Summary
Hurtig og præcis registrering af plante patogener på stedet, især jord-bårne patogener, er afgørende for at forhindre yderligere inokulum produktion og spredning af plantesygdomme i feltet. Metoden er udviklet, her ved hjælp af en bærbar real-time PCR detection system giver mulighed for onsite diagnose under markforhold.
Abstract
On-site diagnose af plantesygdomme kan være et nyttigt redskab for avlere for rettidige beslutninger gør det muligt for den tidligere gennemførelse af strategier til håndtering af sygdom, at reducerer virkningerne af sygdommen. I øjeblikket i mange diagnostiske laboratorier, polymerase-kædereaktion (PCR), især real-time PCR, betragtes som den mest følsomme og præcis metode til plante patogen detektion. Laboratorium-baseret PCR'er kræver dog typisk dyre laboratorieudstyr og faglært personale. I denne undersøgelse, er jord-bårne patogener af kartoffel bruges til at demonstrere potentialet for on-site molekylær detektion. Dette blev opnået ved hjælp af en hurtig og enkel protokol bestående af magnetiske perle-baserede nukleinsyre udvinding, bærbare real-time PCR (fluorogenic sonde-baseret analyse). Den bærbare real-time PCR metode sammenlignet positivt med et laboratorium-baseret system, afsløre så lidt som 100 kopier af DNA fra Spongospora subterranea. Den bærbare real-time PCR metode udviklet her kan tjene som et alternativ til laboratorie-baserede tilgange og en nyttig on-site værktøj for patogenet diagnose.
Introduction
Præcis og hurtig identifikation af sygdomsfremkaldende patogener væsentligt påvirker beslutninger vedrørende plante sygdom management. Jord-bårne sygdomme er særligt vanskelige at diagnosticere fordi jord miljø er ekstremt store i forhold til anlæg, massive og komplekse, hvilket gør det en udfordring at forstå alle aspekter af jord-bårne sygdomme. Derudover jord-bårne sygdomme kan være symptomfri i tidlig infektion faser, afhængig af miljømæssige stressfaktorer, og nogle har lange latente perioder, der resulterer i forsinkede diagnoser1. Mange jord-bårne patogener har udviklet overlevelse strukturer, såsom specialiserede sporer eller melanized hyfer, som kan overleve i jorden i mange år selv i mangel af deres værter. Udnyttede tilgange til forvaltning af jord-bårne sygdomme omfatter: undgå kendte angrebne områder, ved hjælp af patogenfrie certificeret frø og planteforædlingsmateriale, holde udstyr sanitære og begrænser bevægeligheden af jord og vand når det er muligt. Viden om patogen tilstedeværelse gennem molekylær detektion strategier kan også spille en nyttig rolle ved at informere rettidige beslutninger vedrørende tidlige behandlinger eller pre plante vurderinger af felterne. On-site test giver yderligere fordele ved at give et hurtigt resultat uden at sende prøven til et laboratorium, der diagnosticerer, måske nogle afstand væk og også kan engagere producenten hvis sådan en diagnose er udført 'felt-side' i deres tilstedeværelse.
For on-site diagnose baseret på molekylær detektion, følsomhed, specificitet, robusthed (repeterbarhed og reproducerbarhed) og effektivitet (dvs., enkelhed og omkostninger ydeevne) er afgørende faktorer i betragtning. Lateral flow enheder (LFDs) som Immunostrip og PocketDiagnostic, er populære metoder til on-site patogen detektion på grund af deres enkelhed som en et-trins assay. LFDs kan dog ikke være lige diagnosticeringsværktøjet i alle situationer, fordi de mangler den følsomhed og specificitet, og lejlighedsvis giver tvetydige resultater hvis målet patogen er i lave koncentrationer og kan krydsreagere med lignende arter eller slægter 2. Loop-medieret isotermisk forstærkning (lampe) er også gældende for ejendommen patogen detektion og er særdeles billig lavpris-reagenser, reaktionsbetingelser, der forbliver konstante og enkel kolorimetriske visuel analyse. Men både LFDs og lampe bruges typisk kvalitativt, selvom begge metoder kan bruges kvantitativt med dyrere udstyr3. Polymerasekædereaktionen (PCR) tilbyder høj specificitet, høj følsomhed, og en kvantitativ kapacitet i forhold til de ovennævnte metoder til påvisning. Men konventionelle lab-baserede PCR teknologien kræver dyre laboratorieudstyr og kvalificeret personale, som er en stor ulempe ved at vedtage denne teknologi som en påvisningsmetode for stedets formål.
I denne protokol, er en on-site diagnostisk metode ved hjælp af en transportabel real-time PCR instrument påvist. Real-time PCR teknologien tilbyder fordele frem for andre metoder hvad angår kvantitative nøjagtighed, følsomhed og alsidighed, og har været meget anvendt til påvisning af en bred vifte af plante patogener4,5, herunder forskellige kartoffel patogener i jord6. På grund af de seneste tendenser i den hurtigt voksende og konkurrencedygtigt marked fortsat udstyr, der kræves for PCR teknologien udvikle sig til at blive mere kompakte og mindre dyre7. Protokollen er sammensat af følgende trin: magnetisk bead-baserede nukleinsyre udvinding, bærbare real-time PCR (fluorogenic sonde-baseret analyse) og analyse af kvantitative data, der kan gøres alle fjernt benytter en bærbar computer (figur 1).
Ved hjælp af den bærbare PCR-protokol udviklet her, jordprøver blev analyseret for at opdage den jord-bårne patogener, Spongospora subterranea. Spongospora blev valgt, da det er en vigtig kartoffel patogen som den kausale agens af pulverformige skurv8. I de seneste årtier, er tilstedeværelsen af denne sygdom anses for at have spredt sig til mange regioner hvor kartoflerne dyrkes9,10. Pulverformige skurv, gennem tilstedeværelsen af bums som læsioner på knoldene kan forårsage betydelige kvalitative udbyttetab for kartoffelavlere. Derudover kan S. subterranea vektor kartoffel Mop Top Virus (PMTV), som kan forårsage indre læsion symptomer i knolde (kendt som treklør)11,12. Derfor er det vigtigt at vide hvis S. subterranea er til stede i felter før plantning6. Vi også påvise nytten af denne protokol til påvisning af Rhizoctonia solani anastomose gruppe 3 (AG3) og PMTV. Selvom flere anastomose grupper af Rhizoctonia solani forårsage sygdomme i kartofler, AG3 er velsagtens den mest vigtige verdensomspændende13, forårsager stammen fordærve og sort skællende resulterer i markedsmæssige udbyttetab på op til 30%14. PMTV forårsager nekrotiske læsioner inden for knolde, der almindeligvis kaldes treklør. Denne virus er for nylig blevet rapporteret for første gang i flere stater i Pacific Northwest15,16,17, og er af stigende bekymring for avlerne i denne vigtige kartoffel voksende region. Ud over bestemmelse af effektiviteten af bærbare PCR for disse vigtige sygdomme, optimale DNA udvinding metoder og jord prøvestørrelse blev også undersøgt i denne undersøgelse.
Resultaterne tyder på, at den bærbare PCR metode er alsidig og anvendes til påvisning af forskellige patogener. On-site detektion metode vi udviklede kan tillade de frontline arbejdstagere i landbruget (fx avlere) at tage tidligere beslutninger vedrørende forvaltning af sygdom, såsom forskellige markeringer eller rotationer, og kan kvantificere en plante patogen i stikprøven under et felt undersøgelse, før plantning, for at undgå potentielle sygdomsudbrud.
Protocol
1. stedets molekylære påvisning af patogener ved hjælp af en bærbar Real-Time PCR System
Bemærk: Se figur 1.
- Magnetisk bead-baseret DNA-ekstraktion
Bemærk: En magnetisk bead-baseret DNA udvinding kit (f.eks. fra Primerdesign) blev brugt efter fabrikantens anvisninger. Alle reagenser skal opbevares ved stuetemperatur (18-25 ° C). Når den frysetørrede Proteinase K (flaske No.1) afbrydes (ved hjælp af flaske No.1a), opbevares ved-20 ° C.- Bland 20-50 mg af jordprøve med 500 µL af prøveopløsningen Prep i en microtube.
Bemærk: Forholdet mellem jord: Prep løsning er vigtig som blande dem i andre nøgletal kan forårsage en fejl i downstream eksperimenter (fx forurening af hæmmere af PCR). - Grind jord på bunden af røret ved hjælp af en lille sterile pistil, indtil løsningen er overskyet. Yderligere suspendere jordpartikler i løsning ved at ryste microtube og lad det stå, uforstyrret, at lade jorden partikler bosætte sig helt (typisk mellem 5-10 min).
- Overføre 200 µL af supernatanten til en frisk microtube og tilføje 200 µL af lysisbuffer (flaske nummer 2: guanidin hydrochlorid løsning) og 20 µL af Proteinase K (flaske No.1).
- Bland den lysate grundigt ved at vende røret og inkuberes ved omgivende temperatur i 15 min.
Bemærk: Hvis de lysate er fundet på microtube låg, tryk røret eller bruge en centrifuge, hvis det er muligt at fjerne fra låget. - Tilføje 500 µL af binding buffer/magnetisk bead mix (flaske No.3) at den lysed prøve. Bland godt af pipettering op og ned og der inkuberes ved omgivende temperatur i 5 min væk fra magnetiske rør rack.
Bemærk: Sørg for at blande perle løsning godt før brugen for at sikre, at perlerne er aliquoted jævnt fra opbevaring flaske. - Sted microtube på magnetiske rør rack. Vent i mindst 2 min. eller indtil alle perler i microtube tillægger den magnetiske sidevæg. Derefter fjerne og kassere alle supernatanten af pipettering.
Bemærk: Forstyr ikke magnetiseret perlerne samtidig at fjerne og sugning supernatanten. DNA er nu blevet fanget af de magnetiske perler. - Fjerne microtube fra magnetiske rør rack, tilsættes 500 µL af Wash Buffer-1 (flaske nummer 4: natrium perchlorat/ethanol løsning) og genopslæmmes perlerne af gentagne pipettering indtil perlerne er ensartet spredt. Udføre denne vask trin for at fjerne protein og salt fra prøven. Lad blandingen sidde i 30 s.
- Gentag trin 1.1.6.
- Fjerne microtube fra magnetiske rør rack, tilsættes 500 µL af Wash Buffer-2 (flaske nr. 5: natrium perchlorat/ethanol løsning) og genopslæmmes perlerne af gentagne pipettering indtil perlerne er ensartet spredt. Lad blandingen sidde i 30 s.
- Gentag trin 1.1.6.
- Fjerne microtube fra magnetiske rør rack og derefter tilsættes 500 µL 80% ethanol (flaske nr.6).
Bemærk: Dette trin er nødvendigt til fjernelse af resterende salte fra prøven.- Genopslæmmes perlerne af gentagne pipettering indtil perlerne er ensartet spredt. Lad dette stå i 10 min med lejlighedsvise blanding af inversion.
- Gentag trin 1.1.6.
- Luft tørre magnetisk bead toerstoffet i 10 min. ved stuetemperatur med microtube låg åbent.
Bemærk: Perlerne bør være fri for enhver synlig resterende ethanol men ikke helt tørret ud. - Fjerne microtube fra magnetiske rør rack, tilføje 50-200 µL af eluering Buffer (flaske nr.7) og genopslæmmes perlerne af gentagne pipettering indtil perlerne er ensartet spredt og lad det stå for 30 s.
Bemærk: I de ovenstående trin, er oprenset DNA frigivet fra de magnetiske perler til eluering buffer. - Sted microtube på magnetiske rør rack. Vent i mindst 2 min. eller indtil alle perler i microtube tillægger den magnetiske sidevæg.
- Overføre supernatanten, der nu indeholder den oprenset DNA/RNA til en 0,5 mL microtube til brug i de efterfølgende trin.
- Bland 20-50 mg af jordprøve med 500 µL af prøveopløsningen Prep i en microtube.
- Bærbare real-time PCR
Bemærk: En bærbar thermocycler og PCR assay kit blev brugt ifølge producentens anvisninger (Se Tabel af materialer).- Åbne og køre den thermocycler-associerede software, Vælg Target detection test og input alle beskrivelse information i indtastningsfelter navn & detaljer, noter, prøver og test data.
Bemærk: Brønde #1 og #2 er udpeget af softwaren til den negative kontrol og positiv kontrol, hhv. - Forberede PCR reagenser før brug. Overføre 500 µL af master mix resuspension buffer i rør indeholdende frysetørrede master mix og bland godt ved inversion. Overføre den hele master mix til den brune microtube mærket primere/sonde (tabel 2).
- Cap og ryste microtube at blande. Grundig blanding er forpligtet til at sikre, at alle komponenter re suspenderes fuldstændig. Lad blandingen sidde i 5 min. før brug.
Bemærk: Gemme mastermix ved-20 ° C efter brug.
- Cap og ryste microtube at blande. Grundig blanding er forpligtet til at sikre, at alle komponenter re suspenderes fuldstændig. Lad blandingen sidde i 5 min. før brug.
- Forberede en negativ kontrol ved at overføre 10 µL af den forberedte mastermix fra forrige trin til en 0,2 mL PCR rør og derefter tilføje 10 µL sterilt nukleasen-fri deioniseret vand.
- Forberede en positiv kontrol ved at overføre 10 µL af den forberedte mastermix fra trin 1.2.2 ind i en 0,2 mL PCR rør og derefter tilføje 10 µL af positiv kontrol skabelon.
- For hver prøve, overføre 10 µL af den forberedte mastermix fra forrige trin til en 0,2 mL PCR rør, og derefter tilføje 10 µL af prøven DNA forberedt fra trin 1.1.16.
- Indlæse wells af thermocycler med indhold fra deres respektive PCR rør, som beskrevet i trin 2.1.1.
- Når alle de nødvendige oplysninger er indtastet og bekræftet, Vælg Start Kør og vælge enten den ethernet-tilsluttede instrument eller et USB-drev.
Bemærk: Hvis USB-drevet indstilling er valgt, skal den køre filen gemmes på drev skal anvendes med thermocycler (f.eks.F:\genesig). Kør indledes umiddelbart efter drevet er indsat i thermocycler.
- Åbne og køre den thermocycler-associerede software, Vælg Target detection test og input alle beskrivelse information i indtastningsfelter navn & detaljer, noter, prøver og test data.
- Dataanalyse af bærbare real-time PCR.
- Når kørslen er færdig, åbne Kør filen (.usb) fra USB-drev ved hjælp af thermocycler-associerede software eller direkte se de køre resultater i softwaren ved at klikke på resultater.
- Inden analyse af resultater, gemme den færdige Kør for at undgå at miste data.
- I fanen resultater se status for flugt, kategoriseret efter prøver.
Bemærk: Data, der kan opnås under denne fane er status for resultater og kopierer antallet fundet i prøven. - Klik på fanen detaljer for at se forstærkning kurver. Når målet registreres korrekt, vises Cq (kvantificering cyklus) værdier for både destinations- og intern kontrol.
Bemærk: Disse værdier beregnes i den endelige rapport og bruges til at afgøre, om en prøve er positive for målet og hvis der er problemer med reaktionen eller DNA-prøver.
2. andre protokoller
-
Alternative lab-baseret DNA udvindingsmetoder
-
CTAB-phenol-chloroform baseret metoder
- Udføre CTAB-phenol-chloroform baseret metoder, efter Doyle metode18 og Dellaporta metode19 som tidligere beskrevet.
-
DNA mini forberedelse metode
Bemærk: Edwards metode20 blev udført som følger.- Tilføje 500 mg af jord, efterfulgt af fem 1,4 mm keramik perler og 750 µL af Edwards buffer (200 mM Tris, pH 8,0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) til en microtube og bland godt.
- Inkubér microtube på 65 ° C i 5 min.
- Homogeniseres prøven med en perle tæppebanker homogeniseringsapparat for 60 s (eller ved hjælp af en morter og støder).
- Der centrifugeres prøve på 14.000 x g i 5 min.
- Overføre 500 µL af supernatanten til en frisk microtube og derefter blandes med 500 µL af kølet isopropanol. Blandes ved at vende røret 10 gange.
- Der centrifugeres prøve på 14.000 x g i 15 min. til pelletize DNA.
- Den dekanteres og lad DNA pellet luft tørre ved stuetemperatur indtil de resterende ethanol er fordampet.
- Vask DNA pellet med 750 µL af kølet 70% ethanol.
- Luft tørre pellet før re suspension i 50-100 µL af TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 og 1 mM EDTA).
-
Andre Alternative metoder
- Udføre Silica-base DNA-ekstraktion ved hjælp af kit #1 (MP BIO hurtigt DNA Spin) og kit #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) ifølge producentens anvisninger.
-
CTAB-phenol-chloroform baseret metoder
-
Konventionelle lab-baseret real-time PCR.
Bemærk: En konventionel thermocycler blev brugt med mastermix til sonde-baserede PCR, forskellige primere og oligonukleotid sonder (tabel 2).- Ved hjælp af uigennemsigtige bund PCR rør eller en PCR plade, forberede 20 µL reaktioner for alle DNA-prøver der skal analyseres, såvel som en negativ kontrol (nukleasen-fri deioniseret vand) og en positiv skabelon kontrol udarbejdet internt.
- For hver PCR rør eller godt, udarbejde en blanding, herunder 10 µL af mastermix, 7 µL nukleasen-fri ionbyttet vand, 2 µL af 2 µM primere/sonde og 1 µL DNA-prøve (fra trin 1.1.16 eller 2.1) eller kontrol skabelon, pr. prøve.
- Luk PCR rør eller plade og begynde reaktionen ved at vælge det relevante PCR-program.
-
Dataanalyse af konventionelle lab-baseret real-time PCR
- Brug thermocycler-associerede software til at analysere resultaterne fra den konventionelle thermocycler. For at starte dataanalyse, overføre filen køres fra thermocycler til en USB drive, Indsæt et USB-drev og vælg Eksporter.
- Åben datafilen (.pcrd) fra den eksporterede køre i den thermocycler-associerede software.
- Fremhæve godt af en prøve ved at placere dens tilsvarende godt på instrumentet. Forstærkning kurver og standard kurver (hvis relevant) oprettes automatisk. Hvis oplysningerne om prøven ikke er angivet, skal du klikke på Plade opsætning eller en ligedannet funktion for at starte datainput før dataanalyse.
- Se data på fanen kvantificering. Dette kan eksporteres til dataanalyse med en tredjepart software som CSV, XML eller HTML fil læsere.
- Få Cq data baseret på bestemt tærsklerne og sammenligne det med de positive og negative kontroller.
Bemærk: Hvis DNA standarder af målet blev anvendt i analysen, sammenligne Cq eksempeldata til at af standarder til at bestemme Cq cut-off
Representative Results
Sammenligning af DNA udvindingsmetoder
En magnetisk bead-baseret DNA ekstraktion metode forenelighed med real-time PCR blev evalueret ved at afsløre beløbene af S. subterranea DNA i en jordprøve fra felter befængt med patogenet. Som vist i supplerende figur 1, blev den magnetiske perle-baserede metode sammenlignet med de andre metoder, herunder en CTAB-phenol-chloroform baseret metode18, hurtig DNA mini forberedelse metoder19,20, og andre standard silica-baseret DNA udvinding kits. DNA-prøver udvundet ved hjælp af de seks forskellige metoder blev udsat for konventionel lab-baseret real-time PCR. Resultaterne antydede, at den magnetiske perle-baserede metode er sammenlignelige med de andre metoder, selv om silica-baseret DNA-ekstraktion kit viste de bedste resultater blandt de metoder, vi testede. Alle kits indeholder guanidinium kaliumthiocyanat eller guanidinium hydrochlorid: begge er kraftfulde chaotropic agenter, som denaturerer de fleste af cellulære proteiner, herunder RNases og DNases. Derfor, ved hjælp af metoderne, der er egnet til både DNA og RNA ekstraktioner.
Sammenligning mellem en bærbar real-time PCR og en konventionel lab-baseret real-time PCR
At sammenligne følsomhed og specificitet af en transportabel PCR til en konventionel lab-baserede PCR, absolut kvantificering af patogenet DNA blev udført ved hjælp af forskellige mængder af S. subterranea ITS gen, som blev båret af pGEM-T vektoren21 . En serie af 10-fold fortyndinger af ITS-genet (106 til 100 eksemplarer) blev analyseret ved hjælp af SsTQ primere/sonden sæt22. Resultaterne viste, at metoden bærbare PCR opdaget target patogen DNA (~ 100 eksemplarer), selv om følsomheden var 10 gange lavere end at af den konventionelle lab-baserede PCR metode, som registreres mindst 10 eksemplarer (figur 2).
For yderligere validering, blev kunstigt befængt jorden testet. S. subterranea sporosori blev fremstillet af pulverformige skurv root galls fra kartoffel rødder. Jord var befængt med sporosori suspensioner i en endelig koncentration på 105 sporosori/g tør vægt af jord. Ved hjælp af metoden magnetisk bead-baseret DNA blev udvundet fra de angrebne jordprøver og 10-fold serielle fortyndinger var rede til at opnå koncentrationer svarende til 105, 104, 103, 102, 101og 100 sporosori/g tørvægt af jord. DNA-prøver blev brugt til PCR ved hjælp af SPO primer/sonden sæt23. Resultaterne viste, at den bærbare PCR metode har sammenlignelige analytiske kapacitet til en konventionel lab-baserede PCR metode, men igen, følsomheden blev reduceret med en faktor på ~ 10 (figur 3).
Endelig, vi har testet en jordprøve fra et felt, der var naturligt forurenet med S. subterranea. Den magnetiske perle-baseret DNA-ekstraktion blev udført på forskellige mængder af jord (10, 20, 50 og 100 mg af jord pr. 500 µL af ekstraktionsmiddel buffer). Resultaterne foreslog, at den optimale vægt af jord som en råvare til DNA-ekstraktion var 50-100 mg (figur 4). Jord beløb uden for intervallet forårsaget en fejl i de downstream PCR trin. Denne virkning kan være fordi når overskydende mængder af jord bruges som udgangspunkt materiale, forureninger (fx, phenolforbindelser) kan forstyrre PCR24. Ved lavere mængder af jord, kan mængden af ekstraherede DNA være lavere end detektionsgrænsen for PCR (fx, afkast af samlede DNA ekstraheret fra 10-20 mg jord blev varieret). Følsomhed var ganske sammenlignelig mellem bærbare PCR og konventionelle PCR metoder. Lignende resultater blev opnået i DNA-prøver af forskellige udvindingsmetoder (supplerende figur 2)
Påvisning af andre patogener af on-site detektion systemet bruger en bærbar real-time PCR
Vi testet bærbare PCR metoden for at opdage andre vigtige jord-bårne kartoffel patogener, R. solani AG3 og PMTV. I denne undersøgelse udført vi real-time PCR ved hjælp af RsTq primere/RQP1 sonde sæt25 til R. solani AG3 påvisning med DNA fra ren kultur. Vi har også udført real-time PCR ved hjælp af de PMTV-D primer/sonden sæt26 til PMTV påvisning med RNA fra en treklør symptomatisk knold prøve blev brugt. Som vist i figur 5, opdaget den bærbare PCR metode med held både patogener. Resultaterne var sammenlignelig mellem de bærbare og konventionelle instrumenter, antyder, at den bærbare PCR metode er alsidig og som gælder for andre patogen opdagelser hvis primer sekvenser designet til real-time PCR er tilgængelige.
Figur 1. Proceduren for en bærbar real-time PCR system til on-site patogen detektion. Protokollen er sammensat af trinnene i følgende rækkefølge: lysate forberedelse af korte homogenisering (A), magnetisk bead-baserede nukleinsyre udvinding (B), bærbare real-time PCR (C) og kvantitative dataanalyse ved hjælp af en bærbar computer (D). Bemærk at alle trin kan udføres på stedet.
Figur 2 . Sammenligning af følsomhed mellem en bærbar PCR og en konventionel lab-baserede PCR. Kvantificering af patogenet DNA blev udført ved hjælp af forskellige mængder af S. subterranea ITS gen (106 100 kopier) med SsTQ primere/sonden. Lineær regression mellem log af S. subterranea plasmid DNA og gensidige Log værdi af Cq på de konventionelle thermocycler (A) og den bærbare thermocycler (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Sammenligning af detektionsegenskaberne i kunstigt angrebne jordbund med S. subterranea. Jord var kunstigt befængt (105 til 100 sporosori/g tørvægt af jord) med S. subterranea sporosori suspensioner. Ved hjælp af metoden magnetisk bead-baseret blev DNA udvundet fra de angrebne jordprøver. PCR'er blev udført ved hjælp af jordprøver med SPO primer/sonden sæt. Lineær regression mellem log af start mængde i sporosori per gram af jord og den gensidige log værdi af Cq på de konventionelle thermocycler (A) og den bærbare thermocycler (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Sammenligning af start beløbet af jordprøver til DNA-ekstraktion. Den magnetiske perle-baserede metode blev brugt til DNA-ekstraktion fra 10, 20, 50 og 100 mg af jordprøver. Real-time PCR'er blev udført ved brug af den bærbare thermocycler. Standard kurver repræsenterer forholdet mellem mængden af samlede DNA ekstraheret fra jordprøver (x-aksen) og mængder af PCR produkt (y-aksen) forstærkes af Sss primer/sonden sæt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Påvisning af andre patogener, kartoffel, R. solani og PMTV. Real-time PCR'er blev udført ved brug af den bærbare thermocycler og den konventionelle thermocycler. R. solani AG3 blev opdaget i samlede DNA ekstraheret fra ren kultur ved hjælp af RsTq primere og RQP1 sonden (A) PMTV blev opdaget i total RNA ekstraheret fra en PMTV-inficerede knold prøve benytter PMTV-D primer/sonden sæt (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . En diagnostisk pipeline for phytopathogens. Flowchart viser en generel arbejdsgang for phytopathogen diagnose. Bemærk, at den traditionelle skridt, fxvisuelle identifikation, kan udelades, hvis stedets molekylær detektion er udnyttet, hvilket gør hele processen med diagnosen enkel og hurtig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Bærbare real-time PCR | Real-time PCR | LAMPE | ELISA | Lateral-flow | |
| Omkostning pr. mål reaktion | $0,60-$8.47 | $0,60 | $0,75 | $0,60 | $4.74 |
| Følsomhed | 100 eksemplarer | 10 eksemplarer | 10 eksemplarer | 1-10 sporosori33 1-10 ng/mL (protein)33 |
1-10 sporosori34 5 x 105CFU/mL35 |
| Tid udgift | 90 minutter | 80-240 minutter | 50-90 minutter32 | 3-24 timer | 10-15 minutter |
| Forberedelse kræves | ●Nucleic syre udvinding ● Primer design |
●Nucleic syre udvinding ● Primer/sonden design |
● Nucelic syre udvinding ● Primer design |
● Protein udvinding ● Antistoffer |
NIELSEN |
| Andre nødvendige materialer | ● Bærbare thermocycler | ● Konventionelle thermocycler | ● Kolorimetrisk pletten ● Inkubator |
● Pladelæser ● Vaske udstyr |
NIELSEN |
Tabel 1. Sammenlignende diagram af molekylære og serologiske metoder til phytopathogens
| Primer | Sekvens (5 '-3 ')en | Målb | |
| SsTQ-F13 | CCGGCAGACCCAAAACC | ITS1-ITS2 i S. subterranea | |
| SsTQ-R13 | CGGGCGTCACCCTTCA | ITS1-ITS2 i S. subterranea | |
| SsTQ-P13 | [FAM] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [TAM] | ITS1-ITS2 i S. subterranea | |
| Genesig S.subterranea primer/sonde | NIELSEN | Aktin i S. subterranea | |
| SPO1014 | GGTCGGTCCATGGCTTGA | ITS i S. subterranea | |
| SPO1114 | GGCACGCCAATGGTTAGAGA | ITS i S. subterranea | |
| SPOPRO114 | [FAM] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [TAM] | ITS i S. subterranea | |
| RsTqF119 | AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT | ITS1-ITS2 i R. solani | |
| RsTqR119 | AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT | ITS1-ITS2 i R. solani | |
| RQP119 | [FAM] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [TAM] | ITS1-ITS2 i R. solani | |
| Genesig PMTV primer/sonde | NIELSEN | CP-RT i PMTV | |
| PMTV-D-F20 | AGAATTGRCATCGAAACAGCA | CP i PMTV | |
| PMTV-D-R20 | GTCGCGCTCCAATTTCGTT | CP i PMTV | |
| PMTV-D-P20 | [FAM] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [TAM] | CP i PMTV | |
| en Oligo DNA primere blev ændret med FAM (6-carboxyfluorescein) eller TAM (5-carboxytetramethylrhodamine) | |||
| b ITS: Interne transskriberede afstandsstykker, CP: pels protein; CP-RT: coat protein readthrough | |||
Tabel 2. Primere, der anvendes i denne undersøgelse
Tillægs figur 1. Sammenligning af DNA udvindingsmetoder til påvisning af pulverformige skurv patogenet. Seks forskellige DNA udvindingsmetoder (A-F) var i forhold til påvisning af pulverformige skurv patogen, S. subterranea i jordprøver. (B, D, F). DNA blev udvundet ved hjælp af silica-baserede kit #1 (se tabel materialer til alle kit navne), silica-baserede kit #2 og magnetisk bead-baserede kit, repsectively. PCR blev udført ved hjælp af de konventionelle lab-baserede PCR thermocycler. Standard kurver repræsenterer forholdet mellem mængden af samlede DNA ekstraheret fra Jordprøverne og mængder af PCR produkt forstærkes af SsTQ primere/sonden sæt. Venligst klik her for at downloade denne figur.
Tillægs figur 2. Sammenligning af påvisningsgrænsen mellem en bærbar PCR og en konventionel lab-baserede PCR. Samlede DNA blev isoleret fra en jordprøve, ved hjælp af tre forskellige udvindingsmetoder: (A, B) Doyle metode, (C, D) den silica-baserede kit #2, og (E, F) den magnetiske perle-baserede kit. Grafer vist til venstre er data ved hjælp af den bærbare thermocycler med Sss primere/sonden sæt, mens grafer til højre repræsenterer data genereret ved hjælp af de konventionelle lab-baseret thermocycler med SsTQ primere/sonden sæt. Venligst klik her for at downloade denne figur.
Discussion
Som vist i tabel 1, øget de seneste teknologiske fremskridt i den molekylære identifikation af patogene agenser effektivitet, nøjagtighed og hastighed af diagnose, som har bidraget til påvisning af pre symptomatisk infektioner27. Om egen diagnose, lampe og lateral-flow metoder anvendes ofte fordi de er bærbare og giver øjeblikkelige resultater til en lavere pris. I tilfælde af serologiske metoder, kan det være svært at opnå med artsspecifikke påvisning. Dette forårsager lejlighedsvis misdetection af off-target mikrober såsom fælles jord indbyggere. For eksempel kan der være cross reaktivitet mellem de serologiske test af Phytophthora spp. og Pythium spp. for kartoffel patogener28, der angiver, at der er undertiden vanskeligheder afsløre den målrettede plante patogener.
I den foreliggende undersøgelse, har vi udviklet en optimeret protokol for on-site molekylær detektion af jord-bårne kartoffel patogener ved hjælp af bærbare real-time PCR systemet ved at sammenligne sin kapacitet med en konventionel lab-baseret real-time PCR system. Vi fandt, at metoden på stedet specifikt registrerer kartoffel patogener i jordprøve, selvom følsomhed er ~ 10 gange lavere end i en tilsvarende lab-baseret analyse. Det er også værd at overveje, at i dette tilfælde både laboratorium og field test ikke bruge en biologisk relevant stikprøvestørrelse. Store stikprøvestørrelser er påkrævet til brug i rutinemæssigt screening felt jord som tidligere beskrevet29,30, hvor stikprøver af mellem 250 g til 1 kg behandles, selv om disse metoder kræver dygtige erhvervsdrivende og sofistikerede udstyr til at udtrække DNA. Typisk, en storstilet jord DNA uddrag er taget fra en enkelt samlet jord prøve repræsentant for talrige delprøver over 1-4 ha6,29,30. Dog protokollens udviklet her er hurtig, nem at bruge for brugere uden forudgående erfaring i molekylær diagnostik og kan bruges uden for et laboratorium. Da metoden er hurtig og relativt billigt i forhold til store jord udvinding, kunne det bruges til at screene mange små prøver taget fra en lignende prøveudtagning område til store samlede prøver. Dette kunne løse nogle af manglerne ved en lille stikprøvestørrelse og fastlægge yderligere oplysninger om den geografiske fordeling af patogenet i feltet. Derudover portabilitet og hastighed af metoden betyder, at det også kan bruges i demonstrationsaktiviteter til avlerne til pædagogiske og engagement formål.
En anden overvejelse er, at mange real-time PCR assays allerede er offentliggjort til en bred vifte af plante patogener5. Dette system kan gøre brug af disse eksisterende assays uden behov for at designe nye lampe primere til at aktivere i feltforsøg. En hyppig kritik af lampe assays er, at de kan være vanskelige at designe31. Bærbare PCR, tillader derfor relativt lette gennemførelsen af en bred vifte af let tilgængelige patogen tests for on-site test.
Traditionelle metoder kan være ofte dyre, besværlige, unøjagtige og tidskrævende. Enkelheden i den on-site metode vi udviklede tillader avlere og arbejdstagere til at udføre patogen detektion af sig selv og måske skabe et resultat meget hurtigere end at sende til et laboratorium, der diagnosticerer der kunne være et stykke væk. Hurtighed og følsomheden af de bærbare PCR-metode kan hjælpe avlere undgå potentiale sekundære infektioner, som kan yderligere øge patogen befolkning og utilsigtet spredning (via udstyr eller mennesker). Afslutningsvis giver metoden on-site udviklet i den nuværende undersøgelse nøjagtige og relativt følsomme påvisning af vigtige jord-bårne patogener i feltet. Vores håb er, at metoden på stedet udviklet i denne undersøgelse vil bidrage i en nuværende diagnostiske rørledning (figur 6), ikke kun ved at levere hurtig og præcis svar på epidemiologiske spørgsmål om plantesygdomme i feltet, men også ved at give øget forståelse af den biologi og epidemiologi af plante patogener.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Dr. Neil C. Gudmestad på North Dakota State University for at give S. subterranea plasmid DNA, Dr. Hanu Pappu på Washington State University (WSU) for at give PMTV RNA, og Dr. Debra Inglis på WSU for at levere R. solani AG3. En særlig tak til Dr. Jeremy Jewell på WSU for at give kommentarer på manuskriptet og WSU CAHNRS kommunikation for videography. Denne forskning blev støttet af nordvest kartoffel forskningskonsortium og Washington State Department of Agriculture - speciale afgrøde bloktilskud Program (give nr. K1764). PPNS nr. 0741, Institut for Plantepatologi, College of Agriculture, menneskelige og naturlige ressourcer videnskaber, landbrugs Forskningscenter, Hatch projekt nr. WNP00833, Washington State University, Pullman, WA, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
| SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
| CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
| Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
| Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
| q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
| Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
| iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
| FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
| Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
| 0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
| Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
| genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
| Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
| Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
| Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |
References
- Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. delM. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
- Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
- Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
- Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
- Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
- Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato - a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
- Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
- Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241 (2008).
- Jones, R. aC., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
- Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
- Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
- Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
- Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
- Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
- Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337 (2016).
- Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
- Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349 (1991).
- Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
- van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
- Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
- Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
- Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
- Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
- Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
- Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
- Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
- Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
- Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
- Narayanasamy, P. Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , John Wiley & Sons. (2016).
- Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).
