本协议描述了如何在细胞命运转换期间研究在线虫线虫体内的细胞过程。利用转基因动物, 允许热休克启动子驱动的神经元的过度表达, 诱导转录因子 CHE-1 和 rna 介导的染色质调节因子 LIN-53 生殖细胞对神经元重新编程的损耗可以观察在体内。
研究细胞生物学过程在转换特定的细胞类型的身份, 提供了重要的洞察机制, 维护和保护细胞的身份。将生殖细胞转化为线虫的特定神经元线虫线虫 (C. 线虫) 是一种功能强大的工具, 用于执行遗传屏幕, 以便解剖保护已建立的细胞特性的调控通路。重新编程的生殖细胞, 以特定类型的神经元称为 ASE 需要转基因动物, 允许广泛表达的锌指转录因子 (TF) CHE-1。内源性 CHE-1 完全表达于两个头神经元, 并被要求指定谷氨酸 ASE 神经元的命运, 这可以很容易地被gcy-5prom::gfp的记者形象化。含有热休克启动子驱动的che-1基因表达结构的反式基因允许在热休克治疗的整个动物中广泛言不及义 CHE-1。rna 干扰与染色质调节因子 LIN-53 和热休克诱导的che-1表达的结合, 导致生殖细胞重组为 ASE 神经元样细胞。本文介绍了转基因动物热休克处理的具体的 rna 干扰程序和适宜的条件, 以成功诱导生殖细胞转化为神经元。
细胞命运重新编程的异位 tf 的表达, 如肌源 tf MyoD, 当表达, 将成纤维细胞直接转化成肌肉样单元1, 几十年来一直是研究的焦点。然而, 由于保护细胞特性的机制, 分化的细胞往往不容易在这一过程中进行。生殖细胞表现出类似的保护程度, 并且有潜在的机制, 它们经常作为屏障, 防止生殖细胞转化成其他细胞类型后, 表达的命运诱导 TF。通常, 表型修饰和染色质结构等表观遗传调节会阻碍细胞命运的转换2,3。我们以前使用过的反向遗传学在线虫中进行 rna 干扰, 并确定了保护细胞特征的因素, 从而抵消了将生殖细胞重新编程为神经元的4。具体来说, polycomb 压制复合体 2 (PRC2) 和高度保守的组蛋白伴侣 LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 在人类) 防止生殖细胞直接转换成特定的体细胞类型, 如谷氨酸味觉神经元在 C. 线虫4,5. 为了识别这些生殖细胞重编程障碍因子, 我们采用了携带热休克诱导型锌指 TF CHE-1 的转基因动物。CHE-1 通常表现在两个头神经元的C. 线虫, 它指定的命运谷氨酸味觉神经元称为 ASE6。ase 神经元的命运可以通过表达的 ase 特定的荧光记者gcy-5prom::gfp来可视化。GCY-5 是仅在 ASE 右神经元7中表达的化学。在lin-53中, 通过热休克干扰和诱导 CHE-1 的广泛异位表达, 生殖细胞可以转换成神经元在体内4,5。重要的是, rna 干扰处理的时间是至关重要的, 因为只有成年蠕虫 (P0 代) 暴露在lin-53 rna, 使 F1 后代动物的系, 是允许重新编程到神经元4。
上面描述的生殖细胞到神经元转换过程中的线虫可以用来研究各种生物学问题, 如信号通路在细胞命运重编程中的意义。例如, 在对lin-53进行 rna 干扰时, 我们使用 CHE-1-induced 生殖细胞重新编程为 ASE 神经元, 以研究在生殖细胞重编程过程中的缺口信号通路的含义8。通过对 co-deplete lin-53和组蛋白甲基编码基因utx-1进行双 rna 干扰, 我们表明, 在 PRC2-mediated8 中, 通过激活 UTX-1 表达式来抵消系基因沉默的缺口信号通路.这一发现表明, 生殖细胞转化为本议定书描述的神经元可以用来研究一个复杂的生物过程, 如细胞重新编程在一个完整的有机体, 并在不同的发展和环境的背景下条件.此外, 它提供的观点, 挑战生殖细胞的发酵不同的命运诱导 TFs 研究其在限制细胞可塑性的作用9, 或评估其潜在的诱导细胞重新编程的生殖细胞其他单元格类型在体内。
虽然哺乳动物的组织培养也允许研究细胞命运重新编程的不同方面, 但在文化中生长的细胞与完整的生物体相比, 模拟信号通路条件的能力有限。因此, C. 线虫是一个多用途的模型, 用于检查各种生物过程的作用, 如在重新编程体内时的切口信号。此外, 它是一个强大的基因屏幕模型, 是相对容易维护和遗传修改低成本。
虽然所描述的协议使用转基因的线虫应变 BAT28 和 rna 干扰对lin-53是直接的, 一些步骤是关键的, 以确保生殖细胞的预期结果的神经元重新编程。重要的是, 应变 BAT28 保持在15° c 在任何时候, 在实验之前。在应变的处理和维护过程中, 温度在15° c 以上的时间需要尽可能的减少。适当的热休克条件是重要的, 因为不充分诱导的che-1过度表达不会导致生殖细胞到 ASE 神经元转换。这可以通过测量表型显, 如协议所述。广泛的热休克可能导致致命的动物。例如, 放置在内壁附近或位于静态空气孵化箱底部的板块通常会受到广泛的热处理。因此, 建议使用通风保温箱。此外, 热休克感应的时间是至关重要的, 因为表达的che-1在幼体阶段早期, 然后 L3 可能导致异位gcy-5prom::gfp诱导在不同的身体区域, 如外阴 (图 3)9. 此外, 空矢量干扰动物的表型显可检测到广泛的热休克, 不应延长 5%, 增加荧光其他组织, 即肠道。
偶尔地, rna 干扰细菌可能失去他们的活动有效地产生 dsRNA 的目标基因。不幸的是, 这在 rna 干扰实验之前不能被发现。在这种情况下, 应按照《议定书》2节的说明, 增加甘油的新的条纹。如果仍然没有 rna 干扰导致的效表型可见如pvul表型由于成功的 rna 干扰对lin-53, 然后一个质粒 DNA 分离从各自的细菌应该执行和新鲜的 HT115 细菌需要是与包含lin-53序列的 L4400 质粒进行转换。
重要的是, BAT28 应变有一个滚筒表型由注射标记 pRF4, 这是在转基因期间使用的动物与hsp-16.2prom:: che-1 DNA 结构。有时, 动物失去滚动表型, 这可能表明沉默的hsp-16.2prom:: che-1转基因。为了正确地保持 BAT28 的应变, 选择10滚子动物到一个新的板块和传播选择滚动动物。
该协议的应用限于 F1 的 rna 干扰程序, 这意味着, 其父母 (P0 代) 尚未接触到lin-53 rna 干扰的动物将不会显示生殖细胞到神经元转换, 因为产妇抢救4。Ciosk 和同事15使用了gld-1和mex-3而不表达转录因子的 rna 干扰的方法来描述将生殖细胞转换为神经元的另一种方法。然而, 获得的神经元不属于特定类型的神经元, 生殖细胞也转换成肌肉样细胞后, rna 介导的损耗gld-1和mex-315。以前, 它已经证明了对lin-53的 rna 干扰在 Pitx 型 homoedomain 转录因子 UNC-3016而不是 CHE-14的表达上允许生殖细胞转化为 gaba 神经元样细胞。.对于未来的方向, 可以测试不同的命运诱导转录因子是否可以转换为其他细胞类型比特定的神经元的lin-53衰竭生殖细胞。在这种情况下, 过度表达的肌 bHLH 转录因子 HLH-1, 同源哺乳动物 MyoD17, 诱导生殖细胞转化为肌肉在lin-53 RNAi5。在lin-53 rna 干扰和表达适当的命运诱导转录因子的基础上, 建立生殖细胞到特定体细胞类型的重新编程可以用于许多不同的遗传屏幕。这种抑制器或增强剂屏幕可以帮助解剖在细胞命运转换过程中发挥作用的调控通路。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢阿琳娜 El 哈利利和纳 Hajduskova 的技术援助。我们感谢 Tursun 小组成员对手稿的评论。这项工作是由 ERC-StG-2014-637530 和 PCIG12-GA-2012-333922 的赞助, 并支持的最大 Delbrueck 中心分子医学在亥姆霍兹协会。
Chemicals | |||
Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
Gelatine | Roth | 4275.3 | |
IPTG | Sigma | 15502-10G | |
K2PO4 | Roth | T875.2 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
NaCl | Roth | 9265.1 | |
NaClO | Roth | 9062.3 | |
NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
Tris | Roth | AE15.2 | |
Carbenicillin | Roth | 634412 | |
Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
Incubators | |||
Incubator | New Brunswick Scientific C24 | M1247-0052 | for heat-shock |
Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
Microscopes | |||
Fluorescence microscope | M205 FA | Leica | |
Microscope (Imaging) + camera | Axio Imager 2 | Zeiss | |
Microscope (Imaging) + camera | Sensicam | PCO | |
Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
Bacterial strains | |||
Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse III minus). |
||
Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
Worm strains | |||
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. |
derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
RNAi Clones | |||
lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 | |
Misc. | |||
Worm pick | self-made using a pasteur pipette and a platinum wire |