Hurtig og præcis registrering af plante patogener på stedet, især jord-bårne patogener, er afgørende for at forhindre yderligere inokulum produktion og spredning af plantesygdomme i feltet. Metoden er udviklet, her ved hjælp af en bærbar real-time PCR detection system giver mulighed for onsite diagnose under markforhold.
On-site diagnose af plantesygdomme kan være et nyttigt redskab for avlere for rettidige beslutninger gør det muligt for den tidligere gennemførelse af strategier til håndtering af sygdom, at reducerer virkningerne af sygdommen. I øjeblikket i mange diagnostiske laboratorier, polymerase-kædereaktion (PCR), især real-time PCR, betragtes som den mest følsomme og præcis metode til plante patogen detektion. Laboratorium-baseret PCR’er kræver dog typisk dyre laboratorieudstyr og faglært personale. I denne undersøgelse, er jord-bårne patogener af kartoffel bruges til at demonstrere potentialet for on-site molekylær detektion. Dette blev opnået ved hjælp af en hurtig og enkel protokol bestående af magnetiske perle-baserede nukleinsyre udvinding, bærbare real-time PCR (fluorogenic sonde-baseret analyse). Den bærbare real-time PCR metode sammenlignet positivt med et laboratorium-baseret system, afsløre så lidt som 100 kopier af DNA fra Spongospora subterranea. Den bærbare real-time PCR metode udviklet her kan tjene som et alternativ til laboratorie-baserede tilgange og en nyttig on-site værktøj for patogenet diagnose.
Præcis og hurtig identifikation af sygdomsfremkaldende patogener væsentligt påvirker beslutninger vedrørende plante sygdom management. Jord-bårne sygdomme er særligt vanskelige at diagnosticere fordi jord miljø er ekstremt store i forhold til anlæg, massive og komplekse, hvilket gør det en udfordring at forstå alle aspekter af jord-bårne sygdomme. Derudover jord-bårne sygdomme kan være symptomfri i tidlig infektion faser, afhængig af miljømæssige stressfaktorer, og nogle har lange latente perioder, der resulterer i forsinkede diagnoser1. Mange jord-bårne patogener har udviklet overlevelse strukturer, såsom specialiserede sporer eller melanized hyfer, som kan overleve i jorden i mange år selv i mangel af deres værter. Udnyttede tilgange til forvaltning af jord-bårne sygdomme omfatter: undgå kendte angrebne områder, ved hjælp af patogenfrie certificeret frø og planteforædlingsmateriale, holde udstyr sanitære og begrænser bevægeligheden af jord og vand når det er muligt. Viden om patogen tilstedeværelse gennem molekylær detektion strategier kan også spille en nyttig rolle ved at informere rettidige beslutninger vedrørende tidlige behandlinger eller pre plante vurderinger af felterne. On-site test giver yderligere fordele ved at give et hurtigt resultat uden at sende prøven til et laboratorium, der diagnosticerer, måske nogle afstand væk og også kan engagere producenten hvis sådan en diagnose er udført ‘felt-side’ i deres tilstedeværelse.
For on-site diagnose baseret på molekylær detektion, følsomhed, specificitet, robusthed (repeterbarhed og reproducerbarhed) og effektivitet (dvs., enkelhed og omkostninger ydeevne) er afgørende faktorer i betragtning. Lateral flow enheder (LFDs) som Immunostrip og PocketDiagnostic, er populære metoder til on-site patogen detektion på grund af deres enkelhed som en et-trins assay. LFDs kan dog ikke være lige diagnosticeringsværktøjet i alle situationer, fordi de mangler den følsomhed og specificitet, og lejlighedsvis giver tvetydige resultater hvis målet patogen er i lave koncentrationer og kan krydsreagere med lignende arter eller slægter 2. Loop-medieret isotermisk forstærkning (lampe) er også gældende for ejendommen patogen detektion og er særdeles billig lavpris-reagenser, reaktionsbetingelser, der forbliver konstante og enkel kolorimetriske visuel analyse. Men både LFDs og lampe bruges typisk kvalitativt, selvom begge metoder kan bruges kvantitativt med dyrere udstyr3. Polymerasekædereaktionen (PCR) tilbyder høj specificitet, høj følsomhed, og en kvantitativ kapacitet i forhold til de ovennævnte metoder til påvisning. Men konventionelle lab-baserede PCR teknologien kræver dyre laboratorieudstyr og kvalificeret personale, som er en stor ulempe ved at vedtage denne teknologi som en påvisningsmetode for stedets formål.
I denne protokol, er en on-site diagnostisk metode ved hjælp af en transportabel real-time PCR instrument påvist. Real-time PCR teknologien tilbyder fordele frem for andre metoder hvad angår kvantitative nøjagtighed, følsomhed og alsidighed, og har været meget anvendt til påvisning af en bred vifte af plante patogener4,5, herunder forskellige kartoffel patogener i jord6. På grund af de seneste tendenser i den hurtigt voksende og konkurrencedygtigt marked fortsat udstyr, der kræves for PCR teknologien udvikle sig til at blive mere kompakte og mindre dyre7. Protokollen er sammensat af følgende trin: magnetisk bead-baserede nukleinsyre udvinding, bærbare real-time PCR (fluorogenic sonde-baseret analyse) og analyse af kvantitative data, der kan gøres alle fjernt benytter en bærbar computer (figur 1).
Ved hjælp af den bærbare PCR-protokol udviklet her, jordprøver blev analyseret for at opdage den jord-bårne patogener, Spongospora subterranea. Spongospora blev valgt, da det er en vigtig kartoffel patogen som den kausale agens af pulverformige skurv8. I de seneste årtier, er tilstedeværelsen af denne sygdom anses for at have spredt sig til mange regioner hvor kartoflerne dyrkes9,10. Pulverformige skurv, gennem tilstedeværelsen af bums som læsioner på knoldene kan forårsage betydelige kvalitative udbyttetab for kartoffelavlere. Derudover kan S. subterranea vektor kartoffel Mop Top Virus (PMTV), som kan forårsage indre læsion symptomer i knolde (kendt som treklør)11,12. Derfor er det vigtigt at vide hvis S. subterranea er til stede i felter før plantning6. Vi også påvise nytten af denne protokol til påvisning af Rhizoctonia solani anastomose gruppe 3 (AG3) og PMTV. Selvom flere anastomose grupper af Rhizoctonia solani forårsage sygdomme i kartofler, AG3 er velsagtens den mest vigtige verdensomspændende13, forårsager stammen fordærve og sort skællende resulterer i markedsmæssige udbyttetab på op til 30%14. PMTV forårsager nekrotiske læsioner inden for knolde, der almindeligvis kaldes treklør. Denne virus er for nylig blevet rapporteret for første gang i flere stater i Pacific Northwest15,16,17, og er af stigende bekymring for avlerne i denne vigtige kartoffel voksende region. Ud over bestemmelse af effektiviteten af bærbare PCR for disse vigtige sygdomme, optimale DNA udvinding metoder og jord prøvestørrelse blev også undersøgt i denne undersøgelse.
Resultaterne tyder på, at den bærbare PCR metode er alsidig og anvendes til påvisning af forskellige patogener. On-site detektion metode vi udviklede kan tillade de frontline arbejdstagere i landbruget (fx avlere) at tage tidligere beslutninger vedrørende forvaltning af sygdom, såsom forskellige markeringer eller rotationer, og kan kvantificere en plante patogen i stikprøven under et felt undersøgelse, før plantning, for at undgå potentielle sygdomsudbrud.
Som vist i tabel 1, øget de seneste teknologiske fremskridt i den molekylære identifikation af patogene agenser effektivitet, nøjagtighed og hastighed af diagnose, som har bidraget til påvisning af pre symptomatisk infektioner27. Om egen diagnose, lampe og lateral-flow metoder anvendes ofte fordi de er bærbare og giver øjeblikkelige resultater til en lavere pris. I tilfælde af serologiske metoder, kan det være svært at opnå med artsspecifikke påvisning. Dette forårsager lejlighedsvis misdetection af off-target mikrober såsom fælles jord indbyggere. For eksempel kan der være cross reaktivitet mellem de serologiske test af Phytophthora spp. og Pythium spp. for kartoffel patogener28, der angiver, at der er undertiden vanskeligheder afsløre den målrettede plante patogener.
I den foreliggende undersøgelse, har vi udviklet en optimeret protokol for on-site molekylær detektion af jord-bårne kartoffel patogener ved hjælp af bærbare real-time PCR systemet ved at sammenligne sin kapacitet med en konventionel lab-baseret real-time PCR system. Vi fandt, at metoden på stedet specifikt registrerer kartoffel patogener i jordprøve, selvom følsomhed er ~ 10 gange lavere end i en tilsvarende lab-baseret analyse. Det er også værd at overveje, at i dette tilfælde både laboratorium og field test ikke bruge en biologisk relevant stikprøvestørrelse. Store stikprøvestørrelser er påkrævet til brug i rutinemæssigt screening felt jord som tidligere beskrevet29,30, hvor stikprøver af mellem 250 g til 1 kg behandles, selv om disse metoder kræver dygtige erhvervsdrivende og sofistikerede udstyr til at udtrække DNA. Typisk, en storstilet jord DNA uddrag er taget fra en enkelt samlet jord prøve repræsentant for talrige delprøver over 1-4 ha6,29,30. Dog protokollens udviklet her er hurtig, nem at bruge for brugere uden forudgående erfaring i molekylær diagnostik og kan bruges uden for et laboratorium. Da metoden er hurtig og relativt billigt i forhold til store jord udvinding, kunne det bruges til at screene mange små prøver taget fra en lignende prøveudtagning område til store samlede prøver. Dette kunne løse nogle af manglerne ved en lille stikprøvestørrelse og fastlægge yderligere oplysninger om den geografiske fordeling af patogenet i feltet. Derudover portabilitet og hastighed af metoden betyder, at det også kan bruges i demonstrationsaktiviteter til avlerne til pædagogiske og engagement formål.
En anden overvejelse er, at mange real-time PCR assays allerede er offentliggjort til en bred vifte af plante patogener5. Dette system kan gøre brug af disse eksisterende assays uden behov for at designe nye lampe primere til at aktivere i feltforsøg. En hyppig kritik af lampe assays er, at de kan være vanskelige at designe31. Bærbare PCR, tillader derfor relativt lette gennemførelsen af en bred vifte af let tilgængelige patogen tests for on-site test.
Traditionelle metoder kan være ofte dyre, besværlige, unøjagtige og tidskrævende. Enkelheden i den on-site metode vi udviklede tillader avlere og arbejdstagere til at udføre patogen detektion af sig selv og måske skabe et resultat meget hurtigere end at sende til et laboratorium, der diagnosticerer der kunne være et stykke væk. Hurtighed og følsomheden af de bærbare PCR-metode kan hjælpe avlere undgå potentiale sekundære infektioner, som kan yderligere øge patogen befolkning og utilsigtet spredning (via udstyr eller mennesker). Afslutningsvis giver metoden on-site udviklet i den nuværende undersøgelse nøjagtige og relativt følsomme påvisning af vigtige jord-bårne patogener i feltet. Vores håb er, at metoden på stedet udviklet i denne undersøgelse vil bidrage i en nuværende diagnostiske rørledning (figur 6), ikke kun ved at levere hurtig og præcis svar på epidemiologiske spørgsmål om plantesygdomme i feltet, men også ved at give øget forståelse af den biologi og epidemiologi af plante patogener.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Dr. Neil C. Gudmestad på North Dakota State University for at give S. subterranea plasmid DNA, Dr. Hanu Pappu på Washington State University (WSU) for at give PMTV RNA, og Dr. Debra Inglis på WSU for at levere R. solani AG3. En særlig tak til Dr. Jeremy Jewell på WSU for at give kommentarer på manuskriptet og WSU CAHNRS kommunikation for videography. Denne forskning blev støttet af nordvest kartoffel forskningskonsortium og Washington State Department of Agriculture – speciale afgrøde bloktilskud Program (give nr. K1764). PPNS nr. 0741, Institut for Plantepatologi, College of Agriculture, menneskelige og naturlige ressourcer videnskaber, landbrugs Forskningscenter, Hatch projekt nr. WNP00833, Washington State University, Pullman, WA, USA.
White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
Masterclear cap strips & real‑time PCR tube strips | Eppendorf | 9510222109 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |