Snabb och noggrann identifiering av anläggningen patogener på plats, särskilt jordburna patogener, är avgörande för att förhindra ytterligare inokulum tillverkningen och spridningen av växtsjukdomar i fältet. Den metod som utvecklats här med en bärbar realtidssystem för PCR-detektion möjliggör Hotellets diagnos under fältförhållanden.
Egen diagnos av växtsjukdomar kan vara ett användbart verktyg för odlare för beslut i rätt tid gör det möjligt för tidigare genomförandet av strategier för hantering av sjukdomen att minskar konsekvenserna av sjukdomen. Närvarande i många diagnostiska laboratorier, polymeras-kedjereaktion (PCR), särskilt realtids-PCR, anses vara den mest känsliga och noggrann metod för upptäckt av växt patogen. Laboratoriebaserade primärvården kräver dock vanligtvis dyra laboratorieutrustning och kompetent personal. I denna studie används jordburna patogener av potatis kan påvisa att för hotellets molekylär identifiering. Detta uppnås med hjälp av en snabb och enkel protokoll bestående av magnetiska pärla-baserade nukleinsyra utvinning, bärbara realtids-PCR (fluorogenic probe-baserade assay). Den bärbara realtidsdata PCR metoden jämfört gynnsamt med en laboratoriebaserade system, upptäcker så få som 100 kopior av DNA från Spongospora subterranea. Den bärbara realtidsdata PCR-metod som utvecklats här kan fungera som ett alternativ till laboratoriet tillvägagångssätt och ett användbart Hotellets verktyg för patogen diagnos.
Korrekt och snabb identifiering av orsakande patogener avsevärt påverkar beslut om sjukdomen fabriksledningen. Jordburna sjukdomar är särskilt svåra att diagnostisera eftersom marken miljön är extremt stora i förhållande till växt massa och komplex, vilket gör det en utmaning att förstå alla aspekter av jordburna sjukdomar. Dessutom jordburna sjukdomar kan vara symtomfria under tidig infektion stadier, beroende av miljöfaktorer, och vissa har lång latent perioder som resultera i försenade diagnoser1. Många jordburna patogener har utvecklat överlevnadsstrukturer, som specialiserade sporer eller melanized hyfer, som kan överleva i jorden under många år även i avsaknad av sina värdar. Utnyttjade strategier för hantering av jordburna sjukdomar inkluderar: undvika kända angripet fält, med hjälp av patogenfria certifierat utsäde och plantor, att hålla utrustning sanitära och begränsa förflyttning av jord och vatten när det är möjligt. Kunskap om patogen närvaro genom molekylär identifiering strategier kan också spela en värdefull roll genom att meddela beslut i rätt tid när det gäller nystartade behandlingar eller pre plantera bedömningar av fälten. På plats tester ger ytterligare fördelar som ger ett snabbt resultat utan att skicka provet till ett laboratorium för veterinärdiagnostik att kanske en bit bort och också kan engagera odlaren om sådan en diagnostik är utfört ‘fält-side’ i deras närvaro.
För hotellets diagnos baserat på molekylära identifiering, känslighet, specificitet, robusthet (repeterbarhet och reproducerbarhet) och effektivitet (dvs., enkelhet och kostnadseffektivitet prestanda) är avgörande faktorer för övervägande. Laterala flöde enheter (LFDs) som Immunostrip och PocketDiagnostic, populära metoder för upptäckt av hotellets patogen på grund av sin enkelhet som en one-step-analysen. LFDs kan dock inte just diagnostikverktyget i alla situationer eftersom de saknar känslighet och specificitet, och ibland ger tvetydiga resultat om målet patogenen är i låga koncentrationer och kan korsreagerar med liknande arter och släkten 2. Loop-medierad isotermiska amplifiering (lampa) gäller också för upptäckt av hotellets patogen och är särskilt billigt på grund av låg kostnad reagenser, reaktion villkor förblir konstanta och enkel kolorimetriska visuell analys. Dock både LFDs och lampa används vanligen kvalitativt, även om båda metoderna kan användas kvantitativt med dyrare utrustning3. Polymeras-kedjereaktion (PCR) erbjuder hög specificitet, hög känslighet och en kvantitativ kapacitet jämfört med de tidigare nämnda metoderna för upptäckt. Den konventionella lab-baserad PCR-tekniken kräver dock dyra laboratorieutrustning och kompetent personal, vilket är en stor nackdel att anta denna teknik som en detektionsmetod för hotellets ändamål.
I detta protokoll demonstreras en egen diagnostisk metod som använder en bärbar realtids PCR-instrumentet. Realtids PCR-teknik erbjuder fördelar jämfört med andra metoder när det gäller kvantitativ noggrannhet, känslighet och mångsidighet och har använts för detektion av ett brett spektrum av växten patogener4,5, inklusive olika potatis patogener i mark6. På grund av de senaste trenderna snabbt växande, konkurrenskraftig marknad, har utrustning som krävs för PCR-teknik fortsatt att utvecklas för att vara mer kompakt och billigare7. Protokollet består av följande steg: magnetiska pärla-baserade nukleinsyra utvinning, bärbara realtids-PCR (fluorogenic probe-baserad analys) och analys av kvantitativa data som kan göras alla distans med en bärbar dator (figur 1).
Med hjälp av bärbara PCR-protokollet framkallat här, jordprover analyserades för att upptäcka jordburna patogener, Spongospora subterranea. Spongospora valdes eftersom det är en viktig potatis patogen som kausala agenten av pudrig skorv8. Under de senaste decennierna anses förekomsten av denna sjukdom ha spridits till många regioner där potatis odlas9,10. Pudrig skorv, genom närvaron av finne som lesioner på knölarna kan orsaka betydande kvalitativa skördeförluster potatisodlare. Dessutom kan S. subterranea vektor potatis Mop toppen Virus (PMTV), vilket kan orsaka inre lesion symtom i knölar (känd som spraing)11,12. Därför är det viktigt att veta om S. subterranea är närvarande i fält före plantering6. Vi visar också nyttan av detta protokoll för detektion av Rhizoctonia solani anastomos grupp 3 (AG3) och PMTV. Även om flera anastomos grupper av Rhizoctonia solani orsakar sjukdomar i potatis, AG3 är utan tvekan den viktigaste i hela världsvida13, orsakar stem kräfta och svart skorv resulterar i marknadsmässig avkastning förluster på upp till 30%14. PMTV orsakar nekrotiska lesioner inom knölarna, som vanligen kallas spraing. Detta virus har nyligen rapporterats för första gången i flera stater i Pacific Northwest15,16,17, och ökande berör odlare i denna viktiga potatis växande region. Förutom att bestämma effektiviteten av bärbara PCR för dessa viktiga sjukdomar, optimal DNA extraktion metodik och jord provstorlek undersöktes också i denna studie.
Resultaten tyder på att den bärbara PCR metoden är mångsidig och tillämpliga för olika patogener. Hotellets detektionsmetod som vi utvecklat kan tillåta frontline arbetarna inom jordbruket (t.ex. odlare) för att göra tidigare beslut angående hantering av sjukdomar, såsom olika val eller rotationer, och kan kvantifiera en växt patogen i provet under en fältundersökning, före plantering, för att undvika potentiella sjukdomsutbrott.
I tabell 1visas senaste teknologiska framstegen inom molekylär identifiering av patogena agens har ökat effekt, noggrannhet och hastighet av diagnos, vilket har bidragit till upptäckten av pre-symtomatiska infektioner27. Angående Hotellets diagnos, lampa och lateralt flöde metoder används ofta eftersom de är portabla och ger omedelbara resultat till en lägre kostnad. Men när det gäller serologiska metoder, kan artspecifika upptäckt vara svårt att uppnå. Detta orsakar ibland misdetection av off-target mikrober som gemensam mark invånare. Det kan exempelvis vara arg reactivity mellan serologiska tester av Phytophthora spp. och Pythium spp. När det gäller potatis patogener28, som anger att det finns ibland svårigheter att upptäcka riktade anläggningen patogener.
I den aktuella studien, har vi utvecklat ett optimerat protokoll för hotellets molekylär identifiering av jordburna potatis patogener använder bärbara realtids PCR systemet genom att jämföra dess kapacitet med en konventionell lab-baserad realtids PCR system. Vi hittade att metoden på plats särskilt upptäcker potatis patogener i jordprov, även om känsligheten är ~ 10 gånger lägre än för en motsvarande lab-baserad analys. Det är också värt att överväga att i detta fall både laboratorium och fält test inte använde en biologiskt relevanta provstorlek. Stort urvalsstorlekar krävs för användning i rutinmässigt screening fältet jordar som tidigare beskrivits29,30, där urvalsstorlekar av mellan 250 g till 1 kg behandlas, även om dessa metoder kräver skickliga operatörer och sofistikerade utrustning för att extrahera DNA. Vanligtvis tas en storskalig jord DNA extrahera från en enda samlade jord för representativt prov många delprover över 1 till 4 hektar6,29,30. Men de protokoll som utvecklats här är snabb, lätt att använda för användare med ingen tidigare erfarenhet av molekylär diagnostik och kan användas utanför ett labb. Eftersom metoden är snabb och relativt billigt jämfört med storskaliga jordextraktion, kunde det användas till skärmen många småskaliga prover från en liknande provtagningsområdet att storskaliga samlingsprover. Detta kunde övervinna några av bristerna i en liten provstorlek och fastställa ytterligare information om den rumsliga fördelningen av patogenet i fältet. Dessutom den portabilitet och hastighet av metoden innebär att den också kan användas i demonstrationsverksamhet till odlare för utbildning och engagemang ändamål.
En annan faktor är att många realtids PCR-analyser är redan publicerad för ett brett utbud av växt patogener5. Detta system kan göra använda av dessa befintliga analyser utan behovet av för att utforma nya lampa primers aktivera i fältprovning. En ofta förekommande kritik av lampa analyser är att de kan vara svåra att utforma31. Bärbar PCR, tillåter därför relativt lätt genomförandet av ett brett utbud av lättillgängliga patogen tester för på plats tester.
Traditionella metoder kan vara ofta kostsamma, mödosam, felaktig och tidskrävande. Enkelheten i den Hotellets metod vi utvecklat gör det möjligt för odlare och anställda att utföra upptäckt av patogen själva och kanske generera ett resultat mycket snabbare än att skicka till ett laboratorium för veterinärdiagnostik som skulle kunna vara en bit bort. Den snabbhet och känslighet för bärbara PCR-metoden kan hjälpa odlare undvika sekundära infektioner, som ytterligare kan öka patogen befolkningen och oavsiktlig spridning (via utrustning eller människor). Sammanfattningsvis, möjliggör den Hotellets metod som utvecklats i den aktuella studien korrekt och relativt känslig detektion av viktiga jordburna patogener i fältet. Vår förhoppning är att den på plats metod som utvecklats i denna studie kommer att bidra i en nuvarande diagnostiska pipeline (figur 6), inte bara genom att ge snabba och korrekta svar på epidemiologiska frågor om växtsjukdomar i fältet, men också genom att tillhandahålla ökad förståelse av biologi och växt patogenernas epidemiologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Dr. Neil C. Gudmestad vid North Dakota State University för att tillhandahålla S. subterranea plasmid DNA, Dr Hanu Pappu på Washington State University (WSU) för att tillhandahålla PMTV RNA och Dr Debra Inglis vid WSU för att tillhandahålla R. solani AG3. Speciellt tack till Dr Jeremy Jewell på WSU för att lämna synpunkter på manuskriptet och WSU CAHNRS kommunikation för videography. Denna forskning stöddes av konsortiet Northwest potatis forskning och Washington State Department of Agriculture – specialitet gröda Block Grant Program (bevilja nr. K1764). PPNS nr 0741, Institutionen för växt patologi, College of Agriculture, mänskliga och naturliga resurs vetenskaper, jordbruks Research Center, Hatch projekt nr. WNP00833, Washington State University, Pullman, WA, USA.
White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
Masterclear cap strips & real‑time PCR tube strips | Eppendorf | 9510222109 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |