशि लेने के लिए उत्पंन होता है और इस प्रकार इस तकनीक की सीमा है । हालांकि, के रूप में अधिक नमूने सही ढंग से विश्लेषण कर रहे है वे पूर्वानुमान मॉडल में जोड़ा जा सकता है और इसे मजबूत । इस प्रकार, एक बार स्थापित, मॉडल और अधिक सटीक हो सकता है और इसे स्थापित करने के लिए आवश्यक प्रयास का औचित्य साबित कर सकते हैं ।

पर्यावरण पर निर्भर करता है और जो उपकरण पर माप लिया जाता है, कई आगे मुद्दों पैदा कर सकते हैं । यदि beamline पूरी तरह से साधन में संलग्न नहीं है, तो अर्थ या तो जोड़ों वाटरप्रूफ नहीं हैं या एटीआर विंडो अन्य नमूना डिब्बों के साथ विनिमेय है, इथेनॉल और पानी भाप स्पेक्ट्रा को दूषित कर सकते हैं. इथेनॉल के आसपास एक मजबूत तेज बैंड के रूप में प्रकट होता है 1070/ इस इथेनॉल से मुक्त एक अंतरिक्ष में मापने से बचा जा सकता है और साधन का शुद्धीकरण केवल एक बार सभी माप लिया जाता है । जल वाष्प वायुमंडल में परिवर्तन के कारण होता है और लगभग 1400-1800/cm और 3200 – 3600/सेमी के आसपास छोटे तेज सकारात्मक और नकारात्मक चोटियों के रूप में प्रकट होता है । यह पृष्ठभूमि माप की आवृत्ति को बढ़ाने और नाइट्रोजन के साथ साधन को मिटाने के द्वारा हल किया जा सकता है । मामलों में जहां पर्जन अनुपलब्ध है और जल वाष्प अभी भी काफी मजबूत है, चिकनी एल्गोरिदम और पानी वाष्प मुआवजा उन्हें हटाने के लिए डेटा पूर्व प्रसंस्करण के लिए जोड़ा जा सकता है ।

इस तकनीक भविष्य निदान और रोगी परिणामों के लिए वादा की एक बहुत रखती है । सबसे पहले, विधि कुल मिलाकर बहुत है कि नमूना की जरूरत है केवल एटीआर क्रिस्टल पर pipetted और फिर इसे सीधे मापा जा सकता है और मॉडल में इनपुट उपयोगकर्ता त्रुटि के लिए क्षमता को कम करने में लागू करने के लिए सरल है । यह अत्यधिक कुशल प्रकाश माइक्रोस्कोपी, जो वर्तमान में अफ्रीका के कुछ क्षेत्रों में2कमी कर रहे है के लिए की जरूरत को समाप्त होगा । सादगी के कारण, महंगे रिएजेंट और उपकरणों की जरूरत भी खत्म हो जाता है और इस तरह निदान लगभग लागत मुक्त रोगियों के लिए है, जो पीसीआर के लिए प्रमुख सीमा है । इस संयोजन बहुत जल्दी निदान के लिए में आने वाले रोगियों की उच्च संख्या के लिए नेतृत्व और इस तरह रोगी परिणामों में सुधार होगा । तकनीक अत्यंत उच्च संवेदनशीलता है कि RDTs के कम संवेदनशीलता पर काबू पाने के लिए क्षमता है और स्पर्शोन्मुख वाहक जल्दी पता लगाने में सक्षम होगा और इस तरह एक स्क्रीनिंग तकनीक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, तकनीक के लिए अंय रोगों, रक्त जनित या अंयथा, जहां कुछ microliters या माइक्रोग्राम क्रिस्टल के लिए लागू किया जा सकता है के लिए इस्तेमाल किया जा क्षमता है ।

हालांकि, उदाहरण के मॉडल में वहां कई चीजें है जो पहले इसे क्षेत्र में लागू किया जा सकता है संबोधित किया जाना चाहिए रहे हैं । पार सत्यापन जैविक प्रतिकृति की कम संख्या के कारण एक है और वह आदर्श नहीं है; बल्कि एक अलग सत्यापन के लिए मॉडल के बजाय परीक्षण सेट होने ज्यादा बेहतर है । इसके अलावा, RMSECV काफी उच्च यहां ठहराव के निचले स्तर अविश्वसनीय बना रही है । दोहराने की संख्या में वृद्धि इस मूल्य में सुधार होगा और क्षेत्र में इस पद्धति को रोजगार से पहले किया जाना चाहिए । यह प्रयोगशाला परीक्षण9, जहां RMSECV बड़ा नमूना आकार की वजह से बहुत कम था में पुष्टि है । इस के अलावा, अंतराल रेंज और अंक में वृद्धि भी इस मूल्य में सुधार के रूप में अच्छी तरह से होगा । आगे नैदानिक क्षमता में सुधार करने के लिए, पी फाल्सीपेरम के जंगली उपभेदों इस्तेमाल किया जाना चाहिए, के रूप में 3D7 पी फाल्सीपेरम एक प्रयोगशाला तनाव है और एक अलग रासायनिक phenotype में बदलाव के कारण संरचना मौजूद हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को वित्त पोषण ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (फ्यूचर फैलोशिप FT120100926 to BRW), ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (प्रोग्राम अनुदान और JGB को वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप द्वारा प्रदान किया गया था; अर्ली करियर फैलोशिप JSR; अनुसंधान संस्थानों के लिए बुनियादी ढांचा सहायता योजना Burnet संस्थान को अनुदान), और विक्टोरियन राज्य सरकार Burnet संस्थान को बुनियादी ढांचा सहायता अनुदान । हम वाद्य समर्थन के लिए श्री फिनले टांगें स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Donor blood - - Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood Australian Red Cross` -
3D7 Plasmodium falciparum The Burnet Institute - Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich R6504
Albumax (Gibco) Thermofisher E003000PJ Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Giemsa Stain Sigma Aldrich 48900
Sorbitol Sigma Aldrich S1876 Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers) Becton, Dickonson and Company 367671
Immersion Oil Thermofisher M3004
50 mL culture dishes Falcon 353025
25mL pipette tips Falcon 357515
10mL pipette tips Falcon 357530
Microscope Slides Sigma Aldrich S8902
Centrifuge tubes 50 mL Sigma Aldrich T2318
Automated pipette controller Integra-biosciences 155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge Thermofisher 75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators Thermofisher 310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope Nikon Instruments E100_2CE-MRTK-1 When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment Bruker 9308-3700 Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab Mathworks Inc Multivariate data analysis software
The Unscrambler X CAMO Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox Mathworks, Inc. GUI for Matlab

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References

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Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).More

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).

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