Summary
簡易 3 D 識別定義されているプロトコルを使用して hPSCs の媒体と初期の上皮細胞内構造を有する細胞集塊を生成できると関連付けられている小脳のマーカーだけでなく、オプションの肯定的な成長因子を減少機能的なニューロンを生成する単分子膜として分化細胞の 2 D 変更。
Abstract
複雑性と微分のプロトコルのコスト低減は、研究者にとって重要です。この関心は、外因性パターン形成要因がひと多能性幹細胞 (hPSC) に脳の発達や病気の表現型をマスキングなどの病態モデルに導入する可能性があります可能性のある意図しない影響についての懸念に適合します。ここでは、hPSCs、設計の簡単な起動方法、パターン形成因子の減少と以前プロトコルよりも材料の要件以下の 2 つの小脳分化プロトコルを提案する.最近では、我々 開発培養プロシージャは、sub/心室ゾーンなど脳の発達のモデル化に関連して菱形の形態を含む他の脳「における」プロトコルと一貫性のあるフローティング 3 次元 (3 D) 製品を生成唇状の構造物。2 番目は、製品小脳関連マーカー陽性ニューロンのようなカルシウムの流入を展示と機能的な小脳ニューロンを生成することが示されている完全な分化に付着、2次元単層プロシージャを使用します。一緒に、これらのプロトコルは科学者合理化された神経分化の他の種類のテストの基本的なモデルと同様、別の研究目的に適したのオプションの選択肢を提供しています。
Introduction
生体内で小脳の発生1,2,3、4を模倣するという原理に最初小脳系統へ hPSCs を区別するための in vitroプロトコルが運営しています。など、彼らはプロ小脳パターニングと成熟を駆動する特定時に導入した因子の継承が必要です。これらの中で最高、wnt シグナルをした骨形成タンパク質 (Bmp) と辷りオーガナイザー5,6、7の中間後脳発達と形成に知られている役割を持つ線維芽細胞成長因子 (Fgf)。もちろん、各追加の手順と因子研究員、労働集約的な操作および大きい費用の増加を意味し、関心のあるのでより簡単なプロトコルと同じ結果を達成するための能力を開発します。細胞がこのようなタイトな外部制御の開発で体外を必要とするかどうか、この実用的な問題は仮定の質問とうまく合致します。
小脳分化の 2015 年に公開されたプロトコルによるパターンの目的8FGF2、FGF19、間質細胞由来因子 1 (SDF1) を使用して、成長因子の豊富な数を使用しての必要性に対処。本研究はまた浮遊三次元培養システムを用いた前小脳プロトコルから異なっていた。細胞陽性小脳マーカーに加え、彼らの技術によって生成される"脳"オルガノイドは関連する形態、菱形の唇のような構造などの伝統的な 2次元単層培養で使用できないを展示する示されていた。複雑な成長因子、96 ウェル プレート (96WPs) で統一された胚様体 (EBs) 文化の形成などその他の機能に関して高価は低くなりますがそれ複雑な手続き中に行われた最初のステップ。3 D の他のプロトコルは、同じ年に発行された、一般的で安価な細胞培養技術9を使用して神経系統への正常な分化を報告しました。このグループは、皮質小脳分化ではなく調査していたが小脳分化の彼らの概念の適用は割引されませんでした。
我々 は最近パターン化要因の数が減少を使用して 3 D 小脳分化プロトコルを報告した (すなわち、FGF2、4、および 8)、中規模要件10を最小限に抑える全体 6 ウェル プレート (6WPs) の細胞を保つことによってセットアップの簡略化だけでなく。顆粒細胞の生産を支援するために滑らかアゴニスト (SAG) は、最終的な成熟のステップ中に使用されました。サグは顆粒細胞前駆体調査生体内で1,2,の育成の推進におけるその役割のために、以前小脳プロトコルで使用されていたソニック ・ ヘッジホッグ (SHH) により安価な化学の代替11,12,13。差別化製品は、形態学的に関連する構造8,9の小脳関連マーカーの存在を含め、他の 3 D プロトコルからと一致しました。このような結果は、擬態の詳細以前のメッセージを強化[生体内の環境必要はないかもしれませんの複雑な 3 Dの in vitro分化プロトコル。
3 D プロトコルに加えてこのレポートは同じのクイック セットアップでは、基本的な材料は、設計された 2D プロトコルをについて説明します、成長因子の数を削減します。早期に関連付けられたマーカーの陽性、ヒト胚性幹細胞 (hESCs) からの細胞を作り出すことができる、誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) 神経、小脳、および顆粒細胞の id。また、カルシウム イメージングは、機能的な人間ニューロンの存在を示します。プロトコルの間を選択する能力はいずれかに興味のある方、研究者のレベルの柔軟性を追加します: (1) 生成する特定のセル型、(2) モデルの人間の脳の開発と関連する構造、単分子膜の最適化解析 (3)設定 (例えば、ホールセル記録)、または混合神経文化 (4) 細胞間の相互作用。そのシンプルで低コストの性質はそれら hPSC フィールドに新しい、または分化オプションを更に探検するから基本 hPSC プロシージャを必要者のアクセスになります。
Protocol
1. 準備
注: すべてのステップ材料表を特定の項目を参照してください。
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HPSC 文化の定義 500 mL hPSC 培地を準備します。
注: 手順 2.1 2.6 メディアを使用します。- HPSC 中サプリメント一晩 (o/n) 4 ° C で融解します。中瓶から hPSC 基本培地中の 12.5 mL を削除し、追加サプリメント、2.5 mL (100 U/L を作る) 10 mL ボトルにペニシリン/ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌)。
- 4 ° C で保存し、2 週間以内に使用します。
注: hPSC メディアは、10 μ M ロック阻害剤 (RI) および 10 %dmso を追加することによって、細胞を凍結する使用ことがあります。
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分化誘導培養用 1 L ニューラル保守メディア (NMM) の準備します。
注: 手順 3.1 4.4 メディアを使用します。- ミックス グルタミン強化 DMEM/F12 とニューラル基本培地 (1:1) 1 L のボトル、(1 x) N2 サプリメントで、サプリメント、(1 x) B27 を補う、5 μ g/mL インスリン、1.5 mM 100 μ M 非必須アミノ酸 (NEAA)、L-グルタミン 100 10 μ M と U/L ペン/連鎖球菌、β-メルカプトエタノール。
- 4 ° C で媒体を保存し、3 週間以内に使用します。
注: サプリメントを基礎培地の混合に追加する前に、ストック濃度に基づいて追加の部品の必要量を調整するための適切なボリュームを削除します。
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HPSCs を継の 0.5 mM EDTA 作業溶液 500 mL を準備します。
注: 手順 2.4 および 2.5 メディアを使用します。- フロー-フードの下で 50 mL のチューブに 500 mL 滅菌 PBS ボトルから 49 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を転送します。0.5 M の EDTA の 0.5 mL と塩化ナトリウム 0.9 g を 50 mL のチューブに追加します。ゆっくり溶解するミックス。
- フィルター滅菌ソリューション 500 mL 滅菌 PBS ボトルに 0.22 μ m のフィルターおよび転送を使用します。常温 (RT) を格納します。
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HPSC 文化の hPSC の培養皿を準備します。
注: は、手順 2.1-2.6 のプレートを使用します。- HPSC 適切な付着性コーティング (PAAC) の実用的なソリューション x 50: PAAC o/n 4 ° C でのバイアルを解凍DMEM/f12 キーと転送と 1:1 の比率で PAAC を 1.5 mL チューブに 400 μ 因数として希釈します。50 x 作業ソリューション PAAC-80 ° C で保存します。
注: (重要) PAAC は、RT で迅速に固化、その氷の上 (または 4 ° c) (DMEM、管、等) のすべてのコンポーネントが格納されている必要があります。 - 4 ° C で実用的なソリューション PAAC x 50 のチューブを解凍し、冷たい DMEM/f12 キーで 50 倍に希釈します。希釈 PAAC の 750 μ L/ウェルを 6WP に追加します。37 ° C で少なくとも 1 h 用プレートを孵化させなさい
メモ: PAAC プレートは 4 ° C で 1 週間 1 時間の潜伏期間の後、プレートをラップすることによって保存可能性があります。使用する前に 37 ° C に暖かいプレート。
- HPSC 適切な付着性コーティング (PAAC) の実用的なソリューション x 50: PAAC o/n 4 ° C でのバイアルを解凍DMEM/f12 キーと転送と 1:1 の比率で PAAC を 1.5 mL チューブに 400 μ 因数として希釈します。50 x 作業ソリューション PAAC-80 ° C で保存します。
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分化の付着防止 (AA) プレートを準備します。
注: は、手順 3.1 4.1 のプレートを使用します。- 5 mg/mL を作るポリ (メタクリル酸 2-ヒドロキシエチル) 95% (ポリ HEMA) 水溶液エタノール。明確な解決策が得られるまで、37 ° C で o/n を振る。室温ストア
注: 0.22 μ m のフィルターを通してフィルタ リング不溶ポリ HEMA を削除できます。 - 培養プレートにポリ HEMA を追加、各ウェルの底をカバーします。37 ° C でプレートを 2 日間、インキュベートし、井戸の制服/液体コーティングの完全に蒸発できるようにプレートを確認します。AA 板をラップし、室温保存されている可能性があります。
- 5 mg/mL を作るポリ (メタクリル酸 2-ヒドロキシエチル) 95% (ポリ HEMA) 水溶液エタノール。明確な解決策が得られるまで、37 ° C で o/n を振る。室温ストア
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ポリ-L-オルニチン/ラミニン (PLO/ラム) プレートを分化誘導培養の準備します。
注: は、手順については 4.2 4.4 プレートを使用します。- コート 20 μ G/ml PLO 滅菌 PBS に溶解を使用して井戸の表面の面積。プレートの o/n 37 ° c. で孵化させなさいPLO を吸引、PBS で 3 回をすすいでください。
注: PLO (オプション) Incubated 板がラップ、必要になるまで 4 ° C で保存します。 - PLO コーティング井戸の表面積をコート、10 μ g/mL ラムを使用して滅菌 PBS に溶解しました。37 ° C で少なくとも 2 時間または o/n 4 ° C でインキュベートします。ラムを削除および洗浄井戸 PBS で 2 〜 3 倍、適切な媒体および/または細胞をすぐに追加。
注: (省略可能) 削除ラム ソリューション 4 ° C で保存して再使用できる 2 回まで。(重要)乾く; ラム塗装面を許可しません。防ぐために、これはすぐに PBS または適切なメディアを追加します。
- コート 20 μ G/ml PLO 滅菌 PBS に溶解を使用して井戸の表面の面積。プレートの o/n 37 ° c. で孵化させなさいPLO を吸引、PBS で 3 回をすすいでください。
2. プロトコル 1: 無料のフィーダー hPSC 文化
注: hESCs 非営利組織から得られた (H01 をライン、材料表を参照)。三行による制御 (hvs51、60、および 88) (線維芽細胞が匿名、匿名のドナー由来と IRB 承認したがって免除) 3 つの健康な人間の患者線維芽細胞をリプログラミングによって生成された10, 17。
- フィーダー フリー培養で hPSCs を維持します。
- 融解と hPSC 培地で PAAC プレートの上に hPSCs をめっきした後 (手順 2.2 を参照)、5% CO2と 37 ° C で hPSCs を維持します。HPSC 中毎日更新 (手順 2.3 を参照)、日除く融解または通過後と顕微鏡下で細胞を検査 (目標: 5 x/0.12 2.5x/0.06 10 x/0.25 Ph0 Ph1) 観察成長率し、分化 (図 3 の潜在的な領域を特定するには、上部左側のパネルは、分化の例を示します)。
- HPSCs すべての 3-4 日の通路またはとき文化に達する > 80% 合流。かどうか細胞展示の分化、メソッドを通過使用通常 hPSC の 5% 未満 (を参照してくださいステップ 2.4)、穏やかな方法を使用して、それ以外の場合 (ステップ 2.5 を参照してください)。文化の必要のない長期保存 hPSCs が凍結される可能性があります (ステップ 2.6 参照)。
- HPSC 中 hPSCs を解凍します。
- 解凍処理 (9 mL/低温管) の生殖不能の管に、解凍されたセルを受信する準備ができて PAAC プレートに hPSC 媒体の必要量を転送します。10 μ M RI で両方のチューブ内の媒体を補完します。
- 水浴 (37 ° C) に直接 LN2ストレージと場所から、cryotube を取得します。ときのみ小さな氷の結晶のまま、風呂の水から削除、解凍過程の管に極低温の管の内容を転送 (合計量 10 mL)。室温 5 分 290 x g でチューブを遠心分離します。
- 血清ピペットを使用して削除、PAAC PAAC プレートの井戸からソリューション (手順 1.4 参照) 細胞を受け取り、10 μ M RI hPSC 媒体を追加するもの。
注: (重要) はない吸引吸引針やそれで PAAC ソリューション可能性がありますを固めるし、真空ポンプに線を詰まらせます。 - チューブから上澄みを除去し、10 μ M RI と hPSC 培地で細胞を再懸濁します。1 低温チューブ/6WP の井戸の比率で行先プレートに細胞を配布します。5% CO2、37 ° C で、1 日中を更新しないでください。
注: 5% O2セル始動と細胞生存率が増加します。
- HPSC 媒体を更新します。
- HPSC 中 RT の生殖不能の管または湯せん; に必要な量を温める6WP の 2 mL/よくお勧めします。
注: (省略可能): hPSC 中の余分な量を追加すると、hPSCs が更新; することがなく特別な日に残ることができます。ただし、ことはできませんこの週に 1 回以上。 - HPSCs を含む井戸から培地を吸引し、新鮮な hPSC メディアを追加します。
- 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで hPSCs の文化.
- HPSC 中 RT の生殖不能の管または湯せん; に必要な量を温める6WP の 2 mL/よくお勧めします。
- HPSC 中通路 hPSCs
- HPSC 中の必要量を継プロセスと継代細胞を受信する PAAC プレートの準備のための生殖不能の管に転送します。10 μ M RI と行先プレートのための媒体を補足します。常温または水浴中管を暖めます。
注: の準備と処理は 1 つよりも代替塗装材料を使用して材料の表に記載されている場合に異なります。 - 血清ピペットを使用して削除、PAAC PAAC プレートの井戸からソリューション (手順 1.4 参照) 細胞を受け取り、10 μ M RI hPSC 媒体を追加するもの。
注: (重要) はない吸引吸引で PAAC ソリューション針、固めるし、真空ポンプに線を詰まらせることがあります。 - 継代する、二度と 0.5 ミリメートルの EDTA、細胞を洗浄し、0.5 mM EDTA を追加、37 ° C で 2-5 分間インキュベートする hPSCs と井戸から培地を吸引します。
注: 6WP の 1 mL/井戸は EDTA の洗濯とインキュベーションの十分な量です。 - 顕微鏡の下の井戸を確認 (目標: 5 x/0.12 2.5x/0.06 10 x/0.25 Ph0 Ph1)。セルは、デタッチし始めている場合、は、EDTA 溶液とフラッシュ セル hPSC 媒体を使用して無料を吸い出しなさい。
注: (重要) 世話を EDTA を吸引するときに全体の hPSC のコロニーを削除しないこと (全体のコロニーを切り離すまでは待機しない)。フラッシュしませんセル 5 回以上害を hPSCs と多能性に影響を与える可能性があります。また、細胞再プレートに準拠していることがありますので、井戸からセルをフラッシュする前に RI と hPSC 培地でスタンドを聞かせてはいけません。 - 分割比率 1:4-1 を使用して行先プレートのウェルに hPSCs を転送 (通常は合流、植民地、および成長率のサイズに関連) 経験的な決定に基づいて、: 16 (すなわち、1 よく元の板から先の 4 の井戸にプレート)。5% CO2、37 ° C で、1 日中を更新しないでください。
注: 1:16-1:20、混雑を防止し、コロニーの外観を改善することが可能高の比で分割します。
- HPSC 中の必要量を継プロセスと継代細胞を受信する PAAC プレートの準備のための生殖不能の管に転送します。10 μ M RI と行先プレートのための媒体を補足します。常温または水浴中管を暖めます。
- 穏やかな方法 (G メソッド) を使用して通路 hPSCs
- 生殖不能の管、passaging のプロセスと継代細胞を受信する PAAC プレートの準備のために hPSC 媒体の必要量を転送します。10 μ M RI と行先プレートのための媒体を補足します。暖かい中管、RT、37 ° C の水浴
- PAAC プレートの井戸から削除 PAAC ソリューションに使用血清ピペット (手順 1.4 参照) 細胞を受け取り、10 μ M RI hPSC 媒体を追加するもので。
注: (重要) 行う吸引 PAAC 吸引針やそれでない可能性がありますを固めるし、真空ポンプに線を詰まらせます。 - 継代するのに hPSCs の井戸から培地を吸引し、2 回 0.5 mM EDTA を用いた細胞を洗ってください。2 番目の洗浄、EDTA、吸引する前に待機 30 s に 1 mL の PBS を追加し、37 ° C で 4 9 分間インキュベート待っている間、4 ml の PBS の生殖不能の管を準備します。
注: 6WP の 1 mL/ウェルは、EDTA の十分な量を洗浄です。 - 顕微鏡の下の井戸を確認 (目標: 5 x/0.12 2.5x/0.06 10 x/0.25 Ph0 Ph1)。セルがデタッチする場合、慎重に無料コロニーのために板の側面をタップします。とき > 植民地の 50% が自由に動きます、4 mL の PBS を含む管に 1 mL の PBS に植民地を転送する 5 mL の血清ピペットを使用 (はないカップ刻んだ)。
注: (重要) hPSC 文化をきれいにする目的であるので、セルのままを区別するかどうかを判断するチェックはプレートに取り付け。また、用いる井戸のこのプロセスは、接続されたまま植民地が残ることがありますのですべての植民地を通過する必要はありません。 - チューブに定住する細胞のための RT で 5-10 分を待つ (遠心しない)。PBS を解決 hPSCs を削除しないように注意してチューブから吸引します。慎重に hPSC 培地で細胞を再懸濁します (はないカップ刻んだ)、し、セルを分割比率 1:4-1 を使用して行先プレートに転送: 16。5% CO2、37 ° C で、1 日中を更新しないでください。
- HPSCs ダウン凍結します。
- 合流、によって LN2で貯蔵のための 1-2 凍結バイアルを記入する (最大) 文化では、2-3 日で hPSCs の 1 を使用します。
- 2.5 を継 (ステップ) の終わりには、500 μ L を使用してまたはそれぞれ 1 または 2 の凍結バイアルを転送する hPSC 培地 1 mL のセル 6WP の 1 から (500 μ L/バイアル)。各管に凍結中含まれている hPSC、20 μ M RI、および 20 %dmso × 2 の 500 μ L を追加します。
注: (オプション) 細胞は、培地 1 mL/バイアル凍結 × 1 で直接転送できます。 - 4 ° C、-80 ° c. ですぐに店に事前冷却 (イソプロパノールを含む)、低温コンテナーでクライオ チューブを配置します。
- 次の日、長期保存用 LN2タンクに極低温の管を転送します。
3. プロトコル 2: 3 D」における「分化
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HPSCs の継の変更された G による分化のセットアップ
- 生殖不能の管に先の井戸の数の NMM の必要量を転送します。Ng/mL FGF2 および 10 μ M RI 4 で補います。常温、または 37 ° C の水浴中管を温める
注: オリジネーション井戸の合流によって hPSCs が集中して 2:1 または 3:1 の行先プレートへの配布中 2.5 mL/ウェルの最後の容積との比 (すなわち、行先プレートの 1 に元のプレートから 2 井戸)、6WP。 - 区別されるべき hPSCs を含む井戸から培地を吸引し、2 回 0.5 mM EDTA を用いた細胞を洗ってください。2 番目の洗浄、EDTA、吸引する前に待機 30 s に 1 mL の PBS を追加し、37 ° C で 4 9 分間インキュベート待っている間、4 ml の PBS の生殖不能の管を準備します。
注: 6WP の 1 mL/ウェルは、EDTA の十分な量を洗浄です。(重要)解凍後最後の一節と、少なくとも 1-2 通路後 3 日間の培養よりももはやだった hPSCs を使用することをお勧めします。 - 顕微鏡下で井戸を確認 (目標: 5 x/0.12 2.5x/0.06 10 x/0.25 Ph0 Ph1)。セルは、デタッチし始めている、プレートの両側に穏やかな軽くたたくことによって細胞を無料します。管内 5 mL ピペットで 4 mL の PBS のセルに転送します。
注: (重要) 光フラッシュおよび製粉許可する植民地分割が、バラセルを収集、プレートに付着のままセルを無視します。 - 重力分離のため常温では、10 分間座っている管を許可します。必要に応じて、セルを軽く遠心 (ない 5 分の常温では、200 x g 以上) 必要な場合。
- 解決 hPSCs を削除しないように注意してチューブから吸引 PBS 4 ng/mL で NMM で細胞を再懸濁します FGF2 と 10 μ M RI 後 2:1 または 3:1 の比率で AA コーティング プレートに配布。5% CO2、37 ° C で、必要でない限りは、3 日間、培地を更新しない (3.2.1 の手順を参照してください)。
注: (オプション) セルを転送の利便性、分布、前に行先プレートの井戸に培地の部分を追加しより小さいボリュームで細胞を再懸濁します。また、hPSCs を染色、正確な開始セル密度を定義するカウント可能性があります。ただし、行先プレートの最終的なボリュームは、6WP の 2.5 mL/井戸をする必要があります。
- 生殖不能の管に先の井戸の数の NMM の必要量を転送します。Ng/mL FGF2 および 10 μ M RI 4 で補います。常温、または 37 ° C の水浴中管を温める
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37 ° c (5% CO2) 浮遊分化を維持します。
- プレート中の色、死んだ細胞、クランプ、よく底に付着・蓄積の変化を毎日確認してください。
- オプション: 中型の変更スケジュールに関係なく更新 (リフレッシュなしの最初の 3 日間) を含む培地になっている場合、黄色し、媒体変更/更新 (ステップ 3.3) の指示に従ってください。細胞の大半が死んだ場合、比重分離法 (ステップ 3.4) と媒体変更/更新の指示に従います。
EBs の形成と大細胞凝集体への成長が期待されるメモ: しかし、セルとセルの集計することができます個々 の成長・増殖によらない大量に一緒に群生します。これは観察は、大衆を分割する光の製粉は許容です。セル開始 AA 板表面に付着する場合残りの井戸の内容を浮動新しい井戸に直接転送または媒体の変更/更新の処理中に転送されます。プレートを遵守してセルを転送しないでください。
- オプション: 中型の変更スケジュールに関係なく更新 (リフレッシュなしの最初の 3 日間) を含む培地になっている場合、黄色し、媒体変更/更新 (ステップ 3.3) の指示に従ってください。細胞の大半が死んだ場合、比重分離法 (ステップ 3.4) と媒体変更/更新の指示に従います。
- 3 日目、4 ng/ml FGF2 NMM に媒体を変更します。媒体の他の毎日を更新します。
- 7 日に媒体を変更 NMM 1 μ m 4 ng/mL FGF2、100 ng/mL FGF8B、レチノイン酸 (RA)。媒体の他の毎日を更新します。
注: (重要) RA は光に敏感な。RA 文化サンプルを光から保護します。 - 14 日に 100 ng/mL FGF8B、100 ng/mL、FGF4 20 ng/mL FGF2 と NMM に媒体を変更します。媒体の他の毎日を更新します。
- 17 日には、100 ng/ml の FGF8B 媒体を NMM に変更します。媒体の他の毎日を更新します。
- 21 日に媒体を 100 ng/ml の脳由来神経栄養因子 (BDNF) NMM と 10 ng/mL グリア由来神経栄養因子 (GDNF) に変更します。媒体の他の毎日を更新します。
- 28 日に 100 ng/mL BDNF と 10 ng/mL 3 ng/mL サグ、100 ng/mL 神経栄養因子 3 (NT3) と 25 mM KCl. リフレッシュ中他毎日 GDNF NMM に媒体を変更します。
- 35 日、分析のための 3 D オルガノイドを収集します。
- プレート中の色、死んだ細胞、クランプ、よく底に付着・蓄積の変化を毎日確認してください。
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変更/更新 3次元培養用分化培地
- (コンポーネントのスケジュールの手順 3.2.2-3.2.7 を参照)、適切なコンポーネントと NMM の必要量を生殖不能の管に転送します。37 ° C の水浴中で暖かい
- ヒント: プレートとセルが井戸の底の端に解決まで軽く振る。慎重に、細胞の除去を回避、血清ピペットを使用して古い培地 2 mL を削除し、新鮮な培地 2 mL を追加します。5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。
注: 終わり (重要) ボリュームは 2.5 mL/6WP の井戸をする必要があります。蒸発が発生した場合は昔の媒体だろう乾燥細胞培養; さらに 2 mL を削除しないでください。その代わりに、余分なメディアを追加します。
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変更/更新重力分離と分化培地
- 適切なコンポーネントと NMM の必要量を生殖不能の管に転送します。37 ° C の水浴中で暖かい
- 生殖不能の管に井戸の内容を転送でき、重力分離のため常温では、10 分間座っている管。
- ピペットを使用してチューブから古いメディアを削除する、世話を削除しないこと、細胞、適切なコンポーネントと NMM で再懸濁しますが落ち着いた、新しい AA コーティング井戸に配布。5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。
注: (オプション)、先に利便性、培地の一部を追加可能性がありますは井戸分布を低いボリュームで再停止されるセルを差別化する前の。最後のボリュームは 2.5 mL/6WP の井戸をする必要があります。
4. プロトコル 3: 代替 2D 分化
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開始し、12 日目を通して 3 D プロトコルのセクション 3 に従って手順を使用して、カルチャを維持
- ステップ 3.1 3.2.3 と 3.3 と 3.4 の手順に従って変更/更新中に従ってください。
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切り替えて、2次元単層培養として維持
- 分化の 13 日、重力分離 (ステップ 3.4) を変更/更新中の指示に従い、セル/集計 PLO/ラム コーティング プレートの配布のみ (手順 1.6 参照) 2.5 mL/6WP の最後の容積と。
注: 媒体は、10 μ M RI と初期めっき密着性と細胞の生存を助けるために補うことができます。(重要)低密度または板、混雑を避けるために、必要に応じて (手順 4.4 参照) を通過する、井戸のセルを均等に分散することをお勧めします。PLO/ラム コーティング プレート(すなわち6WP、12WP 等)の推奨サイズ必要があります経験的に決まります、細胞株の増殖率と製品の目的に基づきます。命令は、6WP、ためボリュームを与えるし、よく数 (すなわち6WP、1 mL のmL/ウェル/12WP 等は、2) の各倍増のため半減、変換できます。 - 14 日に 100 ng/mL FGF8B、100 ng/mL、FGF4 20 ng/mL FGF2 と NMM に媒体を変更します。4.3 の手順に従って、他の毎日メディアを更新します。
- 17 日には、100 ng/ml の FGF8B 媒体を NMM に変更します。4.3 の手順に従って、他の毎日メディアを更新します。
- 21 日に 100 ng/ml の BDNF NMM に媒体および 10 ng/mL GDNF を変更します。4.3 の手順に従って、他の毎日メディアを更新します。
- 28 日に 100 ng/mL ・ BDNF と 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL サグ、100 ng/mL NT3 と 25 mM KCl. リフレッシュ中 4.3 の手順に従って、他の毎日 NMM に媒体を変更します。
- 35 日の分析のための細胞を収集または拡張文化 (潜在的な制限をテストしていません) のステップ 4.2.5 として同じ媒体で維持します。
- 分化の 13 日、重力分離 (ステップ 3.4) を変更/更新中の指示に従い、セル/集計 PLO/ラム コーティング プレートの配布のみ (手順 1.6 参照) 2.5 mL/6WP の最後の容積と。
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変更/更新二次元文化の分化培地
- (コンポーネントのスケジュールの手順 4.2.2-4.2.5 を参照)、適切なコンポーネントと NMM の必要量を生殖不能の管に転送します。37 ° C の水浴中で暖かい
- 井戸から培地を吸引し、2 mL の新しい媒体を追加します。5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。
注: 2.5 mL/6WP、ピペットを使用して古い培地 2 mL を削除して、新鮮な培地 2 mL を追加するのも、(省略可能) 最後のボリュームを維持できます。昔の一部を取っておく井戸と空気の接触から防ぐ細胞中がステップの変更中にセルへのショックを軽減します。
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通路 2 D 分化
- プロセスを通過のための生殖不能の管に転送 (コンポーネントのスケジュールの手順 4.2.2-4.2.5 を参照)、適切なコンポーネントと NMM の必要量と、別に、PLO/ラムを準備する継代細胞を受信するためのプレートをコーティングします。10 μ M RI と行先プレートの中を補足します。常温、または 37 ° C の水浴中チューブを暖かくコンポーネントに保存、passaging プロセス中に細胞を洗浄するため単独で NMM を使用することが可能です。
注: (重要) カルシウム イメージング製品を使用する場合は実験、通路細胞分化の終わりの前に 2-6 日間を確保します。 - 継代する井戸から培地を吸引します。トリプシンによる解離剤 300 μ L/ウェルを追加 (材料の表を参照)、旋回板井戸をカバーし、解離エージェントをすぐに削除します。
- RT で 2 分間座っているプレートを許可し、プレートの側面をタップしてセルを緩めます。600 μ L/ウェル定義トリプシン ・ インヒビター (DTI) を追加し、5 ml の NMM の生殖不能の管に DTI のセルを転送します。
- 吸引した媒体で 15 分 290 x g でチューブを遠心分離し、別 5 mL NMM をチューブに追加します。
- 吸引した媒体で 15 分 290 x g でチューブを遠心し、RI を含む適切な培地で細胞を再懸濁します。
- 1:1 1 の分割比を用いた PLO/ラム プレート上のセルを配布: 12 初期合流、増殖率とサイズの行先プレートに起源の差に応じて 5% CO2と 37 ° C で維持。
- プロセスを通過のための生殖不能の管に転送 (コンポーネントのスケジュールの手順 4.2.2-4.2.5 を参照)、適切なコンポーネントと NMM の必要量と、別に、PLO/ラムを準備する継代細胞を受信するためのプレートをコーティングします。10 μ M RI と行先プレートの中を補足します。常温、または 37 ° C の水浴中チューブを暖かくコンポーネントに保存、passaging プロセス中に細胞を洗浄するため単独で NMM を使用することが可能です。
Representative Results
2 D と 3 D の小脳分化プロトコルを考慮し低成長の視覚的な概要
外因とめっきの時刻を識別する 2 D と 3 D 小脳分化のプロトコルでは、全体的なタイムラインを図 1に示します。図 2に 3 D 小脳分化を受けている hPSCs の典型的な進行状況を示す: フィーダー フリー培養日 0 (左図); で始まる植民地として悪名高く行 H01 と日 2 (中上); による EB 形成を受ける次の日 14 (右上); RA と FGF8 神経誘導明らかルーメンと大きい細胞凝集塊に成長さまざまなサイズと形状で 28 日 (左下); の総計を形作る28 (中下); の日に示される単一集合体の構造の異なる複雑さの開発35 日で同じ構造 (右下) に形態学的変化を続けた。図 3に描かれている 2 D 小脳分化を受けている hPSCs の典型的な進行状況: hESC にフィーダー フリー培養日 0 (hESC の植民地の間で区別されたセルの領域を示す円と、図の左上) の植民地として H01 を行;日 2 (中上); による EB 形成を受ける次の日 13 (右上); RA と FGF8 神経誘導明らかルーメンと大きい細胞凝集塊に成長(左下); 14 日でめっき付着細胞として増殖そしてより多くの複合体/成熟した形態と細胞の単層として [低 (中下) と高倍率 (右下) 35 日。
3 D 製品展示マーカーと初期の神経上皮の構造
図 2(下の左画像)図 4確率のマージし同様に、成長や成熟率の変化や、骨材の分割による養殖全体に見られる 3 D 集計形態の不均一性を示し。不均一性にもかかわらず各分化は免疫細胞化学 (ICC)図5 染色によって示される小脳顆粒マーカー ZIC1 を含む初期の神経は、神経細胞マーカーを示す集計を生成します。もっと重要なは、図 5と図 6は、減らされた成長因子で、単純な 3次元培養が初期神経上皮や菱形リップなど脳の発達に関連する複雑な構造を持つ集合体を生成することが示唆されました。
2 D 製品展示小脳マーカーと機能の神経活動
複雑な 3次元構造を再現できないのは、2 D の文化、ICC 染色図 7で示されるように、小脳顆粒細胞のマーカー ZIC1 を含む初期の神経は、神経細胞マーカーを示す細胞を生成することができるが。RT-PCR による遺伝子発現解析図 8に見られるように初期顆粒細胞のマーカー ATOH1の存在は実験と線の間の変数が ICC 染色結果をサポートします。カルシウム イメージングは、2 D の文化でより簡単に処理されます。補足のビデオ 2補足のビデオ 1図 9からわかるように、電気刺激細胞は機能的なニューロンの生成を示唆している神経細胞の発火パターンの代表的なカルシウムの流入を示します。
図 1: 分化プロトコル (分化の日 0 から始まる) のタイムライン。実線ボックスを示す点線のボックスがオプションの 2 D 加工のプレート コーティングを示すし、特定の要因は、培養液に追加されます。FGF2、下向きの矢印は、低濃度 (4 ng/mL)、上向きの矢印は高濃度 (20 ng/mL) を指します。この図は、ホームズとハイネの10から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 3 D プロトコルの代表明視野イメージ。d0 d2 で EBs の hESC 植民地誘導 d14 で違うサイズの形態 (番号 1-5) d28、d28 で、(手紙、-のcで示される) ユニークな個人レベルの機能を備えた単一の集計で集計集計とd35 で同じ機能で目に見える変化は。スケールバー = 100 μ m。この図は、ホームズとハイネの10から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 2次元プロトコルの代表明視野イメージ。hESC コロニー d0、d2 で EBs を d35 で成熟後、d14 で集計をメッキでは 5 倍の倍率と 20 倍の倍率で見られる後で d13 の誘導後集計します。上の左側のパネルに白い円は、hESC の植民地の間で区別されたセルの領域を示しています。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 明視野イメージ 3 D の文化のさまざまなサイズと複雑さを示すします。集計は (A) 8 日目 (hESCs)、および (B) d35 (hiPSCs)。後者の画像は、全体の集計を表示する 3 つの別々 の画像で構成されます。両方の集計は、小さい骨材の損失 (中断) 構造の結合によって影響されている可能性があります。スケール バー 200 μ m を =。この図は、ホームズとハイネの10から再発行されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 3 D 製品の ICC 画像表示関連マーカーおよび構造体。文化 d35、3 D 製品展示: PAX6 (緑)、TBR2 (赤) 神経のロゼットのような形成の内腔で (最初の行)。DCX (緑) と外側の端心室ゾーン (VZ) から広がる NeuN (赤)-(2 列目) のような構造;KIRREL2、小脳の神経上皮に関連付けられたマーカー (3 列目、左)。そして ZIC1 マーカーに関連付け小脳顆粒細胞 (3 番目の行、右)。4 つの異なる hPSC ラインを使用して複数回実験を行った: hESC ライン H01 (n = 5) と iPSC 線 hvs88 (n = 4)、hvs60 (n = 3)、および hvs51 (n = 1)。矢印の指す菱形リップ (RL) の構造のような。スケールバー = 100 μ m。この図は、ホームズとハイネの10から再発行されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 3 D 製品で大規模な心室のゾーンのような構造です。文化 d35 で悪名高く派生集約は PAX6 (緑) と TBR2 (赤) 心室ゾーン (VZs) と脳室下帯ゾーン (SVZs)、 in vivo内で見つかった初期のニューロンに関連する一般的です。(Top)アスタリスク (*) マーク VZ 専攻/深さを示す角かっこで、骨材のエッジに沿って実行している VZ のような地方の根尖側 SVZs (中央) 結合される信号は、PAX6 の散乱セクションを表示/+/TBR2 セル上部の右側の終わりの方のサイズが大きく。新築マンション。(下)中央のパネルの四角形で示されるセクションの高倍率画像。スケールバー = 100 μ m。この図は、ホームズとハイネの10から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 2 D 製品の ICC イメージが関連するマーカーを表示します。2 D 製品展示、hESCs (上の行) と hiPSCs (下の行)、細胞の肯定的な文化 d35 で: 顆粒細胞のマーカー ZIC1 と渡り鳥の小脳神経細胞マーカー TAG1 (左の列)。神経マーカー ニューロ フィラメント (NF)、TAG1 (右の列)。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 2 D 製品の RT-PCR 。hESC ライン H01 の mRNA 発現解析 (上の行) とによるライン hvs60 (下段) 2 D の終わりにプロトコルを示しますゲル電気泳動と製品: 顆粒細胞のマーカー ZIC1、顆粒細胞のマーカー ATOH1、渡り鳥の小脳神経細胞マーカーに、TAG1、プルキンエセル マーカー カルビンジン (CALB)、電位依存性カルシウム チャネル CACNA1A (C 1 a)、CACNA1E (C 1 e)、γ-アミノ酪酸 (GABA) B 受容体 1 (G Br1)、およびハウスキーピング遺伝子 EIF4G2)。
図 9: 2 D 製品のカルシウム イメージング分析します。文化 d35 で hPSC 分化製品は fluor5 色素の孵化後、顕微鏡下で 2 分間に記録されました。30 s、10 セル電気刺激 s で 10 Hz。 (A) が 0 でショー hESCs を静止画像 (左) と 30 分の電気刺激開始後 s (右)。矢印は、カルシウム流入の解析 (ROI) 関心領域を示しています。投資収益率の時間に対する相対的な蛍光の変更を (B) のグラフィカルな分析を示す (蛍光の変化 = (F F0)/F0、どこ F0 = (∑F1 n)/n) 前に中、後に発生するニューロンのような穂状花序を持つ刺激。黒いバーは、電気刺激の長さを示します。スケール バーの (白) = 50 μ m フル録画 hESC (ここに見られる) と、(表示されていません) による回線利用補助のビデオ 1で補助ビデオ 2、それぞれ。レコーディングは、4 倍のスピードでの avi ファイル形式です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足ビデオ 1: カルシウム hESC ライン H01 から 2 D 製品のビデオ イメージングします。文化 d35 で H01 は fluor5 の孵化後、顕微鏡下で 2 分間記録された悪名高くラインから差別化製品を染めます。30 s、10 セル電気刺激 10 Hz の. 録音で s が 2 フレーム/秒で行われ 〜 7 フレーム/秒 〜 30 を永続的なビデオの制作で AVI ビデオに加工 s 〜 4 倍速で。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足ビデオ 2: カルシウム イメージングによるライン hvs51 から 2 D 製品のビデオします。文化 d35 で差別化製品によるライン hvs51 からは fluor5 色素の孵化後、顕微鏡下で 2 分間に記録されました。30 s、10 セル電気刺激 10 Hz の. 録音で s が 2 フレーム/秒で行われ 〜 7 フレーム/秒 〜 30 を永続的なビデオの制作で AVI ビデオに加工 s 〜 4 倍速で。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Discussion
複雑さとコストは、幹細胞研究者を選択または微分のプロトコルを開発するときの関連する要因です。これは特に目的のセル型を生成するために必要どのくらいの外部制御未解決の問題であるまたは -ポーズを異なる-有能な hPSCs が自分の発達環境を作り出す十分なと自分自身に残っている場合どのように栄養素。体外性あるいは外因性要因の導入が目的のセル製品を生成して非常によくが彼らも妨げる可能性がある生体内で本質的な発達能力細胞が出展したが。そのような考察が重要な特に場合は、目標は、患者由来の Ips の疾患モデル作製用です。パターン形成および成長因子の広範な使用は、疾患表現型をマスクでした。本報告では詳細なプロトコルの複雑さ、コスト、および/または外因性パターン形成要因8,9の使用を減らすために先行研究の傾向に従います。
六車らと私たち自身の最近の研究によって報告された結果に基づいて、ようで以前の研究を行っている生体内での条件を再現する努力せず小脳運命に向かって差別を実現することが可能です。1,2,3,4,8,10. 魅力的な部分が 2 つの研究が FGF2 の両方を使用、どちらのセットが必要だったことを示唆している成長因子の異なるセットを使用します。Fgf が選択的にプロトコルから除外され、セルがなく外因性 Fgf10同じ製品を生成する能力があったことを示したその他のテストをしました。私たちの研究の違いは、我々 異なる hPSC 線と文化方法を使用、ra、神経分化を誘導、顆粒細胞の生存と成熟 (BDNF、GDNF、サグ、KCL) をサポートするコンポーネントに含まれているという事実によって修飾された11 -14。さらに、六車らと比較して、少なく複雑な起動の方法が採用されました。そのプロトコルで 96WPs は、お互いから物理的に、化学的にそれらを分離した均一 EBs を生成することによって始めた。ここでのプロトコルは、比較的自由に対話することができる理事会の形成中に 6WPs に一緒に混雑のすべての Psc を持っていた。どのようにこの可能性がありますが影響を受ける EBs と後 organoids (シグナル化合物の本質的な生産を含む) の物理・化学的環境は不明と検討することができます。また、表示されますが発現遺伝子に関連付けられている- との挑発的な-我々 を除外することはできません六車ら、によって報告されたそれらに類似した形態の構造内にある、小脳の起源世代のような神経の構造。・小脳のアイデンティティであります。今後の研究のそれらのような抗体の大きいパネルを使用して六車らによって報告されました。(すなわちATOH1、CALBなど) このような割り当て、および両方のプロトコルより決定的な製品との比較になります。
3 D のプロトコル内で開始することが重要ですして最終製品分析のための十分な数を確保するため培養細胞の十分な数を維持します。重要な死ぬオフを指定すると、プロトコルの早い段階で、EBs/井戸文化 (図 1) の最初の 3 日間以上 500 から始まることをお勧めします。これは与えられたコロニーでフィーダー フリー培養、hPSCs のサイズを達成するために困難であるが、まだフィーダーに依存した方法を使用してそれらのために簡単なできない可能性があります。多数のセルを指定すると、色変化 (pH の変化を示す)、媒体や死んだ細胞の蓄積を監視することが重要です。両方は、文化の崩壊を防ぐために修正する必要があります。細胞凝集体の凝集があります大規模な構造に。集計分析することができますまだありますが製品数量が大幅に削減、穏やかな製粉に小さい凝集体に分割することができますので。しかし、不穏な普通骨材を避ける自身が大きなサイズ (図 4) を育てることができます。集計があまりにもまばらになる場合は、集計が完全に分離されているので、井戸を結合することをお勧めします。(数、サイズ、および形態) の製品ばらつきは 3 D 細胞培養、分離、制服 EB 形成の手順、示唆 (ここで説明したプロトコルなどのより複雑なスタートアップ プロシージャから始まるこれらのプロトコルなどでよく知られている問題) より実用的な8,15可能性があります。この不均一性研究者は分析中に特に注意してくださいする必要があるものですが報告されたプロトコルは他 3 D プロトコル8,9,15で見つかったものと一貫性のある製品を生成されます。サイズや形態に基づき、彼らニューラル ロゼットの範囲内に落ちる脳における Kelava、ランカスターの15回転楕円体の分類をフィッティングほとんど最近のレビューで記述されます。特に注目すべきは、3 D 構造の存在がルーメン、(サブ) 心室ゾーン、および機能のような菱形リップと神経はロゼットを示唆している (図 5 図 6) によって識別される他のグループ8,15,16,17. すべての実験は、少なくとも 1 つを作り出すので集計推定 VZ/SVZs と小脳関連マーカー (ZIC1、KIRREL2)、あれらは RL のように私たちのプロトコルを使用して 3 D の分化の成功を決定するための有用な基準その他のサポートを提供する機能。文化過去 35 日間に延長テストは行いませんでしたが、成長、複雑さ、および成熟のこの技術によって許可される最大範囲の特定に追求できます。
2D のプロトコルは、3 D プロトコルに同じ非付着性 EB 形成と神経誘導プロセスを使用し、だから上記のコメントにも適用。メッキ、一度別の考慮事項のセットを考慮されなければなりません。EBs は、外側プレートの上に増殖する細胞にすぐに従う必要があります。付着、ri (使用されていない) 場合は、追加の問題が媒体の容積を減少または PLO/ラムの濃度で実験的な変更が適用される場合。(20-80% の confluency 間の成長できれば) をも密またはスパース成長から細胞を保つことが重要です; の井戸日常の監視とタイムリーな継以上 confluency または浮遊細胞を避けるために、重要です。3 D のプロトコルとは異なりべきであるあります重要なダイオフ、培養中の貧しい人々 の成長分野や増殖率の減速があるかもしれませんが。継 (たとえば、細胞プロセスおよびセル間開発ネットワークの取り外し) 細胞の成熟状態に影響し、細胞が収集または何らかの方法で分析したポイントに近づいているときに留めておかれるべきであります。たとえば、カルシウム イメージすることは非常に重要な分析の前に 2-6 日間の通路のセルです。継に近すぎる分析を意味するかもしれない細胞に接続する時間がなかったおよび/または細胞過密、イメージングを困難に成熟したのとあまりにも遠い可能性があります。実験間のばらつきが存在する可能性があります、結果が初期 2 D 小脳プロトコル1,2で報告されたものと一致。ICC 染色及び遺伝子発現解析は、また他の神経と小脳 id (図 7および図 8) に関連付けられたマーカーを特定し、顆粒細胞のマーカー、ZIC1 陽性細胞の存在を裏付けます。Fluor5 染付培養細胞の電気刺激を含む、カルシウム イメージングに機能神経 (図 9図 1 の補足、および補足図 2) が示されている場合それは確認されていませんが、これら顆粒細胞をだった。過去 35 日間文化の長さを拡張することによって成熟する細胞のより多くの時間を与えること、によって機能的な神経活動量が増やす必要があります議論の余地です。この潜在的な可能性が、将来的に検討します。
上記の提案研究の行に加えてそれは 2 D と 3 D のプロトコル間 (量と質) のプロダクト id の違いを決定するのに興味のでしょう。外因性 Fgf の重要性 2 D プロトコルでテストされなかった、それは知っている場合に役立ちますめっき後, 3次元構造の欠如し、関連するシグナル伝達経路になるので 2 D 文化早期化合物をパターンの人に多かれ少なかれ依存。多くの簡易プロトコル (例えばRA、BDNF、SAG) は、同様にさらに捜査のため説得力のある線です。今後の研究がより良いを特徴付ける (との生成効率を評価する) 新しい研究ツールの恩恵を最後に、人間固有の小脳神経細胞サブタイプ。
心の特定の警告の両方のプロトコルは、さまざまな目的に適した製品と小脳分化の使用する可能性があります報告。彼らは、このような分化または他の種類対象となる神経分化のための基本的なモデルとして細胞の生存率をテスト パイロット研究を行っている研究の実用的な開始ポイントとして役立つかもしれない。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
プリスカ教会 Leferink 私たちの手順を示すための生成と 2 つの制御 iPSC 線の特性とリサ Gasparotto の貢献のために、彼らの専門家技術支援のため Gerbren ジェイコブスと Jurjen Broeke に感謝しております。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12+Glutamax | Gibco | 31331-028 | glutamine fortified DMEM/F12 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | neural basic medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504001 | |
| Insulin | Imgen | PT468-B | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma | P3932 | aka Poly-Hema |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| E8 medium and supplement | Gibco | A1517001 | hPSC medium and supplement |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
| y-27632 (ROCK inhibitor) | SelleckChem | S1049-10mg | |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | hPSC-appropriate adherent coating (PAAC) |
| 0,5M EDTA | Gibco | 15575-020 | |
| 0.2 um filter | VWR | 28145-77 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | VWR | 525-0130 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331-020 | |
| Ethanol | VWR | 83804360 | |
| Parafilm | Sigma | PM996 | wrap for culture plates |
| cryotubes | ThermoFisher | 368632 | |
| TrypLE | Gibco | 12563-029 | trypsin-based dissociation agent |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R-007-100 | |
| FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
| FGF-4 | R&D Systems | 100-31 | |
| FGF-8B | Peprotech | 100-25 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-02 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | |
| Neurotrophic Factor 3 | Peprotech | 450-03 | |
| Smoothened Agonist (SAG) | Cayman | 11914 | CAS 912545-86-9 |
| Axiovert 40C microscope | Zeiss | Brightfield imaging microscope | |
| Axiocam | Zeiss | Brightfield imaging - image aquisition | |
| Eppendorf Centrifuge 5810 | Eppendorf | 521-0996 | centrifuge for cell culture |
| PBS (gebufferde natrium oplossing) | Braun Medical | 3623140 | |
| 5 ml Serological pipets | VWR | 612-4950 | |
| 10 ml Serological pipets | VWR | 612-4951 | |
| 6-wells culture plates | VWR | 734-2323 | |
| 12-wells culture plates | VWR | 734-2324 | |
| hESCs | WiCELL | line H01 |
References
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