तेजी से और सही पता लगाने के संयंत्र के रोगजनकों पर साइट, विशेष रूप से मिट्टी जनित रोगजनकों, आगे इनोक्युलम उत्पादन और क्षेत्र में संयंत्र रोगों के प्रसार को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । एक पोर्टेबल वास्तविक समय पीसीआर का पता लगाने प्रणाली का उपयोग कर यहां विकसित विधि क्षेत्र की स्थितियों के तहत साइट निदान पर सक्षम बनाता है ।
पर-संयंत्र रोगों के निदान रोग प्रबंधन रणनीतियों है कि रोग के प्रभाव को कम करने के पहले कार्यांवयन को सक्षम करने के लिए समय पर निर्णय के लिए उत्पादकों के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है । वर्तमान में कई नैदानिक प्रयोगशालाओं में, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), विशेष रूप से वास्तविक समय पीसीआर, संयंत्र रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए सबसे अधिक संवेदनशील और सटीक तरीका माना जाता है । हालांकि, प्रयोगशाला आधारित पीसीआर आम तौर पर महंगी प्रयोगशाला उपकरण और कुशल कर्मियों की आवश्यकता है । इस अध्ययन में, आलू की मिट्टी जनित रोगजनकों पर साइट आणविक पता लगाने के लिए क्षमता का प्रदर्शन किया जाता है । यह चुंबकीय मनका आधारित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, पोर्टेबल वास्तविक समय पीसीआर (fluorogenic जांच आधारित परख) के शामिल एक तेजी से और सरल प्रोटोकॉल का उपयोग कर हासिल किया गया था । पोर्टेबल वास्तविक समय पीसीआर दृष्टिकोण एक प्रयोगशाला आधारित प्रणाली, के रूप में कुछ के रूप में Spongospora subterranea से डीएनए की १०० प्रतियां का पता लगाने के साथ तुलना में । पोर्टेबल रीयल-टाइम पीसीआर विधि यहां विकसित प्रयोगशाला आधारित दृष्टिकोण के लिए एक विकल्प के रूप में सेवा कर सकते है और एक उपयोगी पर रोगज़नक़ निदान के लिए साइट उपकरण ।
रोगज़नक़ों की सटीक और तेजी से पहचान काफी प्रभाव संयंत्र रोग प्रबंधन के बारे में निर्णय । मृदा जनित रोगों का निदान करना विशेष रूप से कठिन होता है क्योंकि मिट्टी का वातावरण पौधा द्रव्यमान के सापेक्ष अत्यंत बड़ा होता है, और जटिल होता है, जिससे मृदा जनित रोगों के सभी पहलुओं को समझने की चुनौती प्राप्त होती है । इसके अलावा, मिट्टी जनित रोग प्रारंभिक संक्रमण चरणों के दौरान, पर्यावरणीय तनावों पर निर्भर हो सकता है, और कुछ लंबे समय तक अव्यक्त है कि देरी निदान में परिणाम है1। कई मिट्टी जनित रोगजनकों ने जीवित संरचनाओं को विकसित किया है, जैसे कि विशेष बीजाणु या melanized hyphae, जो कई वर्षों तक मिट्टी में भी अपने मेजबानों के अभाव में जीवित रह सकते हैं । मिट्टी जनित रोग प्रबंधन के लिए उपयोग किए गए तरीकों में शामिल हैं: ज्ञात संक्रमित खेतों से परहेज, रोगज़नक़ मुक्त प्रमाणित बीज और अंकुर का उपयोग, उपकरण सैनिटरी रखने, और मिट्टी और पानी की आवाजाही को प्रतिबंधित जब संभव हो । आणविक खोज रणनीतियों के माध्यम से रोगज़नक़ उपस्थिति का ज्ञान भी समय पर जल्दी चरण उपचार या खेतों के पूर्व संयंत्र आकलन के बारे में निर्णय सूचित करके एक उपयोगी भूमिका निभा सकते हैं । पर साइट परीक्षण एक नैदानिक प्रयोगशाला है कि शायद कुछ दूर दूरी के लिए नमूना भेजने के बिना एक तेजी से परिणाम प्रदान करने के अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है और भी अगर इस तरह के एक नैदानिक प्रदर्शन किया जाता है ‘ क्षेत्र की ओर ‘ उनकी उपस्थिति में शामिल कर सकते हैं ।
आणविक पता लगाने, संवेदनशीलता, विशिष्टता, मजबूती (दोहराव और reproducibility) के आधार पर साइट निदान के लिए, और दक्षता (यानी, सादगी और लागत प्रदर्शन) विचार के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं । पार्श्व प्रवाह उपकरणों (LFDs) ऐसे Immunostrip और PocketDiagnostic के रूप में, पर साइट के लिए लोकप्रिय तरीके है क्योंकि उनकी सादगी के एक कदम परख के रूप में रोगज़नक़ का पता लगाने । हालांकि, LFDs सभी स्थितियों में सही निदान उपकरण नहीं हो सकता है क्योंकि वे संवेदनशीलता और विशिष्टता की कमी है, और कभी कभार अस्पष्ट परिणाम प्रदान करता है अगर लक्ष्य रोगज़नक़ कम सांद्रता में है और समान प्रजातियों या पीढ़ी के साथ परस्पर प्रतिक्रिया कर सकते हैं 2. लूप मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (लैंप) भी पर साइट रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए लागू है और विशेष रूप से कम लागत वाले रिएजेंट, प्रतिक्रिया शर्तों है कि लगातार रहने के कारण सस्ती है, और सरल वर्णमिति दृश्य विश्लेषण । हालांकि, दोनों LFDs और दीपक आम तौर पर गुणात्मक उपयोग किया जाता है, हालांकि दोनों दृष्टिकोण मात्रात्मक अधिक महंगा उपकरण3के साथ उपयोग किया जा सकता है । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) उच्च विशिष्टता, उच्च संवेदनशीलता, और पता लगाने के aforementioned तरीकों की तुलना में एक मात्रात्मक क्षमता प्रदान करता है । हालांकि, पारंपरिक प्रयोगशाला आधारित पीसीआर प्रौद्योगिकी महंगी प्रयोगशाला उपकरण और कुशल कर्मियों की आवश्यकता है, जो इस प्रौद्योगिकी को साइट के प्रयोजनों के लिए एक पहचान पद्धति के रूप में अपनाने में एक प्रमुख नुकसान है ।
इस प्रोटोकॉल में, एक पोर्टेबल रीयल-टाइम पीसीआर इंस्ट्रूमेंट का उपयोग करके साइट पर नैदानिक विधि प्रदर्शित की जाती है । वास्तविक समय पीसीआर प्रौद्योगिकी मात्रात्मक सटीकता, संवेदनशीलता, और बहुमुखी प्रतिभा के मामले में अंय तरीकों से अधिक लाभ प्रदान करता है, और व्यापक रूप से संयंत्र की एक व्यापक रेंज का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है रोगजनकों4,5, सहित विभिंन 6मिट्टी में आलू रोगजनकों । तेजी से बढ़ रहा है, प्रतिस्पर्धी बाजार के हाल के रुझान के कारण, पीसीआर प्रौद्योगिकी के लिए आवश्यक उपकरणों के लिए और अधिक कॉंपैक्ट और कम महंगा7विकसित करने के लिए जारी रखा है । प्रोटोकॉल निम्नलिखित चरणों से बना है: चुंबकीय मनका-आधारित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, पोर्टेबल वास्तविक समय पीसीआर (fluorogenic जांच आधारित परख), और मात्रात्मक डेटा विश्लेषण है कि सब कुछ दूर से किया जा सकता है एक लैपटॉप कंप्यूटर का उपयोग कर (चित्रा 1) ।
यहां विकसित पोर्टेबल पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, मिट्टी जनित रोगज़नक़, Spongospora subterraneaका पता लगाने के लिए मिट्टी के नमूनों का विश्लेषण किया गया । Spongospora के रूप में यह पाउडर पपड़ी8के कारण एजेंट के रूप में एक महत्वपूर्ण आलू रोगज़नक़ है चुना गया था । हाल के दशकों में, इस रोग की उपस्थिति कई क्षेत्रों में फैल गया है, जहां आलू9,10उगाया जाता है माना जाता है । कंद पर घावों की तरह दाना की उपस्थिति के माध्यम से पाउडर पपड़ी, आलू उत्पादकों के लिए काफी गुणात्मक उपज नुकसान हो सकता है । इसके अलावा, एस subterranea वेक्टर आलू रिटॉप वायरस (सॐवा), जो कंद (spraing के रूप में जाना जाता है) में आंतरिक घावों के लक्षण पैदा कर सकता है11,12। इसलिए, यदि S. subterranea 6रोपण से पहले खेतों में मौजूद है पता करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम भी Rhizoctonia सोलानी सम्मिलन समूह 3 (AG3) और सॐवा का पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं । हालांकि Rhizoctonia सोलानी के कई सम्मिलन समूहों आलू में रोगों के कारण, AG3 यकीनन सबसे महत्वपूर्ण दुनिया भर में13है, जिससे स्टेम नासूर और काले स्कर्फ़ के लिए 30%14तक की विपणन उपज घाटे में जिसके परिणामस्वरूप । सॐवा कंद के भीतर गल घावों का कारण बनता है, जिसे सामान्यतः spraing कहा जाता है । यह वायरस हाल ही में प्रशांत पश्चिमोत्तर15,16,17में कई राज्यों में पहली बार के लिए रिपोर्ट किया गया है, और इस महत्वपूर्ण आलू उगाने वाले क्षेत्र में उत्पादकों के लिए बढ़ती चिंता का विषय है । इन महत्वपूर्ण रोगों के लिए पोर्टेबल पीसीआर की प्रभावशीलता का निर्धारण करने के अलावा, इष्टतम डीएनए निष्कर्षण पद्धति और मृदा नमूना आकार भी इस अध्ययन में जांच की गई ।
परिणाम सुझाव है कि पोर्टेबल पीसीआर विधि बहुमुखी और अलग रोगजनकों का पता लगाने के लिए लागू है । हम विकसित पर साइट का पता लगाने की विधि कृषि में सीमावर्ती श्रमिकों (जैसे, उत्पादकों) रोग प्रबंधन के बारे में पहले निर्णय लेने के लिए अनुमति दे सकते हैं, इस तरह के प्रकार चयन या घुमाव के रूप में, और नमूने में एक संयंत्र रोगज़नक़ मात्रा कर सकते हैं एक क्षेत्र सर्वेक्षण के दौरान, रोपण से पहले, संभावित बीमारी फैलने से बचने के लिए ।
के रूप में 1 तालिकामें दिखाया गया है, रोगजनक एजेंटों की आणविक पहचान में हाल ही में तकनीकी विकास प्रभावकारिता, सटीकता, और निदान की गति, जो पूर्व रोगसूचक संक्रमण27का पता लगाने के लिए योगदान दिया है वृद्धि हुई है । के बारे में साइट निदान, दीपक और पार्श्व प्रवाह तरीकों अक्सर इस्तेमाल किया क्योंकि वे पोर्टेबल है और एक कम कीमत पर तत्काल परिणाम प्रदान कर रहे हैं । हालांकि, सीरम वैज्ञानिक तरीकों के मामले में, प्रजातियों विशेष का पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है । इस तरह के आम मिट्टी के निवासियों के रूप में बंद लक्ष्य रोगाणुओं का कभी-कभार पता लगाने का कारण बनता है । उदाहरण के लिए, वहाँ के सीरम वैज्ञानिक परीक्षणों के बीच क्रॉस जेट हो सकता है फाईटोप्थोरा एसपीपी. and Pythium एसपीपी. आलू रोगजनकों के मामले में 28, यह दर्शाता है कि वहां कभी कभार लक्षित संयंत्र का पता लगाने कठिनाइयों कर रहे है रोगजनकों.
वर्तमान अध्ययन में, हमने एक पारंपरिक प्रयोगशाला आधारित रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम के साथ अपनी क्षमताओं की तुलना करके पोर्टेबल रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम का उपयोग करते हुए मिट्टी जनित आलू के रोगजनकों के आणविक पता लगाने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल विकसित किया है । हमने पाया है कि साइट पर विधि विशेष रूप से मिट्टी के नमूने में आलू रोगजनकों का पता लगाता है, हालांकि संवेदनशीलता ~ 10 बार एक समकक्ष प्रयोगशाला की तुलना में कम परख आधारित है । यह भी विचार है कि इस मामले में दोनों प्रयोगशाला और क्षेत्र परीक्षण एक जैविक रूप से प्रासंगिक नमूना आकार का उपयोग नहीं किया लायक है । बड़े नमूना आकार नियमित रूप से जांच क्षेत्र मिट्टी में उपयोग के लिए आवश्यक है के रूप में पहले से वर्णित29,30, जहां २५० g के बीच 1 किलो के लिए नमूना आकार संसाधित कर रहे हैं, हालांकि इन तरीकों कुशल ऑपरेटरों और परिष्कृत की आवश्यकता उपकरण डीएनए निकालने के लिए । आम तौर पर, एक बड़े पैमाने पर मिट्टी डीएनए निकालने कई उपनमूना के एक समग्र मिट्टी नमूना प्रतिनिधि से 1 से 4 हेक्टेयर6,29,30पर लिया जाता है । हालांकि, यहां विकसित प्रोटोकॉल जल्दी है, आसानी से आणविक निदान में कोई पूर्व अनुभव के साथ उपयोगकर्ताओं के लिए उपयोग करने के लिए और एक प्रयोगशाला के बाहर इस्तेमाल किया जा सकता है । के रूप में विधि तेजी से और अपेक्षाकृत सस्ते बड़े पैमाने पर मिट्टी निष्कर्षण की तुलना में है, यह कई छोटे पैमाने पर एक समान नमूना क्षेत्र से बड़े पैमाने पर कुल नमूनों के लिए ले जाया नमूनों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह एक छोटे से नमूना आकार की कमियों में से कुछ पर काबू पाने और क्षेत्र में रोगज़नक़ के स्थानिक वितरण पर अतिरिक्त जानकारी का निर्धारण कर सकता है । इसके अलावा, पोर्टेबिलिटी और विधि की गति का मतलब है कि यह भी प्रदर्शन गतिविधियों में शैक्षिक और सगाई प्रयोजनों के लिए उत्पादकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
एक और विचार है कि कई वास्तविक समय पीसीआर परख पहले से ही संयंत्र रोगजनकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रकाशित कर रहे है5। इस प्रणाली के लिए नए लैंप प्राइमरों के डिजाइन की आवश्यकता के बिना इन मौजूदा परख का उपयोग कर सकते है क्षेत्र परीक्षण में सक्षम है । दीपक परख की एक लगातार आलोचना है कि वे31डिजाइन मुश्किल हो सकता है । पोर्टेबल पीसीआर, इसलिए, पर साइट परीक्षण के लिए आसानी से उपलब्ध रोगज़नक़ परीक्षणों की एक विस्तृत श्रृंखला के अपेक्षाकृत आसान कार्यांवयन की अनुमति देता है ।
पारंपरिक तरीकों अक्सर महंगा हो सकता है, श्रमसाध्य, गलत, और समय लेने वाली । पर साइट की सादगी हम विकसित की अनुमति देता है उत्पादकों और उद्योग श्रमिकों को स्वयं द्वारा रोगजनक पता लगाने के प्रदर्शन और शायद एक बहुत जल्दी एक नैदानिक प्रयोगशाला है कि कुछ दूर हो सकता है के लिए भेजने से परिणाम उत्पंन । मुस्तैदी और पोर्टेबल पीसीआर विधि की संवेदनशीलता में मदद कर सकते हैं उत्पादकों संभावित द्वितीयक संक्रमण से बचने, जो रोगज़नक़ आबादी और अनजाने प्रसार की वृद्धि कर सकते हैं (उपकरण या मनुष्यों के माध्यम से). अंत में, साइट वर्तमान अध्ययन में विकसित की विधि क्षेत्र में महत्वपूर्ण मिट्टी जनित रोगजनकों के सटीक और अपेक्षाकृत संवेदनशील पता लगाने में सक्षम बनाता है । हमारी आशा है कि इस अध्ययन में विकसित साइट पर एक वर्तमान नैदानिक पाइपलाइन में योगदान (चित्रा 6), न केवल क्षेत्र में पौधों की बीमारियों के बारे में महामारी विज्ञान के सवालों के त्वरित और सटीक जवाब प्रदान करने के द्वारा, लेकिन यह भी प्रदान करके जीव विज्ञान और संयंत्र रोगजनकों के जानपदिक रोग विज्ञान की वृद्धि हुई समझ ।
The authors have nothing to disclose.
हम उत्तर डकोटा राज्य विश्वविद्यालय में डॉ नील सी Gudmestad के लिए आभारी है एस subterranea प्लाज्मिड डीएनए प्रदान करने के लिए, वाशिंगटन राज्य विश्वविद्यालय (Pappu) में डॉ हनु WSU सॐवा आरएनए प्रदान करने के लिए, और डेबरा में डॉ इङलिस WSU आर सोलानी AG3 प्रदान करने के लिए । वीडियोग्राफी के लिए पांडुलिपि और WSU CAHNRS संचार पर टिप्पणी प्रदान करने के लिए WSU में डॉ जेरेमी ज्वैलर्स को विशेष धन्यवाद । इस शोध को पश्चिमोत्तर आलू अनुसंधान कंसोर्टियम और वाशिंगटन राज्य कृषि विभाग द्वारा समर्थित किया गया था-विशेषता फसल ब्लॉक अनुदान कार्यक्रम (अनुदान सं. K1764) । PPNS no. ०७४१, प्लांट पैथोलॉजी विभाग, कृषि महाविद्यालय, मानव एवं प्राकृतिक संसाधन विज्ञान, कृषि अनुसंधान केंद्र, हैच परियोजना नं. WNP00833, वाशिंगटन राज्य विश्वविद्यालय, पुलमैन, WA, संयुक्त राज्य अमरीका ।
White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
Masterclear cap strips & real‑time PCR tube strips | Eppendorf | 9510222109 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |