Summary
Un estándar de Western Blot protocolo fue optimizado para el análisis de tan sólo 500 madre hematopoyética o células progenitoras. Optimización implica la cuidadosa manipulación de la muestra de células, limitando las transferencias entre los tubos y directamente lisis de las células en Tampón Laemmli.
Abstract
Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son las células raras, con la médula ósea de ratón con sólo 25.000 ~ fenotípica largo plazo HSCs repoblamiento. Un Western Blot protocolo fue optimizado y adecuado para el análisis de una pequeña cantidad de HSCs (células 500-15.000). HSCs fenotípicas fueron purificadas, contó con precisión y lisis directamente en Tampón Laemmli. Lisados que contiene igual número de células se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE), y lo blot fue preparado y procesadas siguiendo el estándar de Western Blot protocolos. Mediante este protocolo, 2.000-5.000 HSCs pueden analizarse de forma rutinaria, y en algunos casos pueden obtenerse datos de tan sólo 500 células, en comparación con las células de 20.000 a 40.000 registradas en la mayoría de las publicaciones. Este protocolo debe aplicarse generalmente a otras células hematopoyéticas y permite el análisis de rutina de un pequeño número de células utilizando procedimientos estándar del laboratorio.
Introduction
Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son células renueva a sí misma que pueden dar lugar a todos los linajes de sangre. Son células relativamente raras en la médula ósea, haciendo difícil los análisis bioquímicos. Enfoques adecuados para el análisis de células, como la citometría de flujo, han sido extremadamente útiles para cuantificar cantidades relativas de los marcadores de superficie celular y proteínas intracelulares. Sin embargo, el análisis de proteínas intracelulares requiere la utilización de procedimientos de permeabilización celular para permitir el acceso del anticuerpo, y no todos celular epitopos superficiales sobreviven estos procedimientos1,2. Además, anticuerpos que discriminan entre productos de diferentes proteínas isoformas o hendidura a menudo no están disponibles para citometría de flujo, y por lo tanto, los investigadores todavía dependen de Western blot para ciertos tipos de análisis.
Mancha blanca /negra occidental análisis de lysates de la célula es un procedimiento rutinario en la mayoría de los laboratorios. Las células se pueden purificar en condiciones nativas que conservan los epitopos de moléculas de superficie celular, y lysates de la célula puede preparado y analizado posteriormente. Sin embargo, el análisis de proteínas en célula de primaria rara poblaciones por Western blot puede requerir euthanizing grandes cantidades de animales para obtener suficientes células. Haciendo pequeños ajustes en varios pasos, un protocolo Blot Western convencional fue capaz de detectar proteínas en un número relativamente pequeño de HSCs (500-15.000, dependiendo de la proteína de interés). Los ajustes incluyen exactamente contando las células, manipular cuidadosamente el sedimento celular, reducir las transferencias de células entre tubos para minimizar la pérdida de la célula, y lisis de un número determinado de células con una carga concentrada tampón que contiene proteasoma y inhibidores de la fosfatasa. Muchos informes publicados incluyen manchas blancas /negras occidentales obtenidas con 20.000 o más HSCs3,4,5,6,7; Este sencillo procedimiento reducirá el número de células y animales de experimentación necesarios para producir datos equivalentes por entre 4 y 40 veces. El protocolo está diseñado para normalizar los resultados en una base por células, en lugar de un control interno. Esto permite la detección de la reducción general en los niveles de proteína que pueden pasarse por alto si los datos se normalizan a un control interno. La importancia de la normalización de una base por celular fue descrita para el análisis de de datos de expresión génica8, y el mismo principio se aplica a la cuantificación de proteínas por Western blot. Este protocolo optimizado debe ser útil para cualquier persona que necesite analizar una pequeña cantidad de células.
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Protocol
Todos los procedimientos deberán realizarse con arreglo institucional uso de animales y su cuidado. El procedimiento fue desarrollado para el análisis de murino madre y progenitoras células hematopoyéticas (HSCs y HPs), pero puede ser adaptado para el análisis de otras poblaciones de la célula.
