Summary
En standard Western blotting protokollen var optimalisert for å analysere løpet 500 blodkreft stilk eller progenitor celler. Optimalisering innebærer forsiktig håndtering av cellen prøven begrense overføringer mellom rør og direkte lysing cellene i Laemmli eksempel buffer.
Abstract
Blodkreft stamceller (HSCs) er sjelden celler, med musen benmargen inneholder bare ~ 25.000 fenotypiske lang sikt repopulating HSCs. En vestlig blotting protokoll var optimalisert og egnet for analyse av lite antall HSCs (500-15.000 celler). Fenotypiske HSCs ble renset, nøyaktig telt og direkte lysed i Laemmli eksempel buffer. Lysates som inneholder lik antall celler ble analysert av natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side), og blot var forberedt og behandlet etter standard Western blotting protokoller. Bruker denne protokollen, 2000-5000 HSCs kan analyseres rutinemessig, og i noen tilfeller kan dataene hentes fra løpet av 500 celler, i forhold til 20.000-40.000 cellene rapportert i de fleste publikasjoner. Denne protokollen skal generelt gjelder for andre blodkreft cellene og kan rutinemessig analyse av lite antall celler ved hjelp av standard laboratorium prosedyrer.
Introduction
Blodkreft stamceller (HSCs) er selv fornyende celler som kan gi opphav til alle blod overleveringslinjer. De er relativt sjeldne cellene i benmargen, rendering biokjemiske analyser vanskelig. Tilnærminger egnet for å analysere sjeldne celler, for eksempel flowcytometri, har vært svært nyttig for kvantifisere relative mengdene av cellen overflate markører og intracellulær proteiner. Imidlertid analyse av intracellulær proteiner nødvendiggjør bruk av celle permeabilization prosedyrer for å aktivere antistoff tilgang, og ikke alle cellen overflaten epitopes overleve disse prosedyrene1,2. I tillegg antistoffer som diskriminerer mellom annet protein isoformene eller cleavage produkter er ikke ofte tilgjengelig for flowcytometri, og derfor etterforskere fortsatt stole på vestlige blots for visse typer analyser.
Western blot analyse av celle lysates er en rutinemessig prosedyre i de fleste laboratorier. Cellene kan bli renset under innfødt forhold som bevarer epitopes av cellen overflaten molekyler, og cellen lysates kan deretter forberedt og analyseres. Analyse av proteiner i sjeldne primære celle populasjoner Western blot kan imidlertid kreve euthanizing stort antall dyr å få nok celler. Ved å gjøre små justeringer flere trinn, kunne en tradisjonell vestlig blotting protokoll oppdage proteiner i relativt lite antall HSCs (500-15.000, avhengig av protein av interesse). Justeringene omfattene nøyaktig teller cellene, forsiktig håndtering celle pellets, redusere overføringer av celler mellom rør for å unngå tap av cellen, og lysing et definert antall celler med en konsentrert lasting som inneholder proteasome og fosfatase hemmere. Mange publiserte rapporter inneholder vestlige blots med 20.000 eller mer HSCs3,4,5,6,7; Denne enkel prosedyre vil redusere antall celler og forsøksdyr kreves for å produsere tilsvarende data av mellom 4 og 40 ganger. Protokollen er utformet til å normalisere resultatene på en per celle-basis, og ikke en intern kontroll. Dette gjør påvisning av generelle reduksjoner i protein nivå som kan bli oversett hvis dataene er normalisert en intern kontroll. Betydningen av normalisere på per celle basis ble beskrevet for analyse av gene expression data8, og det samme prinsippet gjelder for kvantifisere proteiner ved Western blot. Denne optimaliserte protokollen bør være nyttig for alle som trenger å analysere lite antall celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer må utføres i henhold til institusjonelle dyr bruk og omsorg retningslinjer. Prosedyren ble utviklet for analyse av murine blodkreft stilk og stamfar celler (HSCs og HPs), men kan tilpasses for analyse av andre celle populasjoner.
