Summary
Nous décrivons une plateforme d’analyse ARN de transfert original nommée SPOt (plateforme simplifiée pour l’observation des ARNt). SPOt mesure simultanément les concentrations cellulaires de tous les ARNt dans des échantillons biologiques, en seulement trois étapes et en moins de 24 heures.
Abstract
ARN de transfert (ARNt) sont abondantes court non codantes d’ARN qui sont typiquement de 76 à 90 nucléotides de long. ARNt est directement responsables de la synthèse des protéines par la traduction des codons de l’ARNm dans les séquences d’acides aminés. ARNt ont été longtemps considérée comme molécules ménager qui ne disposaient pas de fonctions de réglementation. Toutefois, un nombre croissant de preuves indique que les concentrations cellulaires de tRNA fluctuent en correspondance de diverses conditions telles que le type de cellule, environnement et le stress. La fluctuation de l’expression de l’ARNt influence directement la traduction de gène, favorisant ou de réprimer l’expression des protéines particulières. Finalement comprendre la dynamique de la synthèse des protéines nécessite le développement de méthodes capables de fournir des profils de tRNA de haute qualité. La méthode que nous vous présentons ici est nommée place, ce qui signifie simplifiée Platform for Observing ARNt. Place se compose de trois étapes qui commence par un marquage métabolique de cultures cellulaires avec radioactif orthophosphate, suivie d’extraction thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium d’ARN total radioactifs et enfin imprimé hybridation sur interne macroréseaux. niveaux d’ARNt sont estimés par quantifier les intensités de radioactivité à chaque endroit de la sonde. Dans le protocole présenté ici nous vous présentons des ARNt à Mycobacterium smegmatis mc2155