1. flujo Cytometry aislamiento de HSCs murinas y HPs
- Cosecha de células de médula ósea murina como se describe en la literatura6.
Nota: En los datos presentados en la figura 1 y figura 2, la médula ósea fue cosechada de ratones C57BL/6J. - Realizar el agotamiento de linaje de células de médula ósea usando un ratón linaje agotamiento kit, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Incubar las células con anticuerpos contra los marcadores superficiales de la célula de interés descrito7. En los experimentos que se muestra en la figura 1 y figura 2, se utilizan anticuerpos para Sca-1, Kit, Flt3 y marcadores de linaje (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 y Ter119.
- Ordenar 2.000-20.000 Sca1 de Lin– +Kit+ Flt3 células– (HSCs) o Lin–Sca1–células del Kit+ (HPs) en tubos Eppendorf de 1.5 mL que contiene 0, 1 mL de fosfato tampón salino (PBS) con 2% fetal bovino suero (FBS).
Nota: Los datos que se muestra en la figura 1 y figura 2, las células fueron clasificadas usando un citómetro de flujo con una boquilla de 70 μm. El volumen de la colección máxima es de 1,4 mL.
2. preparación de la muestra
Nota: Este paso es vital. Procesar la muestra con mucho cuidado. Al retirar el sobrenadante, ser muy cuidado de no perturbar el sedimento celulares.
- Tubos de centrífuga 1,5 mL que contiene las células ordenadas en un rotor que hace pivotar del cubo a 4 ° C, 500 x g, durante 5 minutos quitar todos sino aproximadamente 100 μl del sobrenadante de la celda de pellets muy suavemente con una pipeta y una punta de pipetear 20 μl. No molestes a la pelotilla.
- Si la muestra contiene menos de 5.000 células, y el volumen total de la muestra seleccionada es inferior a 0,2 mL, transferir las células primero a tubos PCR de 0.2 mL baja obligatoria antes de la centrifugación.
- Si la muestra contiene menos de 5.000 células y volumen es más de 0,2 mL, desactivación de las células con una centrifugadora a 4 ° C, 500 x g, 5 min y eliminar casi 200 μL del sobrenadante. Resuspenda las células sedimentadas en los restantes 200 μL de sobrenadante, luego transferir las células a los tubos PCR de 0.2 mL y girar hacia abajo otra vez. Quitar todos sino 20-30 μL pellets después de la segunda vuelta y resuspender las células.
- Resuspender las células en la izquierda sobrenadante en el tubo. Si es necesario, añadir PBS adicional en 2% FBS/PBS (también se puede usar 2% albúmina de suero bovino (BSA) / PBS, o solo PBS) para obtener una concentración de 5 x104 a 5 x 105 células/mL.
Nota: El recuento de uso recopilados por citometría para estimar el volumen utilizado para suspender las células. - Utilice 2-5 μl de las células suspendidas de nuevo para determinar una concentración exacta de la célula usando un contador de células automatizado (siguiendo las instrucciones del fabricante) o un hemocitómetro9.
- Transferir un volumen de células suspendidas de nuevo que contiene el número deseado de células a nuevos tubos de 1,5 mL. Para el experimento en la figura 1, se transfirieron 500, 1.000 o 2.000 HSCs o HPs. El número de las células depende de la fuerza de la señal obtenida mediante Western blot y se determina empíricamente. Realizar a la transferencia utilizando una 20 μl o punta de pipeta de Eppendorf de 100 μl.
- Centrifugar las células en un rotor oscilante de cubo a 4 ° C, 500 x g, durante 5 minutos.
- Para generar 100 x soluciones, disolver inhibidores de proteasoma y fosfatasa en DMSO según las instrucciones del fabricante.
- Preparar 2 x Laemmli tampón diluyendo el 4 x Laemmli Solución tampón de muestras proporcionadas por el fabricante con una cantidad equivalente de agua destilada. Agregar una cantidad apropiada de la población 100 x de inhibidores de la proteasoma y fosfatasa para obtener una concentración final de 2 inhibidores de la x en tampón x Laemmli 2.
Nota: El tampón de muestra de 2 x Laemmli se puede hacer con antelación, pero los inhibidores de la proteasoma y fosfatasa se deben agregar inmediatamente antes de agregar los 2 x Laemmli el tampón de muestra (más inhibidores) para el precipitado de células para lyse las células, como se describe en el siguiente paso. - Quitar una parte del sobrenadante de la pelotilla de la célula y el sobrenadante restante en el tubo con el precipitado de células con cuidado, añadir un volumen igual de 2 x Laemmli tampón más inhibidores de la proteasoma y fosfatasa para alcanzar una concentración final de 500 células/μl en 1 x Laemmli Solución tampón de muestra.
Nota: por ejemplo, si transfiere 2.000 células en un volumen total de 20 μl a un tubo de paso 2.5, después de centrifugar células (paso 2.6) debe eliminar 18 μL del sobrenadante de la pelotilla y 2 μl de sobrenadante que queda añadir un volumen igual (2 μL) de 2 x Laemmli sample buffer alcanzar una concentración final de 500 células/μl en 1 x Laemmli Solución tampón de muestra. - Resuspender el precipitado para generar el lisado tan pronto como sea posible. En este punto, las muestras pueden ser inmediatamente electrophoresed mediante geles SDS-PAGE, o se puede complemento congelado en líquido N2 y almacenado a-80 ° C para su uso futuro.
3. electroforesis
- Calor de los lisados en un bloque térmico a 95 ° C o en agua hirviendo durante 5 minutos.
- Electrophorese μL 1-40 de los lisados (contiene desde 500 hasta 20.000 equivalentes de la célula) a través de geles de SDS-PAGE a 100V utilizando protocolos estándar10.
Nota: El volumen de lisado cargada en el gel es determinado por el número de células necesario para generar la señal deseable y dependerá de la abundancia de la proteína de interés y la calidad del anticuerpo. Los datos en la figura 1 se obtuvieron con 2.000, 1.000 y 500 celular equivalente al lisado. La anchura del pozo debe en el rango de 3 mm a 1,5 mm. 1,5 mm dientes pueden cortar de un peine disponible en el mercado con más dientes con unas tijeras.
4. transferencia y bloquear
Nota: Realizar un Western blot siguiendo protocolos estándar11. Brevemente se describen aquí los pasos:
- Use del polivinilideno (PVDF) de difluoruro membrana con metanol para 10 s, después lavar la membrana brevemente con agua destilada.
- Transferencia de la proteína del gel de SDS-PAGE a la membrana siguiendo las instrucciones en el manual suministrado por el fabricante de los aparatos de transferencia.
- Después de transferencia, bloquear la membrana con 2 mL de 5% albúmina sérica bovina (BSA) en SAFT (PBS con un 0.1% Tween) durante la noche a 4 ° C siguiendo protocolos estándar11.
5. anticuerpo etiquetado
- Incubar la membrana con anticuerpos en un agitador durante la noche a 4 ° C utilizando diluciones de anticuerpo recomendadas por el proveedor.
Nota: Anticuerpos, los cuales hemos validado HSCs, HPs y las diluciones de anticuerpo correspondiente, se muestran en la tabla de materiales. Realizar el anticuerpo etiquetado utilizando procedimientos estándar8.
6. detección de
- Lavar la membrana 3 veces, 5 minutos para cada colada en SAFT a temperatura ambiente.
- Incubar la membrana con 2 mL de tampón de quimioluminescencia realzada durante 1 min a temperatura ambiente. Detectar las señales usando un sistema de imágenes siguiendo las instrucciones, o película de autorradiografía y procesador de la película.
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Representative Results
Resultados representativos de 500-2.000 purificada HSCs y HPs se muestran en la figura 1 y figura 2. La señal de β-actina en la figura 1 se puede detectar desde tan sólo 500 HSCs y HPs purificaron de la médula ósea de un ratón. Tenga en cuenta que cargar los lisados en pozos de 1.5 mm produce una señal mucho más fuerte de 500 HPs que carga en pocillos de 3,0 mm. Figura 2 es un Western blot de EIF4G y la fosforilación de Rps6 (p-Rps6), los cuales están implicados en la regulación de la proteína traducción12, en HSCs y factor de en HPs con y sin estimulación de la célula de vástago (SCF) en vitro.
Figura 1: Western Blot para β-actina realizados con lisados de murine HSCs y HPs. HSCs fueron ordenadas de células de médula ósea murina de linaje agotado como Sca1 Lin–+Kit+ Flt3 células– y HPs fueron Sca1 Lin––Kit+. Fueron electrophoresed lisados preparados a partir de números diferentes de las células a través de un gel de SDS-PAGE de 12% con placas de vidrio mini con espaciadores de 1 mm. La mancha blanca /negra fue sondada con anticuerpo a β-actina. El blot muestra las señales de β-actina comparativa de 500 a 2.000 HPs cuando los lisados fueron cargados en pozos de 1.5 mm (carriles 4-6) en comparación con los pozos de 3 mm (carriles 1 - 2). Lisados de 2.000 a 500 células se cargan en carriles de 7 a 9. M, marcadores de peso molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de Western Blot de HSCs recién aisladas y HPs estimularon en vitro con citoquinas Factor de célula de vástago (SCF). HPs fueron purificados por célula de fluorescencia activada (FACS) de clasificación, se centrifugó, resuspendió en 2% FBS/PBS, contado, dividido entonces en dos tubos. El SPH en el primer tubo fueron estimuladas con SCF (10 ng/mL) durante 5 minutos a 37 ° C (+ SCF) y HPs en el segundo tubo se cultivaron durante 5 min en ausencia de SCF (-SCF). Las células luego se centrifugaron y el precipitado de células sometidas a lisis con Tampón Laemmli. HSCs fueron purificadas y lisis directamente con Tampón Laemmli sin cultivo. Los lisados fueron cargados en pozos de 1.5 mm y a través de geles de SDS-PAGE de 12%. El blot fue desarrollado con los anticuerpos al factor de iniciación elongación 4G (EIF4G), β-actina y ribosoma pequeño fosforilado subunidad S6 (p-Rps6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Western Blot es una técnica común para la detección de proteínas específicas y la activación de vías de señalización en los tejidos o células. Mediante la introducción de pequeños ajustes a un procedimiento de uso general, hemos sido capaces de detectar rutinariamente 15 diversas proteínas (Tabla de materiales) en 15.000 HSCs y en algunos casos en tan solo 500 HSCs. The Most pasos críticos en este protocolo son: 1) exactamente contando las células 2) reduciendo al mínimo el número de transferencias entre tubos y 3) lisis de las células directamente con Tampón Laemmli. Cuando lisis el sedimento celular con Tampón Laemmli, encontramos en lugar de quitar todo el sobrenadante pellets celulares y vuelva a suspender en Laemmli Sample Buffer, si en su lugar dejó un pequeño volumen de sobrenadante en el tubo y añade un equivalente volumen de 2 x Laemmli Sample Buffer, podríamos evitar pérdida de la célula. Centrifugar las células en un rotor que hace pivotar del cubo también disminuyó el riesgo de pérdida de la célula. Reducir la anchura del pozo por recortar los dientes del peine ha mejorado la sensibilidad de detección.
Con estos simples ajustes en el procedimiento, hemos sido capaces de obtener resultados reproducibles equivalentes a las de los artículos publicados que habían usado 10 - 20 veces más células3,4,5,6, 7. Además, las manchas blancas pueden ser despojados para volver a borrar siguiendo procedimientos estándar13, aumentando la cantidad de información que puede obtenerse de un pequeño número de células. La capacidad para detectar las proteínas de interés se verá limitada por la calidad de los anticuerpos y la abundancia de la proteína. Esta técnica modificada debería reducir considerablemente el número de animales necesarios para obtener datos de la proteína de poblaciones celulares raros.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses para declarar.
Acknowledgments
Institutos nacionales de salud otorgar R01 CA149976 (N.A.S) apoyado este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
References
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).
- Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
- Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
- Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
- Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
- Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. , (2015).
- Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151 (3), 476-482 (2012).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