1. flyt cytometri isolasjon Murine HSCs og HPs
- Høste murine bein margtransplantasjon celler som beskrevet i litteraturen6.
Merk: I dataene som vises i figur 1 og figur 2, benmarg ble høstet fra C57BL/6J mus. - Utføre avstamning uttømming av bein margtransplantasjon celler ved hjelp av en mus avstamning uttømming kit, følger produsentens instruksjoner.
- Inkuber cellene med antistoffer mot celle overflate markører rundt beskrevet7. I eksperimentene vist i figur 1 og figur 2, brukes antistoffer mot Sca-1, Kit, Flt3 og lineage (Lin) markører Mac1, Gr1, CD3e, B220 og Ter119.
- Sortere 2000-20.000 Lin- Sca1+Kit+ Flt3- celler (HSCs) eller Lin-Sca1-Kit+ celler (HPs) inn i 1,5 mL Eppendorf rør som inneholder 0,1 mL fosfat bufret saltvann (PBS) med 2% fosterets storfe serum (FBS).
Merk: For dataene vises i figur 1 og figur 2celler er sortert ved hjelp av en Flow Cytometer med en 70 µM dyse. Maksimal samling volumet er 1,4 mL.
2. prøven forberedelse
Merk: Dette trinnet er viktig. Behandle prøven nøye. Når du fjerner nedbryting, være meget forsiktig ikke å forstyrre celle pellets.
- Sentrifuger 1.5 mL rør som inneholder sorterte celler i en svingende bøtte rotor på 4 ° C, 500 x g, for 5 min. Fjern alle men ca 100 µL nedbryting fra cellen av pellets svært forsiktig med en pipette og et 20 µL Pipetter tips. Ikke forstyrr pellet.
- Hvis utvalget inneholder mindre enn 5.000 celler, og det totale volumet av sorterte prøven er mindre enn 0,2 mL, overføre cellene først til lav bindende 0,2 mL PCR rør før sentrifugering.
- Hvis utvalget inneholder mindre enn 5.000 celler og er mer enn 0,2 mL, Nedspinning cellene med en centrifuge ved 4 ° C, 500 x g, for 5 min, og fjerne alle men 200 µL nedbryting av. Nytt suspendere pelleted cellene i den gjenværende 200 µL av nedbryting, og overføring cellene til 0,2 mL PCR rør og spinne ned igjen. Fjern alle men 20-30 µL fra pellet etter andre spinn og å suspendere celler.
- Resuspend cellene i supernatant venstre i røret. Om nødvendig kan du legge til ekstra PBS i 2% FBS/PBS (du kan også bruke 2% bovin serum albumin (BSA) / PBS eller PBS alene) å få en konsentrasjon 5 x104 til 5 x 105 celler/mL.
Merk: Bruk cellen teller samles inn av cytometri til å beregne volumet som ble brukt til å suspendere celler. - Bruk 2-5 µL re suspendert cellene for å fastslå en nøyaktig celle konsentrasjon bruker en automatisert celle teller (etter produsentens instruksjoner) eller en hemocytometer9.
- Overføre et volum på nytt suspendert cellene som inneholder ønsket antall celler til nye 1,5 mL rør. For eksperimentet i figur 1, ble 2000, 1000 eller 500 HSCs eller HPs overført. Ønsket antall celler avhenger av styrken signalet ved Western blot, og bestemmes empirisk. Utfør overføring ved hjelp av en 20 µL eller 100 µL Eppendorf pipette tips.
- Sentrifuge cellene i en svingende bøtte rotor ved 4 ° C, 500 x g, for 5 min.
- For å generere 100 x lager løsninger, løses proteasome og fosfatase hemmere i DMSO i henhold til produsentens instruksjoner.
- Forberede 2 x Laemmli eksempel buffer fortynne 4 x Laemmli eksempel bufferen fra produsenten med tilsvarende beløp destillert vann. Legge til en passende mengde 100 x lager av proteasome og fosfatase hemmere å få en endelig konsentrasjon av 2 x hemmere i 2 x Laemmli eksempel buffer.
Merk: 2 x Laemmli eksempel bufferen kan gjøres på forhånd, men det proteasome og fosfatase hemmere bør legges umiddelbart før du legger den 2 x Laemmli eksempel buffer (pluss hemmere) til celle pellet å lyse cellene, som beskrevet i følgende trinn. - Nøye fjerne en del av nedbryting fra cellen pellets og nedbryting i røret med cellen pellet, legge til en like volum 2 x Laemmli eksempel buffer pluss proteasome og fosfatase hemmere å oppnå en siste konsentrasjon av 500 celler/µL 1 x Laemmli eksempel buffer.
Merk: For eksempel hvis du overfører 2000 celler i et totalvolum på 20 µL et rør i trinn 2.5, etter sentrifugering cellene (trinn 2.6) bør du fjerne 18 µL nedbryting av fra pellets, og de 2 µL av nedbryting som gjenstår legge en lik mengde (2 µL) 2 x Laemmli eksempel buffer for å oppnå en siste konsentrasjon av 500 celler/µL 1 x Laemmli eksempel buffer. - Resuspend pellets for å generere den lysate så snart som mulig. På dette punktet, eksemplene kan være umiddelbart electrophoresed gjennom SDS side gels, eller kan være snapin frosset i flytende N2 og lagret på-80 ° C for fremtidig bruk.
3. geleelektroforese
- Varm lysates i en varme blokk på 95 ° C eller i kokende vann i 5 min.
- Electrophorese 1-40 µL av lysates (med 500 opp til 20.000 celle ekvivalenter) gjennom SDS side gels på 100V bruker standard protokoller10.
Merk: Volumet av lysate lastet inn i gel bestemmes av antall celler for å generere ønskelig signalet, og avhenger av protein av interesse, og kvaliteten av antistoffer. Dataene i figur 1 ble innhentet med 2000, 1000 og 500 celle ekvivalenter av lysate. Bredden av brønnen skal mellom 3 mm til 1,5 mm. 1,5 mm tenner kan kuttes fra en kommersielt tilgjengelig kam med bredere tenner med saks.
4. Overfør og blokkere
Merk: Utfør en Western blot etter standardprotokoller11. Trinnene er kort beskrevet her:
- Pretreat en polyvinylidene difluoride (PVDF) membran med metanol for 10 s og vask membranen kort med destillert vann.
- Overføre protein fra SDS side gel til membranen følge instruksjonene i manuell levert av produsenten av overføring apparatet.
- Etter overføring, blokkere membranen med 2 mL 5% bovin serum albumin (BSA) i PBST (PBS med 0,1% mellom) overnatting på 4 ° C etter standardprotokoller11.
5. antistoff merking
- Inkuber membranen med antistoffer i en shaker overnatting på 4 ° C med antistoff fortynninger anbefalt av leverandøren.
Merk: I tabellen av materialer, antistoffer, som vi har godkjent for HSCs og HPs og de tilsvarende antistoff fortynninger, vises. Utføre antistoff merkingen bruker standard prosedyrer8.
6. gjenkjenning
- Vask membranen 3 ganger, 5 min for hver vask i PBST ved romtemperatur.
- Inkuber membranen med 2 mL forbedret chemiluminescence buffer for 1 min ved romtemperatur. Oppdage signaler ved hjelp av en tenkelig system følger produsentens instruksjoner, eller autoradiography film og film prosessor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant resultater fra 500-2000 renset HSCs og HPs er vist i figur 1 og figur 2. Β-utgangen signalet i figur 1 kan oppdages fra løpet av 500 HSCs og HPs renset fra benmargen av en musen. Merk at lasting av lysates i 1,5 mm brønner produsert en mye sterkere signal fra 500 HPs enn lasting i 3.0 mm brønner. Figur 2 er en Western blot av EIF4G og fosforylering av Rps6 (p-Rps6), begge er involvert i regulering av protein oversettelsen12, i HSCs, og i HPs med og uten stimulering av stilk cellen faktor (SCF) i vitro.
Figur 1: Western Blot for β-utgangen utført med lysates fra murint HSCs og HPs. HSCs er sortert fra avstamning utarmet murine bein margtransplantasjon celler som Lin-Sca1+Kit+ Flt3- celler og HPs var Lin-Sca1-Kit+. Lysates utarbeidet av forskjellig antall celler var electrophoresed gjennom en 12% SDS side gel tilberedt med mini glassplater med 1 mm avstandsstykker. Blot undersøkt med antistoff β-utgangen. Blot viser sammenlignende β-utgangen signalene fra 500 til 2.000 HPs når lysates ble lastet i 1,5 mm brønner (baner 4-6) sammenlignet med 3 mm brønner (baner 1 - 2). Lysates fra 2000 til 500 celler ble lastet inn baner 7 til 9. M, molekylvekt markører. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Western Blot analyse av fersk isolerte HSCs og HPs stimuleres i vitro med cytokin stamcelleforskningen faktor (SCF). HPs var renset fluorescens aktivert celle sortering (FACS), sentrifugeres, resuspended i 2% FBS/PBS, telt, deretter delt i to rør. HPs i første røret ble stimulert med SCF (10 ng/mL) for 5 min på 37 ° C (+ SCF) og HPs i andre røret ble kultivert for 5 min i fravær av SCF (-SCF). Cellene ble deretter centrifuged og celle pellet lysed med Laemmli eksempel buffer. HSCs ble renset og direkte lysed med Laemmli eksempel buffer uten dyrking. Lysates ble lastet i 1,5 mm brønner og electrophoresed gjennom 12% SDS side gels. Blot ble utviklet med antistoffer mot forlengelse initiering faktor 4G (EIF4G), β-utgangen og fosforylert liten ribosom delenhet S6 (p-Rps6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Western Blotting er en vanlig teknikk for å oppdage spesifikke proteiner og aktivering av signalveier i vev eller celler. Ved å introdusere små justeringer til en vanlig prosedyre, kunne vi rutinemessig oppdage 15 ulike proteiner (Tabell for materiale) i 15 000 HSCs, og i noen tilfeller i løpet av 500 HSCs. The Most avgjørende skritt i denne protokollen er: 1) nøyaktig teller cellene, 2) minimere antall overføringer mellom rør og 3) lysing cellene direkte med Laemmli eksempel buffer. Når lysing celle pellets med Laemmli eksempel buffer, fant vi at stedet fjerne alle nedbryting fra cellen pellet og å deaktivere det i Laemmli eksempel Buffer, hvis vi i stedet igjen en liten mengde nedbryting i røret og lagt til en tilsvarende volumet av 2 x Laemmli eksempel Buffer, kan vi unngå tap av cellen. Sentrifugering cellene i en svingende bøtte rotor også redusert risikoen for tap av cellen. Redusere bredden på brønnen med trimming kam tennene forbedret følsomheten til gjenkjenning.
Med disse enkle justeringer i prosedyren kunne vi få reproduserbar resultater tilsvarende de i publiserte artikler som hadde brukt 10 - 20 ganger mer celler3,4,5,6, 7. videre til blots kan bli strippet for nytt blotting følge standard prosedyrer13, økende mengden av informasjon som kan hentes fra et lite antall celler. Muligheten til å oppdage proteiner av interesse vil begrenses av kvaliteten på antistoffer og protein overflod. Denne endrede teknikken bør sterkt redusere antall dyr nødvendig å anskaffe protein fra sjeldne celle populasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å erklære.
Acknowledgments
National Institutes of Health gir R01 CA149976 (N.A.S) støttet dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
References
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).
- Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
- Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
- Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
- Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
- Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. , (2015).
- Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151 (3), 476-482 (2012).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
