该协议的目的是实现胰岛的表面工程使用肝素结合 starPEG nanocoating 通过伪 bioorthogonal 化学之间的 nanocoating 琥珀组和胺组的胰岛细胞膜。
细胞表面工程可以保护植入细胞免受宿主免疫攻击。它还可以重塑细胞的景观, 以改善移植功能和生存后移栽。本协议的目的是实现胰岛的表面工程使用一个超薄肝素结合 starPEG (肝炎) nanocoating。以 n-(3-二甲氨基丙基) n-‘-乙基 carbodiimide 为原料, 对胰岛表面工程中的 nanocoating, 制备肝素琥珀酰亚胺琥珀酸 (肝素-NHS)。盐酸和n-琥珀 (NHS)。然后由氨基端功能性的八武装 starPEG (starPEG-(NH2)8) 和肝素-NHS 的交联, 形成了 PEG 混合物。对于胰岛表面涂层, 通过 Histopaque 胶原酶消化和梯度纯化分离小鼠胰岛。然后用冰冷型的 PEG 溶液对孤立的胰岛进行10分钟的治疗, 使 NHS 与胰岛细胞膜胺组之间的共价键结合。Nanocoating 与肝炎, 对胰岛大小和体积和肝素化胰岛的数量和容量的最小改变, 也可能减少即时血液介导的炎症反应在胰岛移植。这种 “易于采用” 的方法对于活细胞的表面工程来说是足够温和的, 而不影响细胞的生存能力。考虑到肝素对多种细胞因子有约束力, nanocoating 也提供了一个开放的平台, 能够将无限的功能性生物介质和多层表面用于活细胞表面。生物工程。
细胞治疗的疗效受低细胞滞留和生存率1、2的限制。为了改善细胞治疗的结果, 细胞表面工程通过酶操作, 肽共轭, bioorthogonal 化学和物理封装与生物材料已被利用3,4, 5,6,7,8,9,10。本议定书旨在通过将超薄肝素结合的 starPEG (肝素 PEG) nanocoating 细胞表面, 实现活细胞的表面工程, 采用 “易于采用” 的方法。本文以胰岛表面工程为例, 以胰岛的异质性和目前临床胰岛移植的贬低结果为实例。
事实上, 临床胰岛移植目前是通过直接注射孤立的胰岛进入肝门静脉, 这一程序只适用于选择性的病人, 因为缺乏捐助材料和低治疗效果11. 传统上, 海藻酸盐一直是胰岛封装和表面改性最常用的生物材料, 尽管它不太理想, 因为海藻酸盐和炎症相关纤维化的化学不稳定性12, 13。此外, 与100至200µm 的胰岛的自然大小相比, 海藻酸钠-胰岛微囊更大, 介于400和800µm 之间, 超过了氧气的生理扩散距离。在不显著改变胰岛体积的情况下, 建立了保形胰岛包封, 并进行了封装。因此, nanomembranes 的沉积, 由 PEG, 四氟乙烯, 硅膜或多层 nanocoating (也称为 “逐层” [LBL] 技术) 已报告, 从而改善离体胰岛生存率14 ,15,16,17,18, 虽然 LBL 方法往往需要广泛的胰岛处理期, 以沉积多层, 这可能会损害胰岛的生存能力.此外, 依赖于生物膜层之间的静电或共价相互作用的 nanomembranes 的不稳定性, 或 nanomembranes 与胰岛表面的疏水性相互作用也引起了有关9、14,15,16,22,23,24,25,26。
另一个限制因素, 押账治疗结果门静脉胰岛移植是即时血液介导的炎症反应 (IBMIR) 引起的直接接触的植入胰岛与血液, 导致血小板聚集,凝血和不良免疫效应或不想要的细胞活化9。为解决这些问题, 制备了一种由星形聚乙二醇 (starPEG) 组成的超薄 nanocoating, 其建立的生物相容性和多功能性作为胰岛壳体材料。肝素, 一个高度硫酸盐多糖, 也被纳入 starPEG nanocoating 其抗炎, 抗凝血性能和能力, 以促进血管化通过招募促血管生成生长因子22, 23。
在本文中, 我们展示了一种 “易于采用” 的方法, 为活细胞表面工程的肝素结合 starPEG nanocoating 通过伪 bioorthogonal 化学之间的 nanocoating 琥珀组和胰岛表面膜胺组。事实上, 细胞膜内的氨基酸是非常有反应性的, 因此早期的研究报告说, 在生理条件下, 与活化的n-hydroxysuccinimidyl (NHS) 酯的主要氨基组之间的相互作用14 ,16,21。此外, 广泛的研究报告说, 肝素, 一个高度硫酸盐多糖和重要组成部分的细胞外基质, 在胰岛封装, 可导致增强后移植重建和减少 IBMIR22,23。考虑到 peg 的生物相容性和肝素的多价蜂胶性质, 在 nanocoating 制备过程中, 我们使用8臂 peg 进行最大肝素负荷。肝素的改变与-NHS, 随后将与 NH2组在胰岛细胞膜上的反应。通过使 nanocoating 之间的共价键形成-NH2 (细胞膜) 和-NHS 的丙肝, 胰岛将容易 “涂层” 的肝素结合 PEG, 从而形成一个纳米薄层 () 在胰腺的外表面胰 岛。
目前的方法不同于以前发表的方法, 也选择 PEG 作为胰岛微囊化的主要聚合物, 在这种伪 bioorthogonal 化学之间的-NHS (nanocoating) 和-NH2的胰岛细胞膜使用。考虑到胰岛/细胞涂层的稳定性, 特别是在诸如血浆等复杂的环境中, 对于移植后的血管重建和生存至关重要, 而 NHS 和-NH2之间的形成与PEG 与细胞膜间的疏水作用24、静电相互作用9、15、24、25、26或生物素之间的生物学联系链亲和素14。
此外, 与胰岛涂层方法相比, 依赖于 LBL 方法与扩展胰岛处理期的多层沉积14,16,25, 目前的技术也需要最小处理和非常短的涂层期间孤立的胰岛。这两个因素都是移植后胰岛生存的必要条件, 因为在酶消化过程中, 由于破坏了 ECM, 胰岛的存活率往往已经受到破坏。然而, 目前方法的一个局限性是, 与 LBL 不同的是, 通过增加或减少层沉积的数量, 可以控制外层涂层的厚度, 目前尚不能对 nanocoating 的厚度进行定制。
此外, 由于温和的条件, 即 NHS 和-NH2之间的化学反应发生, 目前的方法适用于活细胞表面工程不限于胰岛, 但大多数细胞治疗。此外, 考虑到肝素是已知的与一系列的细胞因子和生物活性分子, 肝炎 nanocoating 也提出了一个开放的平台, 有潜力纳入无限的生物调解人, 以及接口为更加复杂的细胞表面工程学。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢中国国家自然科学基金 (31770968) 和天津应用基金会和先进技术研究项目 (17JCZDJC33400) 的财政支持。
Reagent | |||
PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
Streptozototin | Sigma | S0130 | |
Histopaque | Sigma | 10831 | |
RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |