이 프로토콜에는 꼬마 선 충에서 vivo에서 세포 운명 변환 중 세포질 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 유전자 변형 동물, 신경 운명을 유도 하는 전사 인자 체 1의 열 충격 발기인 구동 overexpression와 염색 질 조절 요소 린-53 세균 세포의 신경 프로그래밍을 고갈 RNAi 중재를 사용 하 여 관찰 될 수 있다 vivo에서.
세포 생물학 과정을 공부 하 고 특정 종류의 id를 변환 하는 동안 유지 하 고 세포 정체성 보호 메커니즘에 중요 한 통찰력을 제공 합니다. 선 충 꼬마 선 충 (C. 선 충)에 있는 특정 신경 세포로 생식 세포의 전환 설립된 셀 정체성 보호 규정 경로 해 부 하기 위해 유전 스크린을 수행 하기 위한 강력한 도구입니다. 특정 유형의 신경 ASE 라고 세균 세포의 프로그래밍 아연 손가락 녹음 방송의 광범위 한 이상 식 허용 하는 유전자 변형 동물 요인 (TF) 체-1 필요 합니다. 생 체-1은 두 개의 머리 뉴런에 독점적으로 표현 되며 gcy 5prom::gfp 기자에 의해 쉽게 구상 될 수 있다 glutamatergic ASE 신경 세포 운명을 지정 하는 데 필요한. 열 충격 발기인 구동 체 1 유전자 식 구조를 포함 하는 횡단 유전자 열 충격 처리 시 전체 동물에 체 1의 광범위 한 잘못 표현 수 있습니다. Chromatin 규제 요소 린-53와 열 충격 유발 체 1 -식에 대 한 RNAi의 조합을 ASE 신경-같은 세포로 생식 세포의 프로그래밍 이끌어 낸다. 우리 기술 여기 유전자 변형 동물의 열 충격 처리에 대 한 적절 한 조건과 특정 RNAi 절차 성공적으로 신경 변환 생식 세포를 유도 하기 위하여.
세포 운명 조직적 TF MyoD 같은 소성 TF 식으로 프로그래밍을 때 overexpressed, 근육 같은 셀1에 직접 변환 fibroblasts 수십 년 동안 연구 집중 되었습니다. 그러나, 차별화 된 셀이이 과정, 그들의 세포질 신원을 보호 메커니즘 때문에 내 화 많습니다. 세균 세포 보호의 유사한 정도 보여 고 종종 운명을 유도 TF의 이상의 표현 시 다른 세포 유형으로 생식 세포 변환 방지 하기 위해 방 벽으로 작동 하는 기본 메커니즘이 있습니다. 일반적으로, 히스톤 수정 및 chromatin 구조 같은 후 성적인 규칙 세포 운명을2,3의 변환에 대 한 장애를 부과 한다. 우리 이전 반전 유전학 C. 선 충 에 RNAi 노크-다운을 사용 하 여 적용 하 고 셀룰러 정체성을 보호 하 고 그로 인하여 세균 세포의 신경4로 프로그래밍을 중화 하는 요인 확인. 특히, polycomb 억압 적인 복잡 한 2 (PRC2) 및 높은 보존된 히스톤 보호자 린-53 (CAF-1/RBBP/4/7 인간의) C. 선 충에서 glutamatergic 맛 신경 세포 등 특정 신체 세포 유형으로 생식 세포의 직접 변환 방지 4 , 5. 장벽 요소 프로그래밍이 세균 세포를 식별 하기 위해 사용 하는 열 충격 유도할 수 있는 Zn 손가락 TF 체-1을 운반 하는 유전자 변형 동물. C. 선 충, glutamatergic 맛 신경 세포의 운명을 ASE6라고 지정의 두 머리 신경 체-1 일반적으로 표현 된다. ASE 신경 운명 ASE 특정 형광 기자 gcy 5prom::gfp의 표현에 의해 구상 될 수 있다. GCY-5 chemoreceptor ASE 오른쪽 신경7만 표현 이다. RNAi에 의해 린 53 소모 및 열 충격에 의해 체 1의 광범위 한 소성 식의 유도, 생식 세포는4,5 생체 내에서뉴런으로 변환할 수 있습니다. 중요 한 것은, RNAi 치료의 타이밍은 린-53 RNAi에 노출만 어른 벌레 (P0 세대) F1 자손 동물 신경4에 프로그래밍에 대 한 허용은 생식을 일으키로 중요 합니다.
C. 선 충 에서 신경 변환 절차를 위에 설명 된 생식 세포 생물학 질문 셀 운명 프로그래밍에 경로 신호의 의미 등의 다양 한 연구를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 노치 신호 전달 경로 생식 세포8프로그래밍 과정의 의미를 공부 하기 위하여 린-53 에 대 한 RNAi 따라 ASE 뉴런으로 재프로그래밍 체 1 유발 세균 셀을 사용 합니다. 린-53 와 demethylase 인코딩 히스톤 공동 고갈에 더블 RNAi를 수행 하 여 우리 노치 신호 통로 중화 PRC2 중재 유전자 표현의 UTX-1 생식8에서에서 활성화 하 여 입을 보여주는 유전자 utx-1 . 이 생식 세포 변환할이이 프로토콜에서 설명 하는 신경 세포 프로그래밍의 컨텍스트에서 다른 발달 및 환경 그대로 유기 체에와 같은 복잡 한 생물 학적 과정을 공부 하 사용 될 수 보여 줍니다. 조건입니다. 또한, 그것은 과도 다른 운명을 유도 TFs 셀룰러 소성9의 금지에서 그들의 역할을 연구 하거나 유도 하는 세균 세포의 프로그래밍에 대 한 그들의 잠재력을 평가 표현 하 여 생식 세포를 도전 하는 관점을 제공 한다 다른 셀에 비보를 입력합니다.
포유류 조직 문화는 또한 세포 운명 프로그래밍의 다양 한 측면을 공부 허용, 문화에서 성장 하는 세포 신호 경로 조건 그대로 체에 비해 모방 하는 능력을 제한 했다. 따라서, C. 선 충 검사 vivo에서프로그래밍 하는 동안 노치 신호 등 다양 한 생물 학적 과정의 역할에 대 한 다재 다능 한 모델 이다. 또한, 상대적으로 쉽게 유지 하 고 낮은 비용에 대 한 유전자 수정 유전 스크린에 대 한 강력한 모델입니다.
유전자 변형 C. 선 충 을 사용 하 여 설명된 프로토콜 동안 BAT28 변형 및 린-53 에 대 한 RNAi는 간단, 단계 수는 중요 한 순서에 신경 프로그래밍을 생식 세포의 예상된 결과 보장 하기 위해. 그것은 중요 한 실험 전에 항상 긴장 BAT28 15 ° C에서 유지 됩니다. 처리 및 긴장의 유지 보수, 동안 15 ° C 이상의 온도에서 시간 필요가 최소화 가능 한 한 많이 있다. 적절 한 열 충격 조건을 체 1 overexpression의 부족 한 유도 하지 ASE 신경 변환 생식 세포 귀 착될 것 이다 때문에 중요 하다. 이 프로토콜에 설명 된 대로 형 penetrance를 측정 하 여 검출 될 수 있다. 광범위 한 열-충격 동물의 치 명도 될 수 있습니다. 예를 들어, 배치 된 안 벽 근처 또는 정적 공기 인큐베이터의 하단 바닥에 종종 접시 광범위 한 열 처리 경험. 따라서, 배기 열 인큐베이터를 사용 하는 것이 좋습니다. 또한, 열-충격 유도의 타이밍은 애벌레 단계 이전 체 1 의 오버 식 이후 중요 L3 소성 gcy 5prom::gfp 유도 (그림 3) 외 음부 등의 다른 지역에서 발생할 수 있습니다 다음 9. 또한, 광범위 한 열-충격 형 penetrance 5% 그리고 다른 조직, 즉 내장의 증가 자동 형광을 확장 해야 하는 빈 벡터 RNAi 동물에 의해 검출 될 수 있다.
산발적으로, RNAi 박테리아는 그들의 활동을 효율적으로 대상 유전자의 dsRNA를 생산을 잃을 수 있습니다. 불행히도,이 RNAi 실험 검색된 사전 수 없습니다. 이러한 경우에는 글리세롤에서 신선한 행진 프로토콜의 섹션 2에 설명 된 대로 성장 한다. 경우 아직 아무 RNAi 발생 다 면 발현 성 형 pvul 표현 형 린-53, 다음 플라스 미드에 대 한 성공적인 RNAi 기인한 각각 박테리아에서 DNA 격리와 같은 표시를 수행 해야 하 고 신선한 HT115 박테리아가 될 필요가 린-53 시퀀스가 포함 된 L4400 플라스 미드와 변형.
중요 한 것은, BAT28 긴장은 한 사출 마커 pRF4와 동물의 transgenesis 동안에 사용 되었다에 의해 발생 하는 롤러 형은 hsp-16.2prom::che-1 DNA 구조. 때때로, 동물의 입을 수 있습니다 나타내는 롤링 형을 잃고는 hsp-16.2prom::che-1 transgene. BAT28 긴장을 제대로 유지 하려면 신선한 접시 10 롤러 동물을 선택 하 고 전파 동물을 압 연에 대 한 선택.
응용 프로그램 프로토콜의 동물 부모 (P0 세대)는 린-53 RNAi에 노출 되지 생식 세포 신경 변환 모성 구조4때문에 표시 되지 것입니다 즉 F1 RNAi 절차로 제한 됩니다. 세균 세포 뉴런으로 변환 하는 다른 절차 Ciosk와 동료15 RNAi 노크 다운 gld-1 의 녹음 방송 요인의 이상의 식 없이 mex-3 를 사용 하 여 설명 하고있다. 그러나, 얻은 뉴런 뉴런의 특정 종류에 속하지 않는 및 생식 세포는 또한 gld-1 및 mex-315의 RNAi 중재 고갈 시 근육 처럼 세포로 변환. 이전에, 그것은 입증 되었습니다 RNAi 린-53 에 대 한 허용-표현의 Pitx 형 homoedomain 녹음 방송 요인 체-14 대신 UNC-3016 시 GABAergic 신경-같은 세포로 생식 세포 변환 . 미래 방향에 대 한 다른 운명을 유도 하는 녹음 방송 요인 린-53 고갈 세균 세포 여부를 테스트할 수 있습니다 특정 뉴런 보다 다른 셀 형식으로 변환할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 조직적 bHLH 녹음 방송 요인 HLH-1, 포유류 MyoD17체의 overexpression 린-53 RNAi5 시 근육에 생식 세포의 전환을 유도합니다. 다른 유전 스크린의 숫자에 대 한 세균 셀 린-53 RNAi 시 특정 신체 세포 유형 및 적절 한 운명을 유도 하는 녹음 방송 요인의 과다 식 설립 프로그래밍을 사용할 수 있습니다. 이러한 억압 또는 증강 화면 셀 운명 변환 하는 동안 역할 규정 경로 해 부 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리 기술 지원에 대 한 알리 나 엘-칼 릴리, 그리고 마 르 티 나 Hajduskova 감사합니다. 우리 원고에 의견에 대 한 Tursun 그룹의 회원을 감사합니다. 이 작품은 ERC-StG-2014-637530 ERC CIG PCIG12-가-2012-333922에 의해 후원 되었다 하 고 헬름홀츠 협회에 분자 의학에 대 한 최대 Delbrueck 센터에 의해 지원 됩니다.
Chemicals | |||
Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
Gelatine | Roth | 4275.3 | |
IPTG | Sigma | 15502-10G | |
K2PO4 | Roth | T875.2 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
NaCl | Roth | 9265.1 | |
NaClO | Roth | 9062.3 | |
NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
Tris | Roth | AE15.2 | |
Carbenicillin | Roth | 634412 | |
Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
Incubators | |||
Incubator | New Brunswick Scientific C24 | M1247-0052 | for heat-shock |
Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
Microscopes | |||
Fluorescence microscope | M205 FA | Leica | |
Microscope (Imaging) + camera | Axio Imager 2 | Zeiss | |
Microscope (Imaging) + camera | Sensicam | PCO | |
Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
Bacterial strains | |||
Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse III minus). |
||
Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
Worm strains | |||
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. |
derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
RNAi Clones | |||
lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 | |
Misc. | |||
Worm pick | self-made using a pasteur pipette and a platinum wire |