Rask og nøyaktig påvisning av anlegget patogener på stedet, særlig jord-borne patogener, er avgjørende for å hindre ytterligere inoculum produksjon og spredning av plantesykdommer i feltet. Metoden utviklet her bruker et bærbart sanntid PCR deteksjon system gjør på stedet diagnose under feltforhold.
Stedets diagnostisering av anlegget sykdommer kan være et nyttig verktøy for bøndene for rettidige beslutninger aktivere tidligere gjennomføring av strategier for behandling av sykdom som reduserer virkningen av sykdommen. Øyeblikket i mange laboratorier, polymerasekjedereaksjons (PCR), spesielt sanntid PCR, regnes den mest følsomme og nøyaktige metoden for plante patogen gjenkjenning. Men krever laboratorie-baserte PCRene vanligvis dyre laboratorieutstyr og dyktige personell. I denne studien brukes jord-borne patogener potet å demonstrere potensialet for på stedet molekylær gjenkjenning. Dette var oppnådd, med en rask og enkel protokoll består av magnetiske perle-baserte nukleinsyre utvinning, bærbare sanntid PCR (fluorogenic probe-baserte analysen). Bærbar sanntid PCR tilnærming sammenlignet gunstig med et laboratorium-basert system, oppdager løpet av 100 eksemplarer av DNA fra Spongospora subterranea. Bærbar sanntid PCR metoden utviklet her kan tjene som et alternativ til laboratorium metoder og et nyttig på stedet verktøy for patogen diagnose.
Nøyaktig og rask identifikasjon forårsaker patogener betydelig påvirker beslutninger om plante sykdom ledelse. Jord-borne sykdommer er spesielt vanskelig å diagnostisere fordi jord miljøet er ekstremt store i forhold til plante masse og komplekse, noe som gjør det til en utfordring å forstå alle aspekter av jord-borne sykdommer. Videre jord-borne sykdommer kan være symptomless under tidlig infeksjon stadier, avhengig av miljømessige stressorer, og noen har latent lengre som forsinket diagnoser1. Mange jord-borne patogener har utviklet overlevelse strukturer, for eksempel spesialiserte sporer eller melanized hyfer, som kan overleve i jord i mange år selv i fravær av deres verter. Benyttet tilnærminger for jord-borne sykdom ledelse inkluderer: unngå kjent infested felt ved patogen-fri sertifisert frø og planter, holde utstyr sanitære og begrenser bevegelsen av jord og vann når det er mulig. Kunnskap om patogen tilstedeværelse gjennom molekylær oppdagelsen strategier kan også spille en nyttig rolle ved å informere rettidige beslutninger om tidlig stadium behandlinger eller pre plante vurderinger av feltene. Stedets testing gir flere fordeler ved å gi en rask resultat uten å sende utvalget til en diagnostisk laboratorium at kanskje et stykke unna og også kan engasjere dyrkeren hvis slik en diagnose utført “feltet-siden” i deres nærvær.
For på stedet diagnose basert på molekylære gjenkjenning, følsomhet, spesifisitet, robusthet (repeterbarhet og reproduserbarhet) og effektivitet (dvs., enkelhet og kostnader) er avgjørende faktorer for vurdering. Lateral vannføring enheter (LFDs) som Immunostrip og PocketDiagnostic, populære metoder for påvisning av stedets patogen på grunn av sin enkelhet som en ettrinns analysen. Men kan LFDs ikke være rett diagnoseverktøyet i alle situasjoner fordi de mangler sensitivitet og spesifisitet, og noen ganger gir tvetydig resultater hvis målet patogen Lavinnblanding og kan cross-react med lignende arter eller arter 2. Loop-mediert isotermiske forsterkning (lampe) gjelder også for på stedet patogen gjenkjenning og er spesielt rimelig rimelige reagenser, reaksjonen forhold som er konstante, og enkel kolorimetrisk visuell analyse. Både LFDs og lampe vanligvis brukes imidlertid kvalitativt, selv om begge tilnærminger kan brukes kvantitativt med dyrere utstyr3. Polymerasekjedereaksjons (PCR) tilbyr høy spesifisitet, høy følsomhet og en kvantitativ evne i forhold til de nevnte metodene gjenkjenning. Men krever konvensjonelle lab-basert PCR teknologien dyre laboratorieutstyr og dyktige personell, som er en stor ulempe i vedta denne teknologien som en gjenkjennings-metoden for på stedet formål.
I denne protokollen, er en egen diagnostisk metode bruke en bærbar sanntid PCR instrument vist. Sanntid PCR-teknologi tilbyr fordeler over andre metoder når det gjelder kvantitativt nøyaktighet, følsomhet og allsidighet, og har vært mye brukt for påvisning av et bredt spekter av anlegget patogener4,5, inkludert ulike potet patogener i jord6. På grunn av de nye trendene for hurtig voksende og konkurransedyktige markedet, har utstyr som kreves for PCR-teknologi fortsatt å utvikle for å være mer kompakt og billigere7. Protokollen består av følgende: magnetisk perle-baserte nukleinsyre utvinning, bærbare sanntid PCR (fluorogenic probe-baserte analysen) og kvantitative dataanalyse som kan alt gjøres eksternt ved hjelp av en bærbar datamaskin (figur 1).
Ved hjelp av bærbare PCR-protokollen utviklet her, jordprøver ble analysert for å oppdage jord-borne patogen, Spongospora subterranea. Spongospora ble valgt som det er en viktig potet patogen som kausale agent pulveraktig skorpe8. I de siste tiårene som tilstedeværelse av denne sykdommen å ha spredt seg til mange områder der poteter er vokst9,10. Pulveraktig skorpe, gjennom tilstedeværelse av kvise som lesjoner på knoller kan forårsake betydelig kvalitativ gir tap på potet dyrkere. I tillegg kan S. subterranea vektor potet mopp topp Virus (PMTV), som kan forårsake interne lesjon symptomer i knoller (kjent som spraing)11,12. Derfor er det viktig å vite om S. subterranea finnes i felt før planting6. Vi viser også nytten av denne protokollen for påvisning av Rhizoctonia solani anastomose gruppe 3 (AG3) og PMTV. Selv om flere anastomose grupper av Rhizoctonia solani føre sykdommer i poteter, AG3 er uten tvil den viktigste verdensomspennende13, forårsaker stamme forderve og svart scurf resulterer i salgbare gir tap på opptil 30%14. PMTV fører nekrotisk lesjoner i knoller, ofte kalt spraing. Dette viruset har nylig rapportert for første gang flere stater i de nordvestlige15,16,17, og er av økende bekymring for bøndene i denne viktige potet voksende regionen. I tillegg til å fastsette hvor effektive bærbare PCR for disse viktige sykdommer, optimal DNA utvinning metodikk og jord utvalgsstørrelsen ble også undersøkt i denne studien.
Resultatene tyder på at den bærbare PCR-metoden er allsidig og gjelder for påvisning av forskjellige patogener. Stedets oppdagelsen metoden vi utviklet kan tillate frontline arbeiderne i landbruket (f.eks dyrkere) å gjøre tidligere vedtak om sykdom ledelse, som ulike valg eller rotasjoner, og kan kvantifisere en plante patogen i utvalget under en feltet undersøkelse, før planting, for å unngå potensielle sykdomsutbrudd.
Som vist i tabell 1, har siste teknologiske fremskritt i molekylær identifikasjon av patogene agenter økt effekt, nøyaktighet og hastighet av diagnose, som har bidratt til oppdagelsen av pre symptomatisk infeksjoner27. Om stedets diagnose, lampe og lateral-flow metoder brukes ofte fordi de er bærbare og gir umiddelbare resultater til en lavere kostnad. Men i serologisk metoder, kan artsspesifikke gjenkjenning være vanskelig å oppnå. Dette fører noen ganger misdetection av off-målet mikrober som vanlig jord innbyggere. For eksempel kan det være kryssreaksjon mellom serologisk tester av Phytophthora spp. og Pythium spp. ved potet patogener28, som indikerer at det er noen ganger problemer oppdage målrettet anlegget patogener.
Studien, har vi utviklet en optimalisert protokoll på stedet molekylær deteksjon av jord-borne potet patogener ved hjelp av bærbare sanntid PCR-systemet ved å sammenligne sine evner med at av en konvensjonell lab-sanntid PCR systemet. Vi fant at metoden på stedet spesielt oppdager potet patogener i jordprøve, selv om følsomhet er ~ 10 ganger lavere enn for en tilsvarende lab-basert analyse. Det er også verdt å vurdere at i dette tilfellet både laboratorium og feltet test ikke brukte en biologisk relevante utvalgsstørrelsen. Store utvalgene er nødvendig i rutinemessig screening feltet jord som beskrevet tidligere29,30, hvor utvalgene av mellom 250 g til 1 kg er behandlet, selv om disse metodene krever dyktige operatører og sofistikert utstyr for å trekke ut DNA. Vanligvis hentes en storstilt jord DNA pakke fra en enkelt samlet jord eksempel representant for mange underutvalg over 1 til 4 hektar6,29,30. Men protokollen utviklet her er rask, lett-å-bruk for brukere uten tidligere erfaring i molekylær diagnostikk og kan brukes utenfor en lab. Metoden er rask og relativt billig sammenlignet med storskala jord utvinning, kan den brukes til skjermen mange småskala prøver tatt fra et tilsvarende område som prøvetaking til storskala samlet prøver. Dette kan overvinne noen av en liten utvalgsstørrelsen og finne mer informasjon om den romlige fordelingen av patogen i feltet. I tillegg portabiliteten og hastigheten på metoden betyr at den kan også brukes i demonstrasjonen aktiviteter til bøndene for pedagogiske og engasjement.
En annen vurdering er at mange sanntid PCR analyser er allerede publisert for et bredt spekter av anlegget patogener5. Dette systemet kan gjøre bruk av disse eksisterende analyser uten behovet for å designe nye lampe primere aktivere i feltet testing. En hyppig kritikk av lampe analyser er at de kan være vanskelig å utforme31. Bærbar PCR, derfor kan relativt lett gjennomføringen av en rekke lett tilgjengelige patogen tester på stedet testing.
Tradisjonelle metoder kan ofte kostbare, arbeidskrevende, unøyaktig og tidkrevende. Enkelheten i stedet metoden utviklet vi kan bønder og arbeidere patogen etter seg selv og kanskje generere et resultat mye raskere enn å sende til en diagnostisk laboratorium som kan være et stykke borte. Promptness og følsomhet for den bærbare PCR-metoden kan hjelpe growers unngå potensielle sekundære infeksjoner, som kan øke patogen befolkningen og utilsiktet spredning (via utstyr eller mennesker). Avslutningsvis gjør på stedet metoden utviklet studien nøyaktig og relativt følsom oppdagelsen av viktige jord-borne patogener i feltet. Vårt håp er at stedet metoden som ble utviklet i denne studien vil bidra i en gjeldende diagnostiske rørledning (figur 6), ikke bare ved å gi raske og nøyaktige svar på epidemiologisk spørsmål om anlegget sykdommer i feltet, men også ved å tilby økt forståelse av biologi og epidemiologi av plante-patogener.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for Dr. Neil C. Gudmestad ved North Dakota State University for å gi S. subterranea plasmider DNA, Dr. Hanu Pappu på Washington State University (WSU) for å gi PMTV RNA og Dr. Debra Inglis på WSU for å gi R. solani AG3. Spesiell takk til Dr. Jeremy Jewell på WSU for å gi kommentarer på manuskriptet og WSU CAHNRS kommunikasjon for videography. Denne forskningen ble støttet av Northwest potet forskning konsortiet og det Washington State Department of Agriculture – spesialitet beskjære Block Grant Program (gi nei. K1764). PPNS nr. 0741, avdeling av Plant patologi, College of Agriculture, menneskelige og naturlige ressurs Sciences, Agricultural Research Center, Luke prosjektet nr. WNP00833, Washington State University, Pullman, WA, USA.
White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
Masterclear cap strips & real‑time PCR tube strips | Eppendorf | 9510222109 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |