Summary
이 프로토콜에는 꼬마 선 충에서 vivo에서 세포 운명 변환 중 세포질 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 유전자 변형 동물, 신경 운명을 유도 하는 전사 인자 체 1의 열 충격 발기인 구동 overexpression와 염색 질 조절 요소 린-53 세균 세포의 신경 프로그래밍을 고갈 RNAi 중재를 사용 하 여 관찰 될 수 있다 vivo에서.
Abstract
세포 생물학 과정을 공부 하 고 특정 종류의 id를 변환 하는 동안 유지 하 고 세포 정체성 보호 메커니즘에 중요 한 통찰력을 제공 합니다. 선 충 꼬마 선 충 (C. 선 충)에 있는 특정 신경 세포로 생식 세포의 전환 설립된 셀 정체성 보호 규정 경로 해 부 하기 위해 유전 스크린을 수행 하기 위한 강력한 도구입니다. 특정 유형의 신경 ASE 라고 세균 세포의 프로그래밍 아연 손가락 녹음 방송의 광범위 한 이상 식 허용 하는 유전자 변형 동물 요인 (TF) 체-1 필요 합니다. 생 체-1은 두 개의 머리 뉴런에 독점적으로 표현 되며 gcy 5prom::gfp 기자에 의해 쉽게 구상 될 수 있다 glutamatergic ASE 신경 세포 운명을 지정 하는 데 필요한. 열 충격 발기인 구동 체 1 유전자 식 구조를 포함 하는 횡단 유전자 열 충격 처리 시 전체 동물에 체 1의 광범위 한 잘못 표현 수 있습니다. Chromatin 규제 요소 린-53와 열 충격 유발 체 1 -식에 대 한 RNAi의 조합을 ASE 신경-같은 세포로 생식 세포의 프로그래밍 이끌어 낸다. 우리 기술 여기 유전자 변형 동물의 열 충격 처리에 대 한 적절 한 조건과 특정 RNAi 절차 성공적으로 신경 변환 생식 세포를 유도 하기 위하여.
Introduction
세포 운명 조직적 TF MyoD 같은 소성 TF 식으로 프로그래밍을 때 overexpressed, 근육 같은 셀1에 직접 변환 fibroblasts 수십 년 동안 연구 집중 되었습니다. 그러나, 차별화 된 셀이이 과정, 그들의 세포질 신원을 보호 메커니즘 때문에 내 화 많습니다. 세균 세포 보호의 유사한 정도 보여 고 종종 운명을 유도 TF의 이상의 표현 시 다른 세포 유형으로 생식 세포 변환 방지 하기 위해 방 벽으로 작동 하는 기본 메커니즘이 있습니다. 일반적으로, 히스톤 수정 및 chromatin 구조 같은 후 성적인 규칙 세포 운명을2,3의 변환에 대 한 장애를 부과 한다. 우리 이전 반전 유전학 C. 선 충 에 RNAi 노크-다운을 사용 하 여 적용 하 고 셀룰러 정체성을 보호 하 고 그로 인하여 세균 세포의 신경4로 프로그래밍을 중화 하는 요인 확인. 특히, polycomb 억압 적인 복잡 한 2 (PRC2) 및 높은 보존된 히스톤 보호자 린-53 (CAF-1/RBBP/4/7 인간의) C. 선 충에서 glutamatergic 맛 신경 세포 등 특정 신체 세포 유형으로 생식 세포의 직접 변환 방지 4 , 5. 장벽 요소 프로그래밍이 세균 세포를 식별 하기 위해 사용 하는 열 충격 유도할 수 있는 Zn 손가락 TF 체-1을 운반 하는 유전자 변형 동물. C. 선 충, glutamatergic 맛 신경 세포의 운명을 ASE6라고 지정의 두 머리 신경 체-1 일반적으로 표현 된다. ASE 신경 운명 ASE 특정 형광 기자 gcy 5prom::gfp의 표현에 의해 구상 될 수 있다. GCY-5 chemoreceptor ASE 오른쪽 신경7만 표현 이다. RNAi에 의해 린 53 소모 및 열 충격에 의해 체 1의 광범위 한 소성 식의 유도, 생식 세포는4,5 생체 내에서뉴런으로 변환할 수 있습니다. 중요 한 것은, RNAi 치료의 타이밍은 린-53 RNAi에 노출만 어른 벌레 (P0 세대) F1 자손 동물 신경4에 프로그래밍에 대 한 허용은 생식을 일으키로 중요 합니다.
C. 선 충 에서 신경 변환 절차를 위에 설명 된 생식 세포 생물학 질문 셀 운명 프로그래밍에 경로 신호의 의미 등의 다양 한 연구를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 노치 신호 전달 경로 생식 세포8프로그래밍 과정의 의미를 공부 하기 위하여 린-53 에 대 한 RNAi 따라 ASE 뉴런으로 재프로그래밍 체 1 유발 세균 셀을 사용 합니다. 린-53 와 demethylase 인코딩 히스톤 공동 고갈에 더블 RNAi를 수행 하 여 우리 노치 신호 통로 중화 PRC2 중재 유전자 표현의 UTX-1 생식8에서에서 활성화 하 여 입을 보여주는 유전자 utx-1 . 이 생식 세포 변환할이이 프로토콜에서 설명 하는 신경 세포 프로그래밍의 컨텍스트에서 다른 발달 및 환경 그대로 유기 체에와 같은 복잡 한 생물 학적 과정을 공부 하 사용 될 수 보여 줍니다. 조건입니다. 또한, 그것은 과도 다른 운명을 유도 TFs 셀룰러 소성9의 금지에서 그들의 역할을 연구 하거나 유도 하는 세균 세포의 프로그래밍에 대 한 그들의 잠재력을 평가 표현 하 여 생식 세포를 도전 하는 관점을 제공 한다 다른 셀에 비보를 입력합니다.
포유류 조직 문화는 또한 세포 운명 프로그래밍의 다양 한 측면을 공부 허용, 문화에서 성장 하는 세포 신호 경로 조건 그대로 체에 비해 모방 하는 능력을 제한 했다. 따라서, C. 선 충 검사 vivo에서프로그래밍 하는 동안 노치 신호 등 다양 한 생물 학적 과정의 역할에 대 한 다재 다능 한 모델 이다. 또한, 상대적으로 쉽게 유지 하 고 낮은 비용에 대 한 유전자 수정 유전 스크린에 대 한 강력한 모델입니다.
Protocol
동물 보호에 관하여 여기에서 설명한 모든 방법 LaGeSo 베를린, 독일에 의해 승인 되었습니다.
1. 솔루션 준비
- NGM-한 천 배지 (1 L)
- NaCl의 3 세대, 펩 미디어 (예: Bacto-펩), 2.5 g 및 한 천 20g 추가 합니다. 압력가 마로 소독, 후 추가 (5 mg/mL 95 %EtOH 재고), 콜레스테롤의 1 mL 1 mL의 1 M MgSO4, 1 mL의 1 M CaCl2, 25 mL의 1 M K2PO4, 고 암포 B (2.5 mg/mL 주식)의 1 mL.
- NGM Agar RNAi 접시 (1 L)
- NaCl의 3 세대, 펩 미디어의 2.5 g 및 한 천 20g 추가 합니다. 압력가 마로 소독 후 추가, 콜레스테롤 (5 mg/mL 95 %EtOH 재고)의 1 mL 1 M MgSO4의 1 mL, 1 mL의 1 M CaCl2, 1 M K2가4의 25 mL, 암포 B (2.5 mg/mL 주식)의 1 mL, 1 M IPTG의 1 mL 고 1 mL carbenicillin (50 mg/mL).
- 파운드-Agar (1 L)
- 효 모 5 g 추출, 5 g의 NaCl, 한 천, 10 mL의 1 M Tris pH 8.0의 20 g, 펩 미디어의 10 g를 추가 합니다. 1 나 H2O 추가 압력가 마로 소독, 후 50 mg/mL carbenicillin의 1 mL와 5 mg/mL 항생물질의 2.5 mL를 추가 합니다.
- LB 매체 (1 L)
- 펩 미디어의 10 g을 추가, 효 모 5 g, NaCl의 5 g 및 10 mL 1 M Tris pH 8.0의 추출. 1 나 H2O 추가 압력가 마로 소독, 후 50 mg/mL carbenicillin의 1 mL를 추가 합니다.
- M9-버퍼 (1 L)
- 나2HPO4의 6.0 g, KH2포4의 3 세대, 5 g의 NaCl, 그리고 젤라틴의 50 밀리 그램을 추가 합니다. 사용 하기 전에 1 M MgSO4의 1 mL를 추가 합니다.
- 표백 솔루션 (10 mL)
- 1 mL NaClO와 5 N NaOH의 2 개 mL를 추가 합니다. 10 mL에 H2O를 추가 합니다.
2입니다. RNAi 접시의 준비
참고: C. 선 충 은 선 충 류 성장 매체 한 천 (Agar NGM)10,11의 7.5 mL를 포함 하는 6 cm 배양 접시에 실험실에서 일반적으로 경작 된다. 이 프로토콜은 15 ° c.에서 보관 하는 벌레에 대 한 최적화 NGM 접시를 준비 하려면 곰 팡이 및 세균 오염을 방지 하기 위해 표준 무 균 기법을 사용 합니다. 다음은 RNAi에 대 한 시 약으로 보충 NGM 접시를 준비 하는 프로토콜입니다.
- 1mm 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 및 50 µ g/mL carbenicillin 6 cm NGM Agar RNAi 접시를 준비 합니다. 그들은 어두운12실 온에서 24-48 h 동안 건조 하자.
- 어둠 속에서 4 ° C에서 RNAi 번호판을 유지. 14 일 보다 오래 된 경우 사용 하지 마십시오.
- 50 µ g/mL를 포함 하는 파운드-한 천 배지에서 사용 가능한 RNAi 도서관13 에서 냉동된 글리세롤 주식에서 린-53 유전자 DNA 시퀀스와 L4440 플라스 미드를 포함 하는 RNAi 박테리아 (대장균 HT115) 클론 선택 carbenicillin와 3 상 줄이 패턴을 사용 하 여 12.5 µ g/mL 항생물질. 37 ° C 하룻밤12에서 박테리아 성장. 이 복제는 박테리아에 린-53 dsRNA의 IPTG 종속 생산을 수 있습니다.
- 또한, 빈 벡터 제어14유전자 시퀀스 없이 L4440 플라스 미드를 포함 하는 RNAi 박테리아 성장.
- 다음 날, 린-53 에서 단일 식민지 나 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 빈 벡터 파운드-한 천 격판덮개 팁과 액체 LB 중간14 50 µ g/mL carbenicillin 보충의 2 개 mL를 포함 하는 별도 문화 관으로 그들의 각각을 예방. 성장 37 ° C에서 하룻밤 문화 광학 밀도 (OD)를 도달할 때까지 600 nm의 0.6-0.8. 외경15분 광 광도 계 사용 하 여 측정 합니다.
주의: 액체 LB 미디어 없어야 감소 RNAi 효율 12 리드를 먹이 동안 항생물질의 포함부터 박테리아 글리세롤 주식에서 질주 사용 파운드-한 천 배지와 달리 항생물질 - 6 cm NGM Agar RNAi 번호판은 multipipette를 사용 하 여 각 세균성 문화 (린-53 또는 빈 벡터)의 500 µ L를 추가 합니다. 건조를 어둠 속에서 실 온에서 하룻밤 닫힌된 뚜껑 접시를 품 어. 이 기간 동안, NGM 접시에서 IPTG dsRNA 박테리아에서의 생산을 유발 한다.
- 실험 당 세균성 문화 당 3 접시를 사용 합니다. 이 기술 3 각 실험에 대 한 복제를 제공할 것입니다.
- 2 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 박테리아와 말린된 NGM agar RNAi 접시를 저장.
3. 선 충 C. 변형 BAT28의 준비
- 웜 변형 transgenes otIs305 를 포함 하는 BAT288 유지 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] 및 ntIs1 [gcy-5prom::gfp] 표준 NGM-한 천 배지를 사용 하 여 15 ° c.에 OP50 박테리아에
참고: 선 충 문화에 자세한 프로토콜에 대 한10를 참조 하십시오. Rol-6(su1006) 는 지배적인 대립 유전자 이며, 일반적으로 사용 하는 phenotypic 주입 마커16 일반적인 회전 이동 시키는. 그것은 otIs305 transgene에서 추적을 사용 hsp-16.2prom::che-1.- 15 ° C에서 BAT28 긴장의 precautious 활성화를 방지 하기 위해 항상 유지는 hsp-16.2prom::che-1 transgene. 가능한 만큼 많이 긴장을 처리 하는 동안 15 ° C 보다 높은 온도에 노출 줄일.
- 나이-동기화 웜, 표백 기술17을 사용 합니다.
- 성인과 900 µ L M9 버퍼를 사용 하 여 BAT28의 계란을 포함 하 6 cm NGM Agar 접시를 씻어. 펠 웜 1 분에 900 x g에서 centrifuging 여는 상쾌한을 제거 합니다.
- 0.5-솔루션을 표백의 1 mL을 추가 하 고 어른 벌레 버스트 오픈 시작 때까지 대략 1 분 동안 튜브를 흔들어. 모니터는 표준 stereomicroscope를 사용 하 여입니다.
- 펠 웜 1 분에 900 x g에서 centrifuging 여는 상쾌한을 제거 합니다.
- M9 버퍼의 800 µ L을 추가 하 고 900 x g에서 centrifuging 여 웜 펠 릿 3 번을 씻어.
- 청소 계란 OP50 박테리아와 시드 신선한 NGM 접시에 놓습니다. 성장 15 ° C에 OP50 박테리아에 표백된 인구 L4 단계 (약 4 일)에 도달할 때까지. 표준 stereomicroscope를 사용 하 여 웜18 의 복 부 측에 따라서 대략 중간 흰색 패치 L4 애벌레를 인식할 수 있습니다.
참고: 세균 셀 린-53의 고갈에 따라 신경 변환 형을 달성 하기 위해, 그것은 부모의 세대 (P0)에 고갈 될 필요가 있다.
- 실제 RNAi 번호판 OP50 박테리아를 전송 하지 마십시오. 온도 15 ° c. 보다 높은 긴장의 노출 시간을 최소화 하기 위해 빠른 작업
- 시각적으로 확인 하십시오 표준 stereomicroscope 아래 그림 1에서 보듯이 F1 자손 웜 튀어나온 음부 (pvul) 표현 형을 표시 하는지 여부. 린-53 에 대 한 RNAi는 다 면 발현 성 효과 고 RNAi 린-53 에 대 한 성공 여부를 평가 하는 데 사용할 수 있습니다 pvul 표현 형.
참고: 린-53 에 대 한 RNAi는 F1 배아의 치 사 율을 일으킬 수 있습니다. 이 효과 동물 L3-L4 단계에 도달 하기 전에 접시 15 ° C 보다 더 높은 학위에 노출 되는 경우 증가 합니다. 죽은 태아 체포 개발 및 해칭의 부족에 의해 인식 될 수 있다. - IPTG 이기 때문에 빛에 민감한 접시 어둠 속에 품 어.
4입니다. 생식 세포 프로그래밍의 유도
- 품 어 시험된 RNAi 판 린-53 를 포함 하 고 빈 체 1을 활성화 하기 위해 어둠 속에서 37 ° C에서 30 분 동안 벡터 RNAi 대우 F1 자손. 발명된 인큐베이터를 사용 하 여 보다 효율적인 열-충격에 대 한 수 있기 때문.
- 어둠 속에서 실 온에서 30 분 동안 복구 하 고 어둠 속에서 하룻밤 25 ° C에서 번호판을 품 어에 열 충격을 동물 허용.
- Gcy-5prom::gfp의 GFP 필터 동물 검사 형광 광원에 결합 하는 표준 stereomicroscope를 사용 하 여- 그림 2와 같이 벌레의 중간 본문 영역에서 신호를 파생. GFP 신호에 대 한 설정된 현미경: 여기 488에서 최대 방출 최대 509에서 nm nm.
- 천 패드 포함 된 현미경 슬라이드19중순 신체 영역에 GFP 신호와 장착 동물에 의해 생식 세포 신경 변환의 정도 평가 합니다.
- 평가 형 penetrance 어두운 동물 대 신경 변환 세균 셀을 보여주는 동물의 수를 계산 합니다. 일반적으로, 약 동물의 30% 표시 개별 GFP 신호 린 53 고갈에 따라 생식에 반면 동물의 5% 이상 빈 벡터 RNAi 시 생식에 확산 GFP 신호.
Representative Results
그림 1에서 보듯이, F1 동물 pvul 표현 형을 전시 하는 린-53 RNAi의 성공적인 응용 프로그램을 보여 줍니다. 이 동물 들은 그림 2에서 볼 수 있듯이 체 1 -식의 열 충격 유도 따라 ASE 신경-같은 세포로 그들의 생식 세포의 변환을 허용 하는 경향이 있다. 빈 컨트롤에 자란 벌레는 달리 RNAi 린-53 RNAi 치료 기술된 이전4, 으로 하룻밤 사이 열 충격 및 25 ° C 부 화 후 중간 본문 영역에서 소성 GFP 신호를 표시 하는 동물을 얻을 것입니다 벡터 8.이 벌레의 epifluorescence 현미경 가까이 시험 드러내 보여주는 GFP 신호 또한 세포는 신경 세포에 대 한 전형적인 신경 같은 계획 (그림 2B, 흰색 화살표) 표시. 린-53 에 대 한 RNAi 실패 했다 또는 열 충격 조건을 적절 한 되지 않은 경우 치료 동물 (그림 2) GFP 신호 제어 RNAi에 닮은 것 이다. 중요 한 것은, 동물 중반 L3 단계에 도달 하기 전에 체 1 의 오버 식 열 유도 의해 유도 하지 마십시오. 체 1 overexpression 유도 시간에 너무 젊은 했다 동물 그림 313에서 같이 개발 외 음부 같은 본문의 다른 지역에서 소성 gcy 5prom::gfp 식을 표시할 수 있습니다.
그림 1: 린-53에 대 한 RNAi에 의해 발생 하는 Pvul 형. (맨 위) L4/젊은 성인 단계 F1 자손 벌레의 DIC 그림 컨트롤이 나 린-53 RNAi 대우 어머니에서 파생. 바 규모 = 20 µ m. (하단) 동물 린-53 RNAi 디스플레이 튀어나온 음부 (pvul) 형 (검정 화살표 머리)로 치료. Pvul 형 린-53 에 대 한 RNAi 되었는지 확인 합니다. 바 규모 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 웜 성공적으로 재설정된 생식 세포와 신경에. (A) 빈 벡터에 성장 하는 BAT28 변형 동물 체 1 overexpression의 열 충격 유도 후 GFP 신호는 생식에 표시 하지 않습니다. 흰색 파선 웜을 설명합니다. 바 규모 = 20 µ m. (B) BAT28 변형 동물 성장 빈 벡터 제어에 린-53 에 RNAi 디스플레이 gcy 5prom::gfp 신호 중간 몸 지역에 성장 하는 RNAi 동물 달리. 그림 63 X 배율에서 GFP 신호와 중반 바디 섹션의 GFP-긍정적인 세포 돌출 (흰색 화살표 머리)을 보여주는 공개. 이 형태학 기능 세균 세포 ASE 같은 신경 세포로 변환 받았습니다 나타냅니다. 화이트 별표 소장 파생 된 자동 형광 표시합니다. 모든 사진 확대 및 63 X 배율 X 20 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 인수 했다. 흰색 파선 웜 설명합니다. 바 규모 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 소성 GFP와 초기 단계 웜. BAT28 변형 동물 열-충격 체 1 overexpression L2 등 초기 애벌레 단계에 대 한 유도 했다 빈 벡터 RNAi 박테리아에 성장 중순 신체 영역 (흰색 별표)에서 GFP 신호를 표시 합니다. 이러한 신호는 생식 세포 프로그래밍으로 인해 되지 않습니다. 흰색 파선 웜을 설명합니다. 바 규모 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
유전자 변형 C. 선 충 을 사용 하 여 설명된 프로토콜 동안 BAT28 변형 및 린-53 에 대 한 RNAi는 간단, 단계 수는 중요 한 순서에 신경 프로그래밍을 생식 세포의 예상된 결과 보장 하기 위해. 그것은 중요 한 실험 전에 항상 긴장 BAT28 15 ° C에서 유지 됩니다. 처리 및 긴장의 유지 보수, 동안 15 ° C 이상의 온도에서 시간 필요가 최소화 가능 한 한 많이 있다. 적절 한 열 충격 조건을 체 1 overexpression의 부족 한 유도 하지 ASE 신경 변환 생식 세포 귀 착될 것 이다 때문에 중요 하다. 이 프로토콜에 설명 된 대로 형 penetrance를 측정 하 여 검출 될 수 있다. 광범위 한 열-충격 동물의 치 명도 될 수 있습니다. 예를 들어, 배치 된 안 벽 근처 또는 정적 공기 인큐베이터의 하단 바닥에 종종 접시 광범위 한 열 처리 경험. 따라서, 배기 열 인큐베이터를 사용 하는 것이 좋습니다. 또한, 열-충격 유도의 타이밍은 애벌레 단계 이전 체 1 의 오버 식 이후 중요 L3 소성 gcy 5prom::gfp 유도 (그림 3) 외 음부 등의 다른 지역에서 발생할 수 있습니다 다음 9. 또한, 광범위 한 열-충격 형 penetrance 5% 그리고 다른 조직, 즉 내장의 증가 자동 형광을 확장 해야 하는 빈 벡터 RNAi 동물에 의해 검출 될 수 있다.
산발적으로, RNAi 박테리아는 그들의 활동을 효율적으로 대상 유전자의 dsRNA를 생산을 잃을 수 있습니다. 불행히도,이 RNAi 실험 검색된 사전 수 없습니다. 이러한 경우에는 글리세롤에서 신선한 행진 프로토콜의 섹션 2에 설명 된 대로 성장 한다. 경우 아직 아무 RNAi 발생 다 면 발현 성 형 pvul 표현 형 린-53, 다음 플라스 미드에 대 한 성공적인 RNAi 기인한 각각 박테리아에서 DNA 격리와 같은 표시를 수행 해야 하 고 신선한 HT115 박테리아가 될 필요가 린-53 시퀀스가 포함 된 L4400 플라스 미드와 변형.
중요 한 것은, BAT28 긴장은 한 사출 마커 pRF4와 동물의 transgenesis 동안에 사용 되었다에 의해 발생 하는 롤러 형은 hsp-16.2prom::che-1 DNA 구조. 때때로, 동물의 입을 수 있습니다 나타내는 롤링 형을 잃고는 hsp-16.2prom::che-1 transgene. BAT28 긴장을 제대로 유지 하려면 신선한 접시 10 롤러 동물을 선택 하 고 전파 동물을 압 연에 대 한 선택.
응용 프로그램 프로토콜의 동물 부모 (P0 세대)는 린-53 RNAi에 노출 되지 생식 세포 신경 변환 모성 구조4때문에 표시 되지 것입니다 즉 F1 RNAi 절차로 제한 됩니다. 세균 세포 뉴런으로 변환 하는 다른 절차 Ciosk와 동료15 RNAi 노크 다운 gld-1 의 녹음 방송 요인의 이상의 식 없이 mex-3 를 사용 하 여 설명 하고있다. 그러나, 얻은 뉴런 뉴런의 특정 종류에 속하지 않는 및 생식 세포는 또한 gld-1 및 mex-315의 RNAi 중재 고갈 시 근육 처럼 세포로 변환. 이전에, 그것은 입증 되었습니다 RNAi 린-53 에 대 한 허용-표현의 Pitx 형 homoedomain 녹음 방송 요인 체-14 대신 UNC-3016 시 GABAergic 신경-같은 세포로 생식 세포 변환 . 미래 방향에 대 한 다른 운명을 유도 하는 녹음 방송 요인 린-53 고갈 세균 세포 여부를 테스트할 수 있습니다 특정 뉴런 보다 다른 셀 형식으로 변환할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 조직적 bHLH 녹음 방송 요인 HLH-1, 포유류 MyoD17체의 overexpression 린-53 RNAi5 시 근육에 생식 세포의 전환을 유도합니다. 다른 유전 스크린의 숫자에 대 한 세균 셀 린-53 RNAi 시 특정 신체 세포 유형 및 적절 한 운명을 유도 하는 녹음 방송 요인의 과다 식 설립 프로그래밍을 사용할 수 있습니다. 이러한 억압 또는 증강 화면 셀 운명 변환 하는 동안 역할 규정 경로 해 부 수 있습니다.
Disclosures
저자는 아무 경쟁 관심사 존재 선언.
Acknowledgments
우리 기술 지원에 대 한 알리 나 엘-칼 릴리, 그리고 마 르 티 나 Hajduskova 감사합니다. 우리 원고에 의견에 대 한 Tursun 그룹의 회원을 감사합니다. 이 작품은 ERC-StG-2014-637530 ERC CIG PCIG12-가-2012-333922에 의해 후원 되었다 하 고 헬름홀츠 협회에 분자 의학에 대 한 최대 Delbrueck 센터에 의해 지원 됩니다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
Gelatine | Roth | 4275.3 | |
IPTG | Sigma | 15502-10G | |
K2PO4 | Roth | T875.2 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
NaCl | Roth | 9265.1 | |
NaClO | Roth | 9062.3 | |
NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
Tris | Roth | AE15.2 | |
Carbenicillin | Roth | 634412 | |
Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
Incubators | |||
Incubator | New Brunswick Scientific C24 | M1247-0052 | for heat-shock |
Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
Microscopes | |||
Fluorescence microscope | M205 FA | Leica | |
Microscope (Imaging) + camera | Axio Imager 2 | Zeiss | |
Microscope (Imaging) + camera | Sensicam | PCO | |
Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
Bacterial strains | |||
Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse III minus). |
||
Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
Worm strains | |||
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. |
derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
RNAi Clones | |||
lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 | |
Misc. | |||
Worm pick | self-made using a pasteur pipette and a platinum wire |
References
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), (1987).
- Ebrahimi, B. Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency. Cell Regen. , 1-12 (2015).
- Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes. Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).
- Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types. Science. 331 (6015), 304-308 (2011).
- Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types. Cell Rep. , 1-9 (2012).
- Etchberger, J. F., et al. The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron. Genes Dev. 21 (13), 1653 (2007).
- Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).
- Seelk, S., et al. Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons. eLife. 5, (2016).
- Patel, T., Hobert, O. Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity. eLife. 6, e24100 (2017).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis Elegans. Genetics. 77 (1), 71 (1974).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
- Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 18 (1), 419357 (2000).
- Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline. Science. 311 (5762), 851-853 (2006).
- Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein. Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).
- Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm. Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).
- Ullrich, M., Liang, V., et al. Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans . Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).
- Shaham, S. Methods in cell biology. WormBook. , 1-75 (2006).