Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Identifiering och kvantifiering av Plasmodiumfalciparum i vattenlösning röda blodkroppar av försvagade Total reflektion infraröd spektroskopi och multivariat dataanalys

doi: 10.3791/56797 Published: November 2, 2018

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för påvisande och kvantifiering av Plasmodiumfalciparum i infekterade aqueous röda blodkroppar med hjälp av ett försvagat total reflektion IR spektrometer och multivariat dataanalys.

Abstract

Vi visar en metod för kvantifiering och upptäckt av parasiter i vattenlösning röda blodkroppar (RBC) med hjälp av en enkel bänkmonterade försvagade Total reflektion Fourier Transform infraröd (ATR-FTIR) spektrometer tillsammans med multivariat dataanalys ( MVDA). 3D 7 P. falciparum odlade till 10% parasitemia ringen scenen parasiter och användes att spika frisk donator isolerade röda blodkropparna för att skapa en utspädning serie mellan 0 – 1%. 10 µL av varje prov placerades på mitten av fönstret ATR diamond att förvärva spektrumet. Exempeldata behandlades att förbättra signal-brusförhållande och ta bort bidraget av vatten, och sedan andraderivatan tillämpades lös spektrala funktioner. Data analyserades sedan med hjälp av två typer av MVDA: första Principal komponent analys (PCA) att fastställa eventuella extremvärden och sedan delvis minstakvadratmetoden Regression (PLS-R) att bygga en kvantifiering modell.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Malaria är bland de mest förödande sjukdomarna i vår tid; över hälften av befolkningen lever i riskzonen i endemiska områden och det bördor oproportionerligt dåliga1,2,3,4. En stor del av problemet är asymtomatiska bärare och tidiga skede patienter som fungerar som reservoarer för mygga vektorer5, orsaka spikar av infektion under våta säsonger och gör det möjligt att kvarstå i samhällen. Malaria orsakas av fem Plasmodium parasiter, den mest dödliga som är P. falciparum som orsakar den svåraste formen av sjukdomen2.

Tekniker för diagnos av malaria närvarande mindre än perfekt. Optisk mikroskopi, nuvarande guldmyntfoten, kan endast upptäcka 62-88 parasiter/µL beroende på metod som används för6. Dessutom tack vare riskkällan och hög kompetens krävs, i många regioner mikroskopi feldiagnoser > 50% av fallen, särskilt de med låga parasitaemia nivåer2, som direkt kan hänföras till bristen på resurser i området och resultaten i missbruk av läkemedel mot malaria. De andra 2 viktigaste diagnostiska metoderna är snabba diagnostiska tester (RDTs), som använder antikroppar för påvisande och Polymerase Chain Reaction (PCR)-analyser, som diskriminerar och kvantifiera parasiter från DNA. RDTs för närvarande endast kunna upptäcka P. falciparum och P. vivax av minst 100 parasiter/µL blod vilket resulterar i ovanligare former av sjukdomen är obehandlade. 7 , 8 däremot PCR assays diskriminera och kvantifiera olika arter av Plasmodium på en känslighet på 0,0004-5 parasiter/µL blod. Dock kräver dyra reagenser, utrustning och tekniska skicklighet, och därmed är inte lämplig för programmet fältet.

En mycket känslig, pålitlig och prisvärd teknik är nödvändigt att förbättra diagnos gånger, och därmed förbättra behandlingsresultaten och gör sjukdomen avskaffande möjligt. Försvagade Total reflektion Fourier transform (ATR-FTIR) spektroskopi erbjuder en möjlig lösning på problemet. Tidigare arbete har visat att det var möjligt att upptäcka och kvantifiera P. falciparum i metanol fast blod filmer att nå detektionsgränser < 1 parasit/µL blod (< 0,0002% parasitemia)9, som är jämförbar med PCR-metoder. Nyligen genomförda studier har visat att det är möjligt att upptäcka och kvantifiera parasiter i vattenlösning prover och därmed eliminera det fixering steget. Faktorer såsom vattenånga, spektrala buller och data behandling måste dock beaktas för optimalt resultat10.

Detta protokoll syftar till hur nya användare kan förvärva ATR-FTIR spectra och förbereda en regressionsmodell för detektion av P. falciparum från aqueous röda blodkroppar (RBC) prover10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vänligen konsultera lämpligt Material säkerhetsdatablad (MSDS) och söka lämplig biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) utbildning. Alla culturing åtgärder måste göras i ett BSL-2 skåp med aseptisk teknik, vilket innebär att det finns en risk för exponering för skadlig UV-strålning från sanering steg, nålsticksskador, och potentiella biologiska exponering och infektion om parasiten kulturen kommer in några skador. Dessutom är lager blod från blodbanker är bara screenas för vissa sjukdomar och risken för spridning av blodburna sjukdomar en potentiell risk. Söka omedelbar medicinsk hjälp i förekomsten av skada.

1. beredning och mätning av 3D 7 Plasmodiumfalciparum parasiten spädningsserien

Obs: Plasmodium sp. kultur är mycket känsliga. Använd färska/unexpired reagenser och foder parasiterna regelbundet genom att ändra media. Foder kulturer under 5% parasitemia varannan dag; foder kulturer mellan 6-10% parasitemia en eller två gånger om dagen; och foder kulturer mellan 11 – 20% upp till 4 gånger per dag. Parasiter som börjar svälta kommer att förlora sin form och börja kontrakt. I ett sådant fall, foder och späd omedelbart genom att ändra media och lägga till lager röda blodkropparna. samla givare blodet i blod insamling rör som innehåller heparin som antikoagulans och åtgärd inom de första 6 h.

  1. Kultur sammanlagt 30 mL av 3D 7 stam Plasmodiumfalciparum parasiter enligt standardprotokollet tills parasitemia når 10% ringar.
  2. Synkronisering av parasiter
    1. 11 h efter shizogeny i parasit livscykeln, resuspendera kultur och överföring till en 50 mL konisk tub med hjälp av en automatiserad pipett.
    2. Centrifugera kulturen på 300 – 400 x g och standard laboratorieförhållanden (25° C och 100 kPa) för 5 min.
    3. Ta bort supernatanten genom utarbetandet av det med en pipett eller använda en Pasteur-pipett som bifogas ett vakuum utan att störa pelleten. Kassera avfall media till en 10% blekmedel lösning.
    4. Långsamt lägga till 12 – 15 mL 4% sorbitol lösning i pelleten med hjälp av en automatiserad pipett och blanda kulturen genom tak och vända tuben tills kulturen är homogen.
    5. Inkubera kulturen vid 37 ° C i 15 min.
    6. Centrifugera kulturen på 300 – 400 x g och standard laboratoriemiljö för 5 min.
    7. Ta bort supernatanten som beskrivs i steg 1.2.3.
    8. Lägga till 10 – 15 mL 0,9% koksaltlösning i pelleten och blanda lösningen genom tak och vända tuben tills kulturen är homogen.
    9. Upprepa de steg 1.2.6–1.2.8 två gånger mer att tvätta alla rester av sorbitol.
  3. Beredning av parasitemia spädningsserien
    1. Tvätta lager röda blodkropparna som i steg 1.2.6–1.2.9.
    2. Centrifugera kulturen på standard laboratoriemiljö, lager röda blodkroppar vid 300 – 400 x g i 5 min och Kassera supernatanten som i steg 1.2.3.
    3. Märka mikrocentrifugrör som 0%, 0,010%, 0,025%, 0,075%, 0,100%, 0,250%, 0,750% och 1.000%, och tillsätt 0 µL, 1 µL, 2,5 µL, 7,5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL och 100 µL av kultur respektive med 0,2-20 µL pipett.
    4. Lägga till 100 µL, 99 µL, 97,5 µL, 92,5 µL, 80 µL, 75 µL, 25 och 0 µL av lager röda blodkroppar i tuber märkta 0%, 0,010%, 0,025%, 0,075%, 0,100%, 0,250%, 0,750%, och 1.000%, respektive.
    5. Centrifugera frisk donator blodet samlas i blodförtunnande rör på 1,200 x g och standard laboratorieförhållanden i 10 min.
    6. Ta bort plasma genom upprättandet av det med en pipett och kasta som beskrivs i steg 1.2.3.
    7. Tillsätt 900 µL av isolerade röda blodkroppar i varje mikrocentrifug rör och blanda genom att vända 10 x.
  4. Spektral förvärv
    1. Med hjälp av medföljande spektrala förvärv-programmet, klicka på ”instrumentet Set-Up” och ange parametrarna data insamling av följande: 128 skanningar för bakgrund; 32 skanningar för prov; och upplösning till 8 cm över högsta prov intervallet av instrumentet.
    2. Ställa in temperaturen av ATR-FTIR spektrometern per tillverkarens rekommendation eller över natten.
    3. Rengöra kristallen försiktigt skrubba i en cirkulär rörelse med ludd gratis våtservetter fuktad med ultrarent vatten. Torka sedan med en annan ludd fri torka.
    4. Ta en bakgrund mätning av luften genom att klicka på ”bakgrunden mätning”. Varje 20 min, rena kristallen som i steg 1.4.3 och upprepa denna mätning.
    5. Öppna live-vyn genom att klicka på ”Förhandsgranska”. Följa en plan, horisontell baslinje som indikerar att kristallen är ren.
    6. Pipettera 10 µL avjoniserat vatten direkt på mitten av kristallen och klicka på ”åtgärd prov”. Upprepa detta vatten mätningen efter varje femte prov.
    7. Torka kristallen en ludd fri torka med en mjuk cirkelrörelse.
    8. Pipettera 10 µL prov och klicka på ”åtgärd prov”.
    9. Ren kristallen mellan prover som i steg 1.4.3.
    10. Upprepa tills 3 replikat förvärvas, se till att Slumpa ordning både proven och replikerar.

2. multivariat dataanalys (MVDA)

Obs: Data behandling måste göras över hela datamängden för att undvika buller och tillägg av topparna av icke-biologiskt ursprung. Däremot analysera över biologiskt relevanta regioner: 2980-2800/cm och 1750-850/cm.

  1. Data behandling
    Obs: Två programvara, exempelvis Matlab (hädanefter benämnd programvara 1) och The elevator X (hädanefter benämnd programvara 2) används som exempel för MVDA. Programvaran 1 har förmågan att utföra MVDA utan tillsats av ett grafiskt användargränssnitt (GUI). Dock är det rekommenderat att köpa ett GUI (Tabell för material). Följande instruktioner när hänvisning till programvara 1 kommer att anta som är tillsammans med kommersiellt tillgängliga GUI verktygslådan och exempelskriptet data behandling har kopplats.
    1. Öppna programvaran för lämpliga multivariat data-analys, klicka på ”Importera Data” och välj typ av fil för analys.
      1. I programvara 1, ingång ”analys” i kommandofönstret att öppna GUI. Högerklicka på rutan X för att hitta ”importera Data”.
      2. Programvaran 2, klicka på fliken ”fil” för att hitta ”Import”.
    2. Importera exempel-, vatten- och baseline spectra som datauppsättningar till arbetsytan genom att välja alla spectra i varje set separat och klicka på ”öppna” och ge varje set ett kort namn, t.ex., 'wat' för datamängd av vatten spektra.
    3. Välj ny tabell/matris genom att klicka på ”ny matris/vektor” och generera en n × 1 vektor, där n är antalet prover. Mata in parasitemia av varje prov och ge vektorn namnet 'Parasitemia'.
      1. Programvaran 1, klicka på ”ny variabel” i kommandofönstret.
      2. Programvara 2, klicka på ikonen ”nya Matrix”.
    4. Plotta data genom att klicka på ”Rita Data ikonen”. Inspektera spektra för vattenånga effekter genom att klicka på ”Zoom” och zooma in på 1800-1400 cm; tydligast observeras som kort, skarp, smala toppar längs sluttningarna av amiden jag och amide II band.
    5. I fall av extrema vattenånga, öppna fliken Redigera/pre-process data och välj ”utjämning”. Minska det buller och/eller stark vattenånga bidrag genom utjämning prov och vatten spektra med upp till 25 poäng av utjämning eller använda en metod för korrigering av vattenånga.
    6. Rätta icke-horisontella originalplan genom att använda baseline correction algoritmen förekommande under fliken samma redigera/pre-process data i steg 2.1.4.
    7. Genomsnittlig vatten spectra och kopiera rader till en n × m matris motsvarar prov datamängden och reducera det till 70% intensitet genom multiplikation med 0,7.
      1. I programvara 1, göra det i kommandofönstret genom att mata in följande skript ”AverageWater=mean(WaterDataset)”. Sedan kopiera och klistra in rader för att matcha prov datauppsättningen. För att minska intensiteten, mata in ”AverageWater70 = AverageWater * 0,70”.
    8. Subtrahera genomsnittliga vatten spectra från varje prov spektrum.
      1. I programvara 1, göra det i kommandofönstret genom att mata in följande skript ”WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70”.
    9. Öppna fliken Redigera/pre-process data för att tillämpa en andra derivat funktion, och sedan normalisera data genom att välja enda normala variate (SNV) funktion och menar center data.
      1. I programvara 1, göra det på en gång. Välj först ”derivat”, och ingång 25 poäng av utjämning, polynom av 3 och härledda orderraden på prov med 25 poäng av utjämning och en Savitzky-Golay funktion. Välj sedan ”SNV” och ”menar Center”. Klicka på ”okej/tillämpas”.
    10. Öppna fliken Redigera/pre-process data och i ”kolumn Variabler”, Välj 2,980 – 2.800/cm och 1 750 – 850 cm genom att se till endast deras boxar är förkryssade.
  2. Analys av data
    1. Principal Komponentanalys (PCA)
      1. Klicka på ”analys | Nedbrytning ”och välj PCA.
        1. Programvaran 1, klicka på ”bygga modell”.
        2. Programvara 2, indata-PCA metoderna. Mata in det optimala antalet rektor komponenter (PCs) - i detta arbete, 7 - och högst 100 iterationer och välj cross-validering för Valideringsmetoden. Klicka på ”Kör”.
      2. Observera den 95% konfidensintervall, streckad ringen, på noter tomten mellan PC1 och PC2.
      3. Märk provet spektra med noter som sker utanför gränsen som potentiella extremvärden verktyget ”Välj Spectra”.
      4. Om de markerade spectrana har hög utesluta Hotellings T2 -värden och hög Q residualer dem från ytterligare analys.
    2. Partiell minstakvadratmetoden Regression (PLS-R)
      1. Klicka på ”analys | Regression ”och välj” PLS-R ”.
        1. Programvaran 1, höger klicka på Y-block och välj vektorn ”Parasitemia | Bygga modell ”.
        2. I programvara 2, ingång PLS-R metoderna. Välj vektorn ”Parasitemia” som referensen ”Y” och provet datamängden som ”X Data Set” och välj cross-validering som Valideringsmetoden. Klicka på ”Kör”.
      2. Analysera regressionsmodellen. R2 värden över 0,80 och kvadratiska medelvärdet fel av cross-validering (RMSECV) värden som är mindre än 0,1% parasitemia är acceptabla modeller.
      3. Analysera regression vektorn och identifiera de biologiska banden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Partiell minsta kvadratmetoden (PLS-R) tomt och dess associerade regression vektor, figur 1a och 1b respektive visar att signalen från parasiter skiljer sig nog från de röda blodkropparna som de kan användas för att bilda en linjär regression modell som ska användas för den Prediktion av parasiter i framtida datamängder.

En robust, linjär PLS-R modell genererades med ett R-kvadratvärde på 0,87 och en root mean squared cross verifieringsfel (RMSECV) av 0,13% parasitemia, figur 1a. Ökande parasitemia nivåer är primärt associerade med nukleinsyra band, särskilt 1042, 1083 och 1226/cm, som tilldelas till ν(C=O) från den RNA-ribos grupp, νs(PO4 -) och νen(PO4 -) respektive och bilda den största negativa delen av regression vektorn. Detta beror på att röda blodkroppar saknar kärna och således nukleinsyror finns starka indikatorer för parasiter. Dessutom visar 1226 cm bandet att strukturen har en B-DNA bildar, som belyser vikten av att mäta i vattenlösning staten12. Däremot parasiter konsumera RBC komponenter, främst hemoglobin, och därmed ett högre protein-lipid förhållande väntas i icke-infekterade röda blodkroppar som anges av lipid band 2913, 2879 och 1397 cm-1 och 1631 och 1555 cm-1 från amiden I och amide II lägen12,13.

De distinkta band visar tydligt att signalerna är sant biologiska band i stället för att differentiering utifrån falska band av icke-biologiskt ursprung såsom vattenånga, som presenterar som smala och intensiva band. Särskilt kan närvaron av DNA band, tabell 1, direkt hänföras till parasiten11,12,13. I allmänhet kan regression vektorn tolkas på ett liknande sätt som belastningar i PCA. Band bör korrelerar väl med band och förändringar av de ursprungliga spektra.

Figure 1
Figur 1: PLS-R regression plot, a, av röda blodkroppar spetsade mellan 0 – 1% parasitemia och associerade regressionskoefficienten, (b). Regression tomten visar modellen förmåga att förutsäga parasitemia i varje prov, med den kända parasitemia på x-axeln och den förväntade parasitemia på y-axeln. Regressionskoefficienten beskriver bidraget från varje band prediktiv förmåga i modellen, ju mer intensiv bandet är desto mer bidrar det till modellen och därmed hur parasiten förändrar den kemiska sammansättningen av blod. Reproduceras och modifierad från Martin, M. et al. 10 med tillstånd från den Royal Society of Chemistry. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Regression koefficient Band (cm-1) Assignment25-27
2929 ΝaCH2 från lipider, parasit
2913 ΝaCH2 från lipider, röda blodkroppar
2879 ΝsCH3 från lipider, röda blodkroppar
2861 ΝsCH2 från lipider, parasit
1707 B-DNA/A-DNA baspar vibrationer νC = O & νC = N, parasit
1652 Amide jag från α-helix proteiner, parasit
1631 Amide jag från β-veckad plåt proteiner, röda blodkroppar
1584 ΝC = N från imidazoler i nukleinsyror, parasit
1555 Amide II från proteiner, röda blodkroppar
1530 Amide II, parasit
1423 B-DNA deoxiribos, parasit
1397 Ν(COO-) från lipider, röda blodkroppar
1226 ΝaPO4-från B-DNA, parasit
1184 B-DNA deoxiribos, parasit
1083 ΝaPO4-från DNA, parasit
1042 ΝC = O från RNA ribos, parasit

Tabell 1: uppdrag av regression koefficient band av PLS-R på spectra av malaria spetsade röda blodkroppar. I PLSR beräknas parasitemia värdet som associeras med ett spektrum som genom att multiplicera det förbehandlade spektrumet av regression vektorn. Därför skildrar regression vektorn vikten och riktning av IR banden i regressionen. Eftersom spectra var preprocessed använda andraderivatan, är negativa band associerade med en högre parasitemia medan positiva band är associerade med en låg parasitemia. Reproduceras och modifierad från Martin, M. et al. 10 med tillstånd från den Royal Society of Chemistry.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PLS-R-modellen är en övervakad multivariat metod som finner en linjär relation, Y = bX + E, mellan de prediktiva variablerna X (här, absorbansen vid varje Vågtal) och en kontinuerlig variabel Y (här, parasitemia nivån). Kort sagt, modellen kombinerar variabler i X för att skapa en ny uppsättning av latenta variabler (LVs) som fångar variansen på X korrelerade med Y, och beräknar en regression vektor (b) som multipliceras med en nya spektrum resultat vid uppskattning av y-värde. Styrkan i modellen kan tas från två värden: R2 värdet och värdet Root Mean Square Error av Cross validering (RMSECV). Tidigare beskriver Linjäriteten hos modellen och därmed robustheten (ju närmare det är att 1 bättre) och data för modeller med ett R2 -värde mindre än 0,8 måste granskas noga för extremvärden och bullriga data. RMSECV värdet beskriver felet där förutsägelse kan göras. Det är alltid bäst att försöka minimera antalet så mycket som möjligt genom att se till att utesluta extremvärden, noggrant behandla data och att se till att det finns så många biologiska replikat som möjligt.

Det är således viktigt att god kvalitetsdata förvärvas för att bygga modellen. Beredning av spädningsserien är kritisk; särskilt att se till att varje RBC prov är så homogen som möjligt. Genom att använda pipetten att utarbeta och mata ut de röda blodkropparna några gånger medan virvlande eller försiktigt snärta i slutet av mikrocentrifug röret 5 – 10 gånger, kommer inkonsekvenser att undvikas. På liknande sätt är det också viktigt att rengöra kristallen mellan varje prov att förhindra kontaminering. Med hjälp av ultrarent vatten och ludd gratis servetter rengör kristallen och kontrollera att baslinjen är platt säkerställer att det finns inga rester som kommer att förorena nästa prov mätning.

Antalet biologiska prover som krävs för en modell som är tillämpliga i fältet är minst 30 per tillstånd som valideras med en uppsättning data med ett liknande nummer. Denna betydande volym skulle ta ett betydande belopp att generera och således detta är begränsning av tekniken. Dock som mer prover analyseras korrekt de kan läggas till den förutsägande modellen och stärka den. Således, när upprättats modellen kan bli noggrannare och kan motivera den ansträngning som krävs för att ställa upp.

Beroende på miljön och instrumenteringen som mätningarna, kan flera ytterligare frågor uppstå. Om beamline inte är helt inbyggt i instrumentet, kan vilket innebär antingen lederna inte är lufttät eller fönstret ATR är utbytbara med andra prov fack, etanol och vattenånga förorena spektra. Etanol visas som en stark vassa band runt 1,070 cm 14. Detta kan undvikas genom att mäta i ett utrymme som är fri från etanol och desinficering instrumentet först när alla mätningar görs. Vattenånga är orsakade av förändringar i atmosfären och visas som små vassa positiva och negativa toppar runt 1400 – 1 800 /cm och 3 200 – 3 600 cm. Detta kan lösas genom att öka frekvensen av bakgrundsmätningarna och rensning av instrumentet med kväve. I fall där rensning är inte tillgänglig och vattenånga är fortfarande ganska stark, kan utjämning algoritmer och vattenånga ersättning läggas till före behandling att ta bort dem.

Denna teknik håller en hel del löfte för framtida diagnostik och behandlingsresultat. För det första är metoden övergripande mycket enkel att genomföra provet behöver endast vara pipetteras till ATR kristallen och sedan kan mätas direkt och matas in i modellen minskar risken för användarfel. Detta skulle eliminera behovet av högutbildade ljus botaniker, som för närvarande i vissa regioner i Afrika saknas2. På grund av enkelheten, elimineras också behovet av dyra reagenser och utrustning och därmed diagnostiken skulle vara praktiskt taget kostnadsfri för patienter, vilket är den största begränsningen för PCR. Denna kombination skulle leda till högre antalet patienter som kommer in för diagnos mycket tidigare och därmed förbättra behandlingsresultaten. Tekniken har potential för extremt höga känsligheter som skulle övervinna de låg känslighet för RDTs och skulle kunna upptäcka asymtomatiska bärare förr och därmed kan användas som en screening teknik. Tekniken har dessutom potential att användas för andra sjukdomar, blod borne eller annat, där några mikroliter eller mikrogram kan tillämpas till kristallen.

I exempel modellen finns det dock många saker som behöver åtgärdas innan det kan användas i fältet. Cross validering är en följd av det låga antalet biologiska replikat och det är inte perfekt; hellre ha en separat validering att testa modellen i stället är mycket bättre. RMSECV är dessutom ganska hög här gör de lägre nivåerna i kvantifiering otillförlitliga. Öka antalet replikat kommer att förbättra detta värde och måste göras innan sysselsätter denna metod i fältet. Detta styrks i laboratoriet prövningar9, där RMSECV var mycket lägre på grund av den större urvalsstorleken. Utöver detta förbättras öka intervall intervall och punkter också detta värde också. För att ytterligare förbättra den diagnostiska kapaciteten, vilda stammar av P. falciparum bör användas, som den 3D 7 P. falciparum är ett laboratorium stam och kan presentera en annan kemisk sammansättning på grund av variationer i fenotyp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Finansiering till författarna tillhandahölls av det australiska forskningsrådet (framtiden gemenskap FT120100926 till BRW), nationella hälso- och medicinsk forskning rådet i Australien (Program grant och Senior Research Fellowship till Anja; Tidig karriär stipendier JSR; Infrastruktur för forskning institut Support system bidrag till Burnet Institute), och den viktorianska statliga regeringen operativa infrastrukturen stöder bidrag till Burnet Institute. Vi erkänner Mr Finlay Shanks för instrumental stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Donor blood - - Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood Australian Red Cross` -
3D7 Plasmodium falciparum The Burnet Institute - Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich R6504
Albumax (Gibco) Thermofisher E003000PJ Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Giemsa Stain Sigma Aldrich 48900
Sorbitol Sigma Aldrich S1876 Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers) Becton, Dickonson and Company 367671
Immersion Oil Thermofisher M3004
50 mL culture dishes Falcon 353025
25mL pipette tips Falcon 357515
10mL pipette tips Falcon 357530
Microscope Slides Sigma Aldrich S8902
Centrifuge tubes 50 mL Sigma Aldrich T2318
Automated pipette controller Integra-biosciences 155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge Thermofisher 75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators Thermofisher 310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope Nikon Instruments E100_2CE-MRTK-1 When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment Bruker 9308-3700 Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab Mathworks Inc Multivariate data analysis software
The Unscrambler X CAMO Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox Mathworks, Inc. GUI for Matlab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Arnold. Great Britain. 361 (1998).
  2. World Health Organization. World Malaria Report 2016. (2016).
  3. Rogers, W. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. American Society for Microbioogy, USA. 1355 (1999).
  4. White, N. J. Chapter 9. Manson's Tropical Infectious Diseases. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).
  5. Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11, (6), 623-639 (2013).
  6. Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18, (9), 395-398 (2002).
  7. Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13, (1), 234-241 (2014).
  8. World Health Organisation. Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). (2014).
  9. Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
  10. Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142, (8), 1192-1199 (2017).
  11. Fabian, H., Mäntele, W. Handbook of Vibrational Spectroscopy. John Wiley & Sons, Ltd. (2006).
  12. Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39, (13), 5439-5448 (2011).
  13. Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
  14. Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48, (4), (1952).
Identifiering och kvantifiering av <em>Plasmodiumfalciparum</em> i vattenlösning röda blodkroppar av försvagade Total reflektion infraröd spektroskopi och multivariat dataanalys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).More

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter