Summary
通过对500只造血干细胞或祖细胞进行分析, 优化了标准的西方印迹协议。优化包括仔细处理细胞样本, 限制管道之间的传输, 并直接株溶藻 Laemmli 样本缓冲区中的细胞。
Abstract
造血干细胞 (HSCs) 是罕见的细胞, 与小鼠骨髓中仅含有2.5万表型的长期再生 HSCs。对 HSCs (500-1.5万细胞) 的小数目进行了优化, 并适合于对其进行分析。表型 HSCs 纯化, 准确计数, 直接裂解 Laemmli 样品缓冲。用月桂酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS 页) 分析了含有等量细胞的裂解物, 并根据标准的西方印迹协议制备并处理了该印迹。使用此协议, 可以对 2000-5000 HSCs 进行例行分析, 在某些情况下, 数据可以从很少500个单元中获得, 而大多数出版物中报告的2万到4万个单元格。本议定书应普遍适用于其他造血细胞, 并能通过标准实验室程序对少量细胞进行常规分析。
Introduction
造血干细胞 (HSCs) 是自我更新的细胞, 可以引起所有的血血统。它们是骨髓中相对稀少的细胞, 使得生物化学分析变得困难。适合于分析稀有细胞的方法, 如流式细胞术, 对于定量测定细胞表面标记物和胞内蛋白的相对数量非常有用。然而, 细胞内蛋白的分析需要使用细胞通透程序来实现抗体的存取, 而不是所有细胞表面的表位都能存活这些程序1,2。此外, 在不同的蛋白质亚型或裂解产物之间鉴别的抗体通常不能用于流式细胞术, 因此调查人员仍然依靠西方的印迹进行某些类型的分析。
裂解物细胞的印迹分析是大多数实验室的常规程序。细胞可以在保存细胞表面分子表位的本地条件下纯化, 细胞裂解物随后可以被制备和分析。然而, 用西方印迹对稀有的原代细胞种群中的蛋白质进行分析, 可以要求 euthanizing 大量的动物获得足够的细胞。通过对几个步骤进行小的调整, 传统的西方印迹协议能够检测出相对较小数量的 HSCs (500-1.5万, 取决于感兴趣的蛋白质) 的蛋白质。这些调整包括准确计数细胞, 仔细处理细胞颗粒, 减少细胞间的转移, 以最小化细胞损失, 并株溶藻一个定义数量的细胞与集中加载缓冲包含蛋白酶体和磷酸酶抑制剂。许多发表的报告包括西部污点获得与2万或更多 HSCs3,4,5,6,7;这个简单的程序将减少在4到40倍之间产生等效数据所需的细胞和实验动物的数量。该协议旨在以每个单元为基础对结果进行规范化, 而不是内部控制。这使得检测蛋白质水平的全面降低, 如果数据被规范化到内部控制, 可以忽略。本文描述了在细胞基础上规范化的重要性, 用于分析基因表达数据8, 同样的原理也适用于用西方印迹来定量蛋白质。此优化的协议对于需要分析少量单元格的任何人都是有用的。
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Protocol
所有程序必须按照机构动物使用和护理指南执行。该程序是为分析小鼠造血干细胞和祖细胞 (HSCs 和高压), 但可以适应其他细胞群体的分析而制定的。
1. 流式细胞仪分离小鼠 HSCs 和高压的研究
- 收获小鼠骨髓细胞如描述在文献6。
注: 在图 1和图 2所示的数据中, 骨髓是从 C57BL/6J 小鼠身上采集的。 - 按照制造商的说明, 使用鼠标沿袭损耗套件执行骨髓细胞的血统耗尽。
- 用抗体对细胞表面的标记进行孵化, 如7所述。在图 1和图 2所示的实验中, 使用了对 Sca-1、试剂盒、Flt3 和沿袭 (林) 标记 Mac1、Gr1、CD3e、B220 和 Ter119 的抗体。
- 排序 2000-2万林 Sca1+Flt3 细胞 (HSCs ) 或林-Sca1 试剂盒+细胞(hp) 1.5 毫升离心管含有0.1 毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 与2% 胎牛血清。
注意: 对于图 1和图 2所示的数据, 细胞使用了一个带有70µM 喷嘴的流式分析仪进行排序。最大采集量为1.4 毫升。
2. 样品准备
注意: 此步骤非常关键。仔细处理样品。清除上清液时, 要小心不要扰乱细胞颗粒。
- 离心机的1.5 毫升管包含排序的细胞在摆动斗转子在4°c, 500 x g, 5 分钟. 用吸管和100µL 吸管提示从细胞颗粒中取出所有但大约20µL。不要扰乱球团。
- 如果样品包含少于5000个细胞, 并且被排序的样品的总容量少于0.2 毫升, 转移细胞首先到低捆绑0.2 毫升 PCR 管在离心之前。
- 如果样品包含少于5000个细胞和容量是超过0.2 毫升, 用离心机在4°c, 500 x g, 为5分钟旋转细胞下来, 并且去除所有, 但200µL 的上清。再将剩余的200µL 中的颗粒细胞重新悬浮, 然后将细胞转移到0.2 毫升的 PCR 管中, 再次旋转。在第二次旋转后从颗粒中除去 20-30 µL, 然后重新悬浮细胞。
- 并用重悬在试管中左上清的细胞。如有必要, 添加额外的 PBS 在2% 的血清/pbs (你也可以使用2% 牛血清白蛋白 (BSA)/pbs, 或 pbs 单独) 获得浓度 5 x104至 5 x 10 细胞/毫升。
注: 使用细胞计数法收集, 以估计用于悬浮细胞的体积。 - 使用 2-5 µL 的重新悬浮细胞, 以确定准确的细胞浓度使用自动单元计数器 (按照制造商的指示) 或 hemocytometer9。
- 将含有所需细胞数的重悬浮细胞转移到新的1.5 毫升管中。在图 1, 2000, 1000, 或 500 HSCs 或高压的实验被转移了。所需的细胞数取决于由西方印迹获得的信号的强度, 并根据经验确定。使用20µL 或100µL 离心吸管提示进行转移。
- 离心机在摆动斗转子中的细胞在4°c, 500 x g, 5 分钟。
- 根据制造商的指示, 生成100x 库存解决方案, 在亚砜中溶解蛋白酶体和磷酸酶抑制剂。
- 通过稀释制造商提供的相当于蒸馏水的 4x Laemmli 样品缓冲器, 准备 2x Laemmli 样品缓冲器。添加适量的100x 股蛋白酶体和磷酸酶抑制剂, 以获得最终浓度2x 抑制剂在 2x Laemmli 样本缓冲区。
注: 2x Laemmli 样本缓冲区可以提前进行, 但蛋白酶体和磷酸酶抑制剂应立即添加, 然后添加 2x Laemmli 样本缓冲区 (加上抑制剂) 的细胞颗粒溶解细胞, 如以下步骤所述。 - 小心地从细胞颗粒中取出部分清液, 并将其与试管中剩余的上清液结合在一起, 添加等量的 2x Laemmli 样品缓冲器加上蛋白酶体和磷酸酶抑制剂以达到500的最终浓度。单元格/µL 在 1x Laemmli 示例缓冲区中。
注意: 例如, 如果您在步骤2.5 中将2000个单元的总体积20µL 转移到一个管, 则在离心单元格 (步骤 2.6) 后, 应从颗粒中移除上清的18µL, 并将剩余的上清的2个µL 添加相等容积 (2 µL) 2x Laemmli 样品缓冲器, 以达到500细胞/µL 在 1x Laemmli 样品缓冲器中的最终浓度。 - 并用重悬颗粒以尽快生成裂解液。在这一点上, 样品可以立即电泳通过 SDS 页凝胶, 或可在液体 N2冻结, 并存储在-80 °c, 以供将来使用。
3. 电泳
- 将裂解物在95摄氏度或沸水中加热5分钟。
- Electrophorese 1-40 µL 的裂解物 (包含从500高达2万细胞当量) 通过 SDS 页凝胶在100V 使用标准协议10。
注: 在凝胶中装入的裂解液体积是由产生理想信号所需的细胞数决定的, 并取决于感兴趣的蛋白质的丰度和抗体的质量。图 1中的数据获得了2000、1000和500个细胞当量的裂解物。井的宽度应该在3毫米到1.5 毫米的范围内. 1.5 毫米的牙齿可以用剪刀从商业可用的梳子上剪下来。
4. 转移和阻止
注: 执行11标准协议后的西方污点。下面简要介绍了这些步骤:
- 预处理氟 (PVDF) 膜与甲醇十年代, 然后简要地洗涤膜与蒸馏水。
- 按照转移器具制造商提供的说明书中的说明, 将蛋白质从 SDS 页凝胶转移到膜上。
- 转移后, 2 毫升5% 牛血清白蛋白 (BSA) 在 PBST (PBS 与0.1% 补体) 一夜间在4摄氏度以下标准协议11。
5. 抗体标记
- 使用供应商推荐的抗体稀释, 在4摄氏度的情况下, 用抗体在一夜床上孵育细胞膜。
注: 在材料表中, 我们对 HSCs 和高压的抗体以及相应的抗体稀释进行了验证。使用标准程序执行抗体标记8。
6. 检测
- 清洗膜3次, 每 PBST 5 分钟室温下清洗。
- 室温下用2毫升增强化学发光缓冲剂孵化膜1分钟。根据制造商的说明或显影胶片和胶片处理器, 使用成像系统检测信号。
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Representative Results
500-2000 纯化 HSCs 和高压钠灯的代表性结果如图 1和图 2所示。图 1中的β肌动蛋白信号可以从从一只老鼠的骨髓中纯化出来的 500 HSCs 和高压钠灯中检测出来。请注意, 将裂解物装入1.5 毫米井, 产生了比加载到3.0 毫米井更强的500高压信号。图 2是 EIF4G 的西方印迹和 Rps6 (p-Rps6) 的磷酸化, 两者都参与了蛋白质的翻译12, 在 HSCs, 并在与不刺激干细胞因子 (超临界) 的体外。
图 1: 从小鼠 HSCs 和裂解物中进行的β肌动蛋白的印迹. HSCs 被分类从血统被耗尽的小鼠骨髓细胞作为林-Sca1+试剂盒+ Flt3 细胞, 和高压Sca1 试剂盒+。裂解物从不同数量的细胞制备的电泳通过12% 的 SDS 页凝胶, 用迷你玻璃板和1毫米垫片制备。用抗体对β肌动蛋白进行了探针检测。印迹显示, 当裂解物被装入1.5 毫米井 (车道 4-6) 与3毫米井 (车道 1-2) 比较时, β肌动蛋白信号从500到2000高压。裂解物从2000到500细胞被装载到车道7到9。M, 分子量标记。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 对新鲜分离的 HSCs 进行了印迹分析, 并通过细胞因子 (超临界)体外刺激了高压钠灯.用荧光活化细胞分选 (离心), 悬浮2% 的血清/PBS, 计数, 然后分成两个管。第一管中的高压钠灯以37°c (+ 超临界值为5分钟) 刺激, 第二管中的高压钠灯在无临界值 (临界值) 的情况下培养为5分钟。细胞离心, 细胞颗粒裂解 Laemmli 样品缓冲。HSCs 纯化, 直接裂解 Laemmli 样品缓冲, 不培养。裂解物被装入1.5 毫米井和电泳通过 12% SDS 页凝胶。该印迹是发展的抗体的伸长起始因子 4G (EIF4G), β肌动蛋白, 磷酸化小核糖体亚单位 S6 (p-Rps6)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
西方印迹是一种常见的技术检测特定的蛋白质和激活信号通路的组织或细胞。通过对通常使用的程序进行小的调整, 我们能够例行地检测15种不同的蛋白质 (材料表), 在 1.5万 HSCs, 在某些情况下, 在 500 HSCs。该协议中最关键的步骤是: 1) 精确计数单元格, 2) 最小化管之间的传输数, 3) 株溶藻单元格直接与 Laemmli 样本缓冲区。当株溶藻的细胞颗粒与 Laemmli 样品缓冲, 我们发现, 而不是删除所有的上清从细胞颗粒和重新悬浮在 Laemmli 样本缓冲区, 如果我们相反留在管内的一小部分上清, 并增加了等效体积 2x Laemmli 样品缓冲器, 可以避免细胞丢失。离心在摆动铲斗转子中的细胞也降低了细胞丢失的风险。通过修剪梳齿来减小井宽, 提高了检测灵敏度。
通过对程序的这些简单的调整, 我们能够获得可重现的结果, 相当于那些使用了 10- 20 倍的细胞3,4,5,6,7. 此外, 在标准程序13下, 可以剥去印迹, 以增加可从少量细胞中获得的信息量。检测感兴趣蛋白质的能力将受到抗体质量和蛋白质丰度的限制。这种改良的技术应该大大减少从稀有细胞中获取蛋白质数据所需的动物数量。
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Disclosures
作者没有利益冲突要申报。
Acknowledgments
美国国立卫生研究院资助 R01 CA149976 支持这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
References
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