Summary
Standard Western blotting protokollet var optimerad för att analysera så få som 500 hematopoetiska stamceller eller stamceller. Optimering innebär noggrann hantering av cell provet, begränsa överföringar mellan rören och direkt lyseringslösning cellerna i Laemmli prov buffert.
Abstract
Hematopoetiska stamceller (Förenta) är sällsynta celler, med musen benmärgen som innehåller endast ~ 25.000 fenotypiska lång sikt återinplantering Förenta. Ett Western blotting protokoll var optimerad och lämplig för analys av litet antal Förenta (500-15 000 celler). Fenotypiska Förenta var renat, exakt räknas och direkt lyserat i Laemmli prov buffert. Lysates som innehåller lika många celler analyserades av sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE), och blot var beredd och bearbetas efter standard Western blotting protokoll. Användning av detta protokoll, 2,000-5,000 Förenta kan analyseras rutinmässigt, och i vissa fall uppgifter kan erhållas från så lite som 500 celler, jämfört med 20 000 till 40.000 cellerna rapporteras i de flesta publikationer. Detta protokoll bör vara generellt tillämplig på andra hematopoetiska celler och gör rutinmässig analys av litet antal celler som använder standard laboratorierutiner.
Introduction
Hematopoetiska stamceller (Förenta) är själv förnya celler som kan ge upphov till alla blod härstamningar. De är relativt sällsynta celler i benmärgen, rendering biokemiska analyser svårt. Metoder som är lämpliga för att analysera sällsynta celler, såsom flödescytometri, har varit mycket nyttiga för att kvantifiera relativa belopp för cell yta markörer och intracellulära proteiner. Men analysen av intracellulära proteiner nödvändiggör användning av cellen vilket förfaranden att aktivera antikropp åtkomst och inte alla cell surface epitoper överleva dessa förfaranden1,2. Dessutom antikroppar som diskriminerar mellan olika protein isoformer eller klyvning produkter inte är ofta tillgängliga för flödescytometri, och därför utredare fortfarande förlitar sig på Western blotting för vissa typer av analyser.
Western blot analys av cell lysates är ett rutinmässigt förfarande i de flesta laboratorier. Celler kan renas under inhemska förhållanden som bevarar epitoper av cell surface molekyler och cell lysates kan därefter beredd och analyseras. Analys av proteiner i sällsynta primär cell populationer av Western blot kan dock kräva euthanizing stort antal djur för att få tillräckligt med celler. Genom att göra små justeringar till flera steg, var en konventionell Western blotting protokollet kunna detektera proteiner i relativt litet numrerar av Förenta (500-15 000, beroende på proteinet av intresse). Justeringarna omfattar exakt räkna cellerna, noga hantering cellpelleten, minska överföringar av celler mellan rören att minimera cellförlust, och lyseringslösning ett definierat antal celler med en koncentrerad lastning buffert innehållande proteasom och fosfatas-hämmare. Många publicerade rapporter inkluderar Western blotting erhålls med 20.000 eller mer Förenta3,4,5,6,7; denna enkla procedur kommer att minska antalet celler och försöksdjur som krävs för att producera motsvarande data av mellan 4 och 40 gånger. Protokollet syftar till att normalisera resultat på basis per cell, i stället för att en intern kontroll. Detta möjliggör detektering av övergripande minskning av proteinnivåer som kan förbises om data är normaliserad till intern kontroll. Vikten av att normalisera på basis per cell beskrevs för analys av gen uttryck data8, och samma princip gäller att kvantifiera proteiner genom Western blot. Detta optimerade protokoll bör vara användbart för alla som behöver analysera litet antal celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer måste utföras i enlighet med institutionell användning av djur och vård riktlinjer. Förfarandet utvecklades för analys av murina hematopoetiska stamceller och stamceller celler (Förenta och HPs), men kan anpassas för analys av andra cellpopulationer.
1. flöde flödescytometri isolering av murina Förenta och HPs
- Skörda murina benmärgsceller som beskrivs i litteratur6.
Obs: Data som presenteras i figur 1 och figur 2, benmärg har skördats från C57BL/6J möss. - Utföra härstamning utarmning av benmärgsceller med hjälp av en mus härstamning utarmning kit, följa tillverkarens instruktioner.
- Inkubera cellerna med antikroppar mot de cell yta markörerna av intresse som beskrivs7. I de experiment som visas i figur 1 och figur 2, används antikroppar mot Sca-1, Kit, Flt3 och härstamning (Lin) markörer Mac1, Gr1, CD3e, B220 och Ter119.
- Sortera 2,000-20,000 Lin– Sca1+Kit+ Flt3– celler (Förenta) eller Lin–Sca1–Kit+ celler (HPs) i 1,5 mL Eppendorf-rör som innehåller fosfat 0,1 mL buffrad saltlösning (PBS) med 2% fostrets nötkreatur serum (FBS).
Obs: För de data som visas i figur 1 och figur 2, celler sorterades använder en Flow Cytometer med 70 µM munstycke. Den högsta samlingen är 1,4 mL.
2. provberedning
Obs: Detta steg är kritisk. Bearbeta provet mycket noggrant. När du tar bort supernatanten, vara mycket noga med att inte störa cellpelleten.
- 1,5 mL centrifugrör som innehåller sorterade celler i en svängande hink rotor vid 4 ° C, 500 x g, för 5 min. ta bort alla utom cirka 100 μl av supernatanten från cellen pellet mycket försiktigt med en pipett och en 20 µL Pipettera spets. Inte störa pelleten.
- Om provet innehåller färre än 5 000 celler, och den totala volymen av sorterade provet är mindre än 0,2 mL, överföra cellerna först till låga bindande 0,2 mL PCR-rören innan centrifugering.
- Om provet innehåller färre än 5 000 celler och är mer än 0,2 mL, snurra cellerna ner med en centrifug vid 4 ° C, 500 x g, i 5 minuter och ta bort alla utom 200 µL av supernatanten. Återsuspendering pelleterat cellerna i de återstående 200 µL av supernatanten, sedan överföra cellerna till 0,2 mL PCR-rören och snurra ner igen. Ta bort alla men 20-30 µL från pelleten efter andra spin och resuspendera cellerna.
- Att resuspendera cellerna supernatanten till vänster i röret. Om det behövs, tillsätt ytterligare PBS i 2% FBS/PBS (du kan också använda 2% bovint serumalbumin (BSA) / PBS eller PBS ensam) att få en koncentration 5 x104 till 5 x 105 celler/mL.
Obs: Använd cellen räknas som samlas in av flödescytometri att uppskatta volymen används att avbryta celler. - Använd 2-5 µL av de åter suspenderade cellerna för att fastställa en korrekt cell koncentration med en automatisk cell räknare (efter tillverkarens anvisningar) eller en hemocytometer9.
- Överföra en volym av nytt suspenderade celler som innehåller det önskade antalet celler till nya 1,5 mL rör. För experimentet i figur 1överfördes 2000, 1000 eller 500 Förenta eller HPs. Önskat antal celler beror på styrkan av den signal som erhålls genom Western blot, och bestäms empiriskt. Utföra överföringen med hjälp av en 20 µL eller 100 µL Eppendorf pipettspetsen.
- Centrifugera cellerna i en svängande hink rotor vid 4 ° C, 500 x g, för 5 min.
- Generera 100 x stamlösningar, lös proteasom och fosfatas-hämmare i DMSO enligt tillverkarens anvisningar.
- Förbered 2 x Laemmli prov buffert genom att späda ut 4 x Laemmli prov bufferten som tillhandahålls av tillverkaren med motsvarande mängd destillerat vatten. Tillsätt en lämplig mängd 100 x beståndet av proteasom och fosfatas hämmare att erhålla en slutlig koncentration på 2 x hämmare i 2 x Laemmli prov buffert.
Obs: 2 x Laemmli prov bufferten kan göras i förväg, men proteasom och fosfatas-hämmare bör läggas omedelbart innan du lägger till de 2 x Laemmli prov buffert (plus -hämmare) till cellpelleten för att lysera celler, som beskrivs i följande steg. - Försiktigt bort en del av supernatanten från cellpelleten och supernatanten kvar i röret med cellpelleten, tillsätt en motsvarande volym av 2 x Laemmli prov buffert plus proteasom och fosfatas hämmare att uppnå en slutlig koncentration av 500 celler/µL i 1 x Laemmli prov buffert.
Obs: till exempel om du överför 2 000 celler i en total volym på 20 µL till en tub i steg 2.5, efter centrifugering cellerna (steg 2,6) bör du ta bort 18 µL av supernatanten från pelleten, och de 2 µL av supernatanten som återstår Tillsätt en motsvarande volym (2 µL) av 2 x Laemmli prov buffert för att uppnå en slutlig koncentration av 500 celler/µL i 1 x Laemmli prov buffert. - Återsuspendera pelleten för att generera den lysate så snart som möjligt. Vid denna punkt, proverna kan vara omedelbart electrophoresed genom SDS-PAGE geler eller kan snapin frysta i vätska N2 och lagras vid-80 ° C för framtida bruk.
3. elektrofores
- Värm lysates i ett värme block vid 95 ° C eller i kokande vatten i 5 min.
- Electrophorese 1-40 µL av den lysates (innehållande från 500 upp till 20.000 cell medel) genom SDS-PAGE geler på 100V använder standardprotokoll10.
Obs: Volymen av lysat läsas in gelen bestäms av antalet celler som behövs för att generera den önskvärda signalen och kommer att bero på överflödet av proteinet av intresse och kvaliteten på antikroppen. Uppgifterna i figur 1 erhölls med 2 000, 1 000 och 500 cell motsvarigheter till lysate. Bredden på brunnen kapas i spänna av 3 mm till 1,5 mm. 1,5 mm tänder kan vara från en kommersiellt tillgänglig kam med bredare tänder med sax.
4. överför och blockera
Obs: Utföra en Western blot efter standardprotokoll11. Stegen beskrivs kortfattat här:
- Förbehandla polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) membran med metanol för 10 s, sedan tvätta membranet kort med destillerat vatten.
- Överföra proteinet från SDS-PAGE gelen till membranet instruktionerna i manualen som tillhandahålls av tillverkaren av överföring apparaten.
- Efter överföringen, blockera membranet med 2 mL 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBST (PBS med 0,1% Tween) över natten vid 4 ° C efter standardprotokoll11.
5. antikropp märkning
- Inkubera membranet med antikroppar på en shaker övernattning på 4 ° C med hjälp av antikropp utspädningar rekommenderas av leverantören.
Obs: I tabellen av material, antikroppar, som vi har validerat för Förenta och HPs och de motsvarande antikropp utspädningarna, visas. Utföra den antikropp märkning använder standardprocedurerna8.
6. upptäckten
- Tvätta membranet 3 gånger, 5 min för varje tvätt i PBST vid rumstemperatur.
- Inkubera membranet med 2 mL förbättrade chemiluminescence buffert för 1 min i rumstemperatur. Upptäcka signalerna använder ett imaging system efter tillverkarens instruktioner, eller autoradiografi film och film processor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat från 500-2,000 upprenat Förenta och HPs visas i figur 1 och figur 2. Β-aktin signalen i figur 1 kan upptäckas från så lite som 500 Förenta och HPs renats från benmärg från en mus. Observera att ladda lysates i 1,5 mm brunnar produceras en mycket starkare signal från 500 HPs än lastning i 3.0 mm brunnar. Figur 2 är en Western blot av EIF4G och fosforyleringen av Rps6 (p-Rps6), som båda är involverade i regleringen av protein översättning12, i Förenta, och i HPs med och utan stimulering av stamceller faktor (SCF) i vitro.
Figur 1: Western Blot för β-aktin utförs med lysates från murint Förenta och HPs. Förenta sorterades från härstamning utarmat murina benmärgsceller som Lin–Sca1+Kit+ Flt3– celler och HPs var Sca1 Lin––Kit+. Lysates beredd från olika antal celler var electrophoresed genom en 12% SDS-PAGE gel tillagas med mini glasplattor med 1 mm distanser. Blot var utforskad med antikropp till β-aktin. Blot visar jämförande β-aktin signalerna från 500 till 2.000 HPs när lysates lastades i 1,5 mm brunnar (4-6 körfält) jämfört med 3 mm brunnar (körfält 1 - 2). Lysates från 2 000 till 500 celler lastades på körfält 7 till 9. M, molekylvikt markörer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Western Blot analys av nymalen isolerade Förenta, och HPs stimuleras i vitro med cytokin Stem Cell faktor (SCF). HPs var renas genom fluorescens aktiverad cell sortering (FACS), centrifugeras, resuspended i 2% FBS/PBS, räknas, sedan dela i två rör. I HPs i första röret stimuleras med SCF (10 ng/mL) under 5 minuter vid 37 ° C (+ SCF), och HPs i andra tube odlades för 5 min i avsaknad av SCF (-SCF). Cellerna var sedan centrifugeras och cellpelleten lyserat med Laemmli prov buffert. Förenta var renas och direkt lyserat med Laemmli prov buffert utan odling. Lysates lastades i 1,5 mm brunnar och electrophoresed genom 12% SDS-PAGE geler. Blot utvecklades med antikroppar mot initierande brottöjning 4G (EIF4G), β-aktin och fosforyleras små Ribosomen underenhet S6 (p-Rps6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Western Blotting är en vanlig teknik för att upptäcka specifika proteiner och aktivering av signalvägar i vävnader eller celler. Genom att införa små justeringar till en vanliga procedur, kunde vi rutinmässigt identifiera 15 olika proteiner (Tabell för material) i 15.000 Förenta och i vissa fall på så lite som 500 Förenta. The Most kritiska steg i detta protokoll är: 1) exakt räkna cellerna, (2) vilket minimerar antalet överföringar mellan rören och 3) lyseringslösning cellerna direkt med Laemmli prov buffert. När lyseringslösning cellpelleten med Laemmli prov buffert, fann vi att snarare än att ta bort alla av supernatanten från cellpelleten och åter upphäva det i Laemmli prov buffert, om vi istället kvar en liten volym av supernatanten i röret och lagt till en motsvarande volym av 2 x Laemmli prov buffert, vi kunde undvika cellförlust. Centrifugering cellerna i en svängande hink rotor minskade också risken för cellförlust. Minska bredden på brunnen genom putsning kamma tänderna förbättrade känsligheten för upptäckt.
Med dessa enkla justeringar till förfarandet kunde vi få reproducerbara resultat motsvarar dem i publicerade artiklar som hade använt 10 - 20 gånger fler celler3,4,5,6, 7. vidare blopparna kan demonteras för åter läska efter standardförfaranden13, öka mängden av information som kan erhållas från ett litet antal celler. Möjligheten att detektera proteiner av intresse kommer att begränsas av antikroppen och protein överflödet kvalitet. Denna modifierade teknik bör kraftigt minska antalet djur som krävs för att få protein data från sällsynta cellpopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att deklarera.
Acknowledgments
National Institutes of Health bevilja R01 CA149976 (Nordvall) stödjer detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
References
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).
- Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
- Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
- Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
- Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
- Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. , (2015).
- Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151 (3), 476-482 (2012).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
