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Developmental Biology

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

doi: 10.3791/56889 Published: January 1, 2018

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die zelluläre Prozesse während der Zelle Schicksal Konvertierung in Caenorhabditis Elegans in-vivoStudie. Mit transgenen Tieren, so dass Hitzeschock Projektträger-gesteuerte Überexpression des Neuron Schicksal-induzierende Transkriptionsfaktors CHE-1 und RNAi-vermittelten Erschöpfung der Chromatin-regulierende Faktor LIN-53 Keimzelle zu Neuron Umprogrammierung kann beobachtet werden in Vivo.

Abstract

Studium der biologischen Prozesse der Zelle während der Umwandlung der Identitäten der spezifischen Zelltypen liefert wichtige Einblicke in den Mechanismus, die pflegen und zelluläre Identität zu schützen. Die Umwandlung von Keimzellen in spezifischen Neuronen in den Fadenwurm Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Durchführung von genetischen Bildschirme um regulatorische Signalwege zu sezieren, die etablierten Zelle Identitäten zu schützen. Umprogrammierung der Keimzellen auf einen bestimmten Typ von Neuronen genannt ASE erfordert, dass transgene Tiere, mit denen breite Überexpression der Zn-Finger Transkription Faktor (TF) CHE-1. Endogene CHE-1 äußert sich ausschließlich in zwei Kopf Neuronen und ist erforderlich, um die ASE glutamatergen Neuronen Schicksal angeben, die leicht durch die Gcy-5prom::gfp -Reporter visualisiert werden können. Ein Trans-gen, enthält das Hitzeschock Projektträger-gesteuerte Che-1 Ausdruck Genkonstrukt ermöglicht breiten MIS Ausdruck des CHE-1 in das gesamte Tier bei Hitze-Schock-Behandlung. Die Kombination von RNAi gegen die Regulierung von Chromatin Faktor LIN-53 und Hitze-Schock-induzierte Che-1 Überexpression führt zur Reprogrammierung von Keimzelle in ASE Neuron-ähnliche Zellen. Wir beschreiben hier die RNAi Sonderverfahren und angemessene Bedingungen für Hitze-Schock-Behandlung von transgenen Tieren um erfolgreich Keimzelle zur Neuron Umkehr induzieren.

Introduction

Handy-Schicksal Umprogrammierung durch ektopische TF-Expression wie die myogen TF MyoD, die beim überexprimiert, Konvertiten Fibroblasten direkt in den Muskel-wie Zellen1, wurde ein Forschungsschwerpunkt seit Jahrzehnten. Differenzierte Zellen sind jedoch oft refraktär gegenüber diesen Prozess durch Mechanismen, die ihre zelluläre Identität zu wahren. Keimzellen zeigen ein ähnliches Maß an Schutz und gibt es zugrunde liegenden Mechanismen, die oft als ein Hindernis für die Keimzelle Konvertierung in andere Zelltypen bei Überexpression von einem Schicksal-induzierende TF verhindern fungieren. In der Regel auferlegt epigenetischen Regulation wie Histon Änderungen und Chromatinstruktur ein Hindernis für die Bekehrung der Zelle Schicksale2,3. Wir haben zuvor angewendet reverse Genetik mit RNAi Knock-Downs in C. Elegans und identifizierte Faktoren, die zelluläre Identitäten zu schützen und dadurch entgegenwirken Reprogrammierung von Keimzellen in Neuronen4. Insbesondere die Polycomb repressiven Komplex 2 (PRC2) und die hoch konservierte Histon Chaperone LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 in den Menschen) zu verhindern, dass die direkte Umwandlung von Keimzellen in bestimmten somatischer Zelltypen wie glutamatergen Geschmack Neuronen in C. Elegans 4 , 5. um diese Keimzelle Umprogrammierung Barriere Faktoren zu identifizieren, wir transgene Tiere tragen die Hitzeschock induzierbaren Zn-Finger TF CHE-1 verwendet. CHE-1 drückt sich normalerweise in zwei Kopf Neuronen von C. Elegans, wo gibt es das Schicksal der glutamatergen Geschmack Neuronen ASE6bezeichnet. Die ASE Neuron Schicksal kann durch Expression von ASE-spezifischen fluoreszierenden Reporter Gcy-5prom::gfpvisualisiert werden. GCY-5 ist ein Chemorezeptor nur in ASE richtige Neuron7zum Ausdruck gebracht. Lin-53 Erschöpfung durch RNAi und Induktion von breiten ektopische Expression von CHE-1 durch einen Hitzeschock können Neuronen in Vivo4,5Keimzellen umgewandelt werden. Wichtig ist, ist das Timing der RNAi-Behandlung besonders wichtig, da nur Erwachsene Würmer (P0 Generation) ausgesetzt, Lin-53 RNAi F1 Nachzucht Tiere mit einem Keimbahn, die freizügig hervorrufen für Reprogrammierung in Neuronen4ist.

Die oben beschriebenen Keimzelle zu Neuron Konvertierungsvorgang in C. Elegans kann verwendet werden, um eine Vielzahl von biologischen Fragen wie die Implikation der Signalwege in der Zelle Schicksal Umprogrammierung zu studieren. Zum Beispiel haben wir die CHE-1-induzierte Keimzelle Reprogrammierung in ASE Neuronen auf RNAi gegen Lin-53 um die Implikation der Signalweg in den Prozess der Keimzelle Umprogrammierung8Kerbe zu studieren. Durch Ausführen der doppelten RNAi um Lin-53 und der Histon-Demethylase-Codierung Co zum Abbau gen Utx-1 wir, dass die Kerbe Weg entgegenwirkt PRC2-vermittelte Gen-silencing zeigten durch Aktivierung Ausdruck UTX-1 in die Keimbahn8-Signalisierung . Dieses Ergebnis zeigt, dass die Keimzelle Umstellung auf Neuronen, die in diesem Protokoll beschrieben verwendet werden, um einen komplexen biologischen Prozess z. B. zellulären Reprogrammierung im Organismus intakt und im Rahmen der verschiedenen Entwicklungs- und umweltpolitischen studieren Bedingungen. Darüber hinaus bietet es die Perspektive um Keimzellen zu fordern, indem Sie zum Ausdruck über verschiedene Schicksal-induzierende TFs zu ihrer Rolle in der Beschränkung der zellulären Plastizität9studieren oder ihr Potenzial zur Induktion Umprogrammierung der Keimzellen zu bewerten andere Zelltypen in Vivo.

Während Säugetier-Gewebekulturen auch verschiedene Aspekte erlauben der Zelle Schicksal Umprogrammierung zu studieren, haben Zellen in Kultur angebaut eine begrenzte Kapazität, Signalisierung Weg Bedingungen im Vergleich zu einem intakten Organismus zu imitieren. C. Elegans ist demzufolge ein vielseitiges Modell zur Untersuchung der Rollen der verschiedenen biologischen Prozessen wie Notch Signalisierung während Umprogrammierung in Vivo. Darüber hinaus ist es ein leistungsfähiges Modell für genetische Bildschirme, das ist relativ leicht zu pflegen und genetisch zu verändern, für niedrige Kosten.

Protocol

Alle in Bezug auf die Pflege der Tiere hier beschriebene Methoden wurden von der LaGeSo Berlin genehmigt

1. Vorbereitung der Lösung

  1. NGM-Agarplatten (1 L)
    1. 3 g NaCl, 2,5 g Pepton Medien (z. B. Bacto-Pepton) und 20 g Agar-Agar hinzufügen. Nach dem Autoklavieren, fügen Sie 1 mL des Cholesterins (5 mg/mL 95 % EtOH vorrätig), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO4und 1 mL Amphotericin B (2,5 mg/mL Brühe).
  2. RNAi NGM-Agar-Platten (1 L)
    1. 3 g NaCl, 2,5 g Pepton Medien und 20 g Agar-Agar hinzufügen. Nach dem Autoklavieren fügen Sie hinzu, 1 mL des Cholesterins (5 mg/mL 95 % EtOH vorrätig), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO4, 1 mL Amphotericin B (2,5 mg/mL Brühe), 1 mL 1 M IPTG , und 1 mL Carbenicillin (50 mg/mL).
  3. LB-Agar (1 L)
    1. Fügen Sie 10 g Pepton Medien, 5 g Hefe-Extrakt, 5 g NaCl, 20 g Agar, 10 mL von 1 M Tris pH 8.0. 1 L. H2O hinzufügen Nach dem Autoklavieren fügen Sie 1 mL 50 mg/mL Carbenicillin und 2,5 mL von 5 mg/mL Tetracyclin.
  4. LB-Medium (1 L)
    1. Fügen Sie 10 g Pepton Medien, 5 g Hefe-Extrakt, 5 g NaCl und 10 mL 1 M Tris pH 8.0. 1 L. H2O hinzufügen Nach dem Autoklavieren hinzugeben Sie 1 mL 50 mg/mL Carbenicillin.
  5. M9-Puffer (1 L)
    1. 6,0 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl und 50 mg Gelatine hinzufügen. Hinzugeben Sie vor der Benutzung 1 mL 1 M MgSO4.
  6. Bleichmittel-Lösung (10 mL)
    1. Fügen Sie 1 mL NaClO und 2 mL 5 N NaOH. 10 mL H2O hinzufügen.

2. Vorbereitung der RNAi-Platten

Hinweis: C. Elegans ist in der Regel im Labor auf 6 cm Petri Platten mit 7,5 mL Nematoden Wachstum Medium Agar (NGM-Agar)10,11kultiviert. Dieses Protokoll ist optimiert für Würmer gehalten bei 15 ° C. Zur Vorbereitung der Platten mit NGM verwenden Sie standard sterile Techniken, um Pilz- und bakterielle Kontamination zu verhindern. Im folgenden ist das Protokoll, NGM Platten ergänzt mit Reagenzien für RNAi vorzubereiten.

  1. Bereiten Sie 6-cm-NGM-Agar RNAi-Platten mit 1 mM Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) und 50 µg/mL Carbenicillin vor. Für 24 – 48 h bei Raumtemperatur in den dunklen12trocknen lassen.
    1. Halten Sie RNAi-Platten bei 4 ° C im Dunkeln. Nicht verwenden Sie, wenn älter als 14 Tage.
  2. Wählen Sie die RNAi Bakterien (Escherichia coli HT115) Klon mit dem L4440-Plasmid mit Lin-53 -gen-DNA-Sequenz aus dem gefrorenen Glycerin bestand von den verfügbar RNAi Bibliothek13 auf LB-Agar-Platten mit 50 µg/mL Carbenicillin und 12,5 µg/mL Tetracyclin mit der Drehstrom-Streifen-Muster. Wachsen Sie die Bakterien bei 37 ° C über Nacht12. Dieser Klon ermöglicht IPTG-abhängige Produktion von Lin-53 DsRNA in den Bakterien.
    1. Darüber hinaus wachsen Sie RNAi-Bakterien, die das Plasmid L4440 ohne jede Gensequenz als leerer Vektor-Kontrolle-14enthalten.
  3. Am nächsten Tag, wählen Sie eine einzige Kolonie von Lin-53 oder leerer Vektor LB-Agar-Platten mit einer 200 µL Pipette Tipp und jeder von ihnen in einer eigenen Kultur-Röhrchen mit 2 mL liquid LB mittlere14 ergänzt mit 50 µg/mL Carbenicillin zu impfen. Kulturen über Nacht bei 37 ° C zu wachsen bis zum Erreichen einer optischen Dichte (OD) bei 600 nm von 0,6-0,8. Messen Sie mit einem Spektrophotometer15OD.
    Achtung: Die Flüssigmedien LB sollte nicht Tetracyclin im Gegensatz zu der LB-Agar-Platte verwendet für die Bakterien aus dem Glycerin bestand seit Aufnahme von Tetracyclin während der Fütterung führt zu einer verminderten RNAi Effizienz 12 Streifen enthalten.
  4. 6 cm RNAi NGM-Agar-Platten mit einem Multipipette fügen Sie 500 µL jeder Bakterienkultur (Lin-53 oder leerer Vektor hinzu). Inkubieren Sie Platten mit einem geschlossenen Deckel über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen. Während dieser Zeit wird die IPTG in die NGM Platten Produktion von DsRNA in den Bakterien induzieren.
    1. Verwenden Sie mindestens 3 Platten pro Bakterienkultur pro Versuch. Dies bietet für jedes Experiment 3 Technische repliziert.
  5. Lagern Sie getrocknete RNAi NGM-Agar-Platten mit Bakterien bei 4 ° C bis zu zwei Wochen im Dunkeln.

3. Vorbereitung von C. Elegans Strain BAT28

  1. Pflegen die Wurm Belastung BAT288 , enthält die transgene otIs305 [Hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] und ntIs1 [Gcy-5prom::gfp] auf OP50 Bakterien mit standard NGM-Agarplatten bei 15 ° C.
    Hinweis: Für ausführliche Protokoll über Nematoden Kultur, siehe10. Die rol-6(su1006) ist eine dominante Allel und gängigen phänotypischen Injektion Marker16 , die die typische rollende Bewegung verursacht. Es dient zur Nachverfolgung in der otIs305 -Transgen Hsp-16.2prom::che-1.
    1. Halten die BAT28 Belastung bei 15 ° C zu allen Zeiten vorsichtig Aktivierung der Vermeidung der Hsp-16.2prom::che-1 Transgen. Reduzieren Sie Temperaturen über 15 ° C beim Umgang mit der Belastung so weit wie möglich.
  2. Um Alter zu synchronisieren-Würmer nutzen Sie die bleichen Technik17.
    1. 6 cm NGM-Agar-Platten mit Erwachsenen und Eiern von BAT28 mit 900 µL M9 Puffer abwaschen. Pellet-Würmer durch Zentrifugieren bei 900 X g für 1 min. entfernen den überstand.
    2. Fügen Sie 0,5 – 1 mL der Lösung bleichen und schütteln Sie das Rohr für ca. 1 min bis Erwachsenen Würmer beginnen zu platzen geöffnet. Monitor mit einem standard Stereomikroskop.
    3. Pellet-Würmer durch Zentrifugieren bei 900 X g für 1 min. entfernen den überstand.
    4. Waschen Sie das Wurm-Pellet 3 Mal durch Hinzufügen von 800 µL M9 Puffer und bei 900 X g zentrifugieren.
    5. Legen Sie die gereinigten Eiern auf frischen NGM-Platten mit OP50 Bakterien ausgesät. Wachsen sie gebleicht Einwohner auf OP50 Bakterien bei 15 ° C, bis sie L4-Stadium (ca. 4 Tage) zu erreichen. L4-Larven können durch einen weißen Fleck etwa in der Mitte entlang der Bauchseite der Wurm18 mit einem standard Stereomikroskop erkannt werden.
      Hinweis: Um die Keimzelle zu Neuron Konvertierung Phänotyp nach Erschöpfung des Lin-53zu erreichen, muss es in der elterlichen Generation (P0) aufgebraucht werden.
Das Punktesystem für die Konvertierung Phänotyp erfolgt in der folgenden Generation (Filiation F1). Um die zu einem Abbau führen Lin-53 bereits in der P0 zu erreichen, unterliegen L4 Tiere RNAi.
  • Manuell übertragen Sie 50 L4 Stadium Würmer pro Replikation mit einem Platin Draht an einem NGM-Platte, die nicht enthalten alle Bakterien und Würmer, die Abkehr von der übertragenen OP50 Bakterien lassen. Lassen Sie Würmer auf dem Teller für ca. 5 Minuten ziehen. Verwendung Bakterien von den RNAi NGM-Agar-Platten ausgesät zuvor mit Lin-53 RNAi Bakterien (oder leere Vektor-Kontrolle) an den jeweiligen RNAi-Platten übertragen.
    1. Vermeiden Sie OP50 Bakterien auf die tatsächliche RNAi-Platten übertragen. Arbeiten Sie schnell zur Minimierung von Belichtungszeit des Stammes zu höheren Temperaturen als 15 ° C.
  • Ca. 7 Tage bis F1-Nachkommen der Würmer L3-L4-Stadium erreicht inkubieren Sie Würmer auf RNAi NGM-Agar-Platten bei 15 ° C. Sie können deutlich von den P0 Tieren getrennt werden, da sie größer und dicker als der F1-Nachkommen sind.
    1. Eine Sichtkontrolle unter einem standard Stereomikroskop ob F1 Nachkommen Würmer die hervorstehenden Phänotyp der Vulva (Pvul) zeigen, wie in Abbildung 1dargestellt. RNAi gegen Lin-53 hat pleiotrope Effekte und bewirkt, dass den Pvul -Phänotyp die verwendet werden können, zu beurteilen, ob RNAi gegen Lin-53 erfolgreich war.
      Hinweis: RNAi gegen Lin-53 kann auch Tödlichkeit der F1 Embryonen führen. Dieser Effekt erhöht sich, wenn Platten für höhere Grad als 15 ° C ausgesetzt sind, bevor Tiere L3-L4-Stadium erreicht. Toten Embryonen können durch Developmental und mangelnder Schlupf erkannt werden.
    2. Inkubieren Sie Platten im Dunkeln, da IPTG lichtempfindlich ist.
  • (4) Induktion einer Keimzelle Neuprogrammierung

    1. Inkubieren Sie untersuchte RNAi-Platten mit Lin-53 und leeren Sie Vektor RNAi behandelt F1 Nachkommen für 30 min bei 37 ° C im Dunkeln, CHE-1 zu aktivieren. Verwenden Sie einen belüfteten Inkubator, da es eine effizientere Hitzeschock ermöglicht.
    2. Ermöglichen Sie Hitze-schockiert Tiere zu erholen für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln und inkubieren Sie Platten bei 25 ° C über Nacht im Dunkeln.
    3. Mit einem standard Stereomikroskop, gekoppelt an eine Lichtquelle Fluoreszenz untersuchen Tiere unter den GFP-Filter für Gcy-5prom::gfp-Signale im mittleren Körperbereich der Würmer abgeleitet, wie in Abbildung 2dargestellt. Set Mikroskop für GLP-Signale: Erregung max. 488 nm bei Emission maximal bei 509 nm.
    4. Bewerten Sie den Grad der Keimzelle Neuron Umwandlung durch Montage Tiere mit GFP Signale im mittleren Körperbereich auf Agar-Pad-haltigen Mikroskopie Folien19.
      1. Die Anzahl von Tieren, die die Keimzelle zur Neuron Umkehr vs. dunkle Tiere zur Bewertung der Phänotyp-Penetranz. In der Regel zeigen rund 30 % der Tiere diskrete GFP Signale in die Keimbahn auf Lin-53 Erschöpfung, wobei nicht mehr als 5 % der Tiere in die Keimbahn bei leerer Vektor RNAi diffuse GFP Signale zeigen.

    Representative Results

    Wie in Abbildung 1dargestellt, veranschaulichen F1-Tiere, die den Pvul Phänotyp aufweisen erfolgreiche Anwendung von Lin-53 RNAi. Diese Tiere sind anfällig für die Umrechnung von ihre Keimzellen ASE Neuron-ähnliche Zellen nach Hitzeschock Induktion von Che-1 Überexpression zu ermöglichen, wie in Abbildung 2dargestellt. Im Gegensatz zu Würmern, die auf das Steuerelement leer wuchs Vektor RNAi Lin-53 RNAi Behandlung Tiere, die Anzeige ektopische GFP-Signale im mittleren Körperbereich erbringt nach Hitzeschock und 25 ° C Inkubation über wie beschrieben früheren4, Nacht 8. genauere Untersuchung unter einem Mikroskop Epifluoreszenz dieser Würmer zeigt, dass die Zellen zeigen GFP Signale auch Neuron des Rumpfes (Abbildung 2 b, weiße Pfeile) angezeigt, die typisch für neuronale Zellen sind. Wenn RNAi gegen Lin-53 nicht erfolgreich war oder Hitzeschock Bedingungen unangemessen waren werden GFP Signale mit denen Kontrolle RNAi behandelte Tieren (Abbildung 2) ähneln. Wichtig ist, zu vermeiden, Überexpression des Che-1 durch Hitze Induktion Induktion, bevor Tiere Mitte L3-Stadium zu erreichen. Tiere, die zu jung zum Zeitpunkt der Che-1 Überexpression Induktion waren können ektopische Gcy-5prom::gfp Ausdruck in anderen Regionen des Körpers wie der Entwicklung Vulva anzeigen, wie in Abbildung 3-13gezeigt.

    Figure 1
    Abbildung 1: Pvul Phänotyp verursacht durch RNAi gegen Lin-53. (Oben) DIC-Bild von L4/junge Erwachsenstadium F1 Nachkommen Würmer von Kontrolle oder Lin-53 RNAi behandelt Mütter abgeleitet. Skalieren von Balken = 20 µm. (unten) Tiere mit Lin-53 RNAi Anzeige der hervorstehenden Vulva (Pvul)-Phänotyp (schwarze Pfeilspitzen) behandelt. Der Phänotyp der Pvul bestätigt, dass RNAi gegen Lin-53 erfolgreich war. Skalieren von Balken = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 2
    Abbildung 2: Würmer mit erfolgreich reprogrammierten Keimzelle in Neuronen. (A) BAT28 Belastung Tiere gewachsen auf dem leeren Vektor zeigen keine GFP Signale in die Keimbahn nach Hitzeschock Induktion von Che-1 Überexpression. Weiße gestrichelte Konturen Wurm. Skalieren von Balken = 20 µm. (B) im Gegensatz zu BAT28 Sorte Tiere angebaut auf der leeren Vektorregelung RNAi Tiere gewachsen auf Lin-53 RNAi Displayanzeigen Gcy-5prom::gfp im mittleren Körperbereich. Bilder von Mid Textabschnitt mit GFP Signale genommen bei 63 X Vergrößerung offenbaren GFP-positiven Zellen zeigen Vorsprünge (weiße Pfeilspitzen). Diese morphologische Funktion zeigt, dass Keimzellen Umwandlung in ASE Neuron-ähnliche Zellen unterzogen. Weiße Sternchen kennzeichnen Darm abgeleitet Auto-Fluoreszenz. Alle Bilder wurden mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit 20 X Vergrößerung und 63 X Vergrößerung erworben. Gestrichelte weiße Linie umreißt Würmer. Skalieren von Balken = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 3
    Abbildung 3: Frühen Stadium Wurm mit ektopische GFP. BAT28 Sorte Tiere auf die leere Vektor RNAi-Bakterien, die Hitze-Schock für Che-1 Überexpression an frühen Larvenstadien wie L2 induziert wurden angebaut zeigen GFP Signale im mittleren Körperbereich (weiße Sternchen). Diese Signale sind nicht durch Umprogrammierung Keimzelle. Weiße gestrichelte Konturen Wurm. Skalieren von Balken = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Discussion

    Während die beschriebene Protokoll mit den transgenen C. Elegans strain BAT28 und RNAi gegen Lin-53 ist einfach, eine Reihe von Schritten sind entscheidend in der Reihenfolge um das erwartete Ergebnis der Keimzelle zu Neuron Umprogrammierung zu gewährleisten. Es ist wichtig, dass der Stamm BAT28 zu allen Zeiten vor den Experimenten bei 15 ° C gehalten wird. Bei der Handhabung und Wartung der Belastung muss die Zeit bei Temperaturen über 15 ° C minimiert werden so weit wie möglich. Richtige Hitze-Schock-Bedingungen sind wichtig, da ungenügende Induktion von Che-1 Überexpression nicht Keimzelle zur ASE Neuron Bekehrung führt. Dies kann durch Messung der Phänotyp-Penetranz, wie im Protokoll beschrieben detektiert werden. Umfangreiche Hitzeschock kann zu Letalität der Tiere führen. Zum Beispiel Erfahrung Platten, die oft in der Nähe von den Innenwänden oder auf dem unteren Boden eine statische Luft Inkubator platziert wurden umfangreiche Wärmebehandlung. Daher empfiehlt es sich, einen belüftete Hitze Inkubator zu verwenden. Darüber hinaus ist das Timing der Hitzeschock Induktion kritisch, da Überexpression des Che-1 während der Larvenstadien früher dann L3 auf ektopische Gcy-5prom::gfp Induktion in unterschiedlichen Körperregionen wie der Vulva (Abbildung 3) führen können 9. Darüber hinaus umfangreiche Hitzeschock kann durch den Phänotyp-Penetranz in leerer Vektor RNAi-Tiere, die nicht 5 % und erhöhte Auto-Fluoreszenz anderer Gewebe, nämlich den Darm auszudehnen nachgewiesen werden.

    RNAi Bakterien können sporadisch, ihre Tätigkeit um effizient produzieren DsRNA des Zielgens verlieren. Leider kann dies nicht erkannten vor der RNAi-Experiment werden. In solchen Fällen sollten ein frischen Streifen aus dem Glycerin angebaut werden, wie in Abschnitt 2 des Protokolls beschrieben. Wenn gibt es noch keine RNAi verursacht pleiotrope Phänotyp sichtbar, wie der Pvul -Phänotyp durch erfolgreiche RNAi gegen Lin-53, dann ein Plasmid DNA-Isolierung aus den jeweiligen Bakterien verursacht durchgeführt werden sollte und frische HT115 Bakterien müssen sein mit dem L4400 Plasmid mit dem Lin-53 -Sequenz transformiert.

    Wichtig ist, der BAT28 Stamm hat eine Walze Phänotypus verursacht durch die Injektion Marker pRF4, die verwendet wurde, während der Transgenese der Tiere mit der Hsp-16.2prom::che-1 DNA-Konstrukt. Gelegentlich Tiere verlieren den rollenden Phänotyp, die darauf hinweisen kann, Schweigen der der Hsp-16.2prom::che-1 Transgen. Um die BAT28 Belastung richtig zu halten, wählen Sie 10 Roller Tiere zu einem frischen Teller und propagieren Sie Auswahl für das rollende Tiere zu.

    Die Anwendung des Protokolls beschränkt sich auf das F1 RNAi-Verfahren, was bedeutet, dass Tiere, deren Eltern (P0 Generation) Lin-53 RNAi nicht ausgesetzt wurde, Keimzelle zu Neuron-Umstellung aufgrund mütterlicher Rescue4nicht angezeigt werden. Ein alternatives Verfahren Keimzellen in Neuronen zu konvertieren ist durch Ciosk und Kollegen15 mit RNAi Knock-down Gld-1 und Mex-3 ohne Überexpression des einen Transkriptionsfaktor beschrieben worden. Jedoch die erhaltenen Neuronen gehören nicht zu einer bestimmten Art von Neuronen und Keimzellen umwandeln auch Muskel-wie Zellen auf RNAi-vermittelten Erschöpfung der Gld-1 und Mex-315. Zuvor hat es bewiesen die RNAi gegen Lin-53 erlaubt Keimzelle Umwandlung in GABAergen Neuronen-wie Zellen bei der Überexpression des Transkriptionsfaktors Pitx-Typ Homoedomain UNC-3016 anstelle von CHE-14 . Für zukünftige Richtungen kann verschiedene Schicksal-induzierende Transkription Faktoren geprüft werden können, ob Lin-53 Keimzellen erschöpft in andere Zelltypen als spezifische Neuronen umgewandelt werden. In diesem Zusammenhang induziert Überexpression des myogen bHLH Transkriptionsfaktors HLH-1, Homolog der Säugetier-MyoD17, Umstellung der Keimzelle auf Muskeln auf Lin-53 RNAi5. Die etablierten Umprogrammierung der Keimzellen zu einer bestimmten Körperzelle Typ auf Lin-53 RNAi und Überexpression von einer entsprechenden Schicksal-induzierende Transkriptionsfaktor kann für eine Reihe von verschiedenen genetischen Bildschirmen verwendet werden. Solche Bildschirme Suppressor oder Enhancer können helfen, sezieren regulatorische Signalwege, die in Zelle Schicksal Konvertierung eine Rolle spielen.

    Disclosures

    Die Autoren haben erklärt, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.

    Acknowledgments

    Wir danken Alina El-Khalili und Martina Hajduskova für technische Hilfe. Wir danken Mitglieder des Arbeitskreises Tursun für Kommentare an das Manuskript. Diese Arbeit wurde gesponsert von der ERC-StG-2014-637530 und ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 und stützt sich auf die Max-Biophysik-Centrum für Molekularmedizin in der Helmholtz-Gemeinschaft.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chemicals 
    Agar-Agar, Kobe I Roth 5210.1
    Bactopeptone  A. Hartenstein GmbH 211 677 Peptone Media 
    Yeast extract  AppliChem A1552,0100
    Amphotericin B USBiological A2220
    CaCl2 Merck Biosciences 208290
    Cholesterol Roth 8866.2
    Gelatine Roth 4275.3
    IPTG Sigma 15502-10G
    K2PO4 Roth T875.2
    KH2PO4 Roth  3904.2
    MgSO4 VWR 25,163,364
    Na2HPO4 Roth P030.1
    NaCl Roth 9265.1
    NaClO Roth 9062.3
    NaOH (5 N) Roth  KK71.1
    Tris Roth AE15.2
    Carbenicillin Roth 634412
    Tetracycline Roth 2371.2
    Incubators
    Incubator  New Brunswick Scientific C24 M1247-0052 for heat-shock
    Incubator  Sanyo MIR-5 5534210 for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
    Microscopes
    Fluorescence microscope M205 FA Leica
    Microscope (Imaging) + camera Axio Imager 2 Zeiss
    Microscope (Imaging) + camera Sensicam PCO
    Stereomicroscope SMZ745 Nikon
    Bacterial strains
    Escherichia coli HT115 F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5
    promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse
    III minus).
    Escherichia coli OP50  Uracil auxotroph E. coli strain
    Worm strains
    BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::
    3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.
    derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
    RNAi Clones
    lin-53 SourceBioscience ID I-4D14 Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
    empty vetor: L4440 Addgene  #1654
    Misc.
    Worm pick  self-made using a pasteur pipette and a platinum wire

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, (6), (1987).
    2. Ebrahimi, B. Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency. Cell Regen. 1-12 (2015).
    3. Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes. Trends Gent. 32, (1), 29-41 (2016).
    4. Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types. Science. 331, (6015), 304-308 (2011).
    5. Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types. Cell Rep. 1-9 (2012).
    6. Etchberger, J. F., et al. The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron. Genes Dev. 21, (13), 1653 (2007).
    7. Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc Nat Acad Sci. USA. 94, (7), 3384-3387 (1997).
    8. Seelk, S., et al. Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons. eLife. 5, (2016).
    9. Patel, T., Hobert, O. Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity. eLife. 6, e24100 (2017).
    10. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis Elegans. Genetics. 77, (1), 71 (1974).
    11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
    12. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. (2006).
    13. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, (6920), 231-237 (2003).
    14. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 18, (1), 419357 (2000).
    15. Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline. Science. 311, (5762), 851-853 (2006).
    16. Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein. Nature. 372, (6508), 780-783 (1994).
    17. Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm. Development. 125, (13), 2479-2488 (1998).
    18. Ullrich, M., Liang, V., et al. Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans . Nat Protoc. 9, (9), 2237-2255 (2014).
    19. Shaham, S. Methods in cell biology. WormBook. 1-75 (2006).
    Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in <em>C. elegans</em>
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    Kolundzic, E., Seelk, S., Tursun, B. Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans. J. Vis. Exp. (131), e56889, doi:10.3791/56889 (2018).More

    Kolundzic, E., Seelk, S., Tursun, B. Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans. J. Vis. Exp. (131), e56889, doi:10.3791/56889 (2018).

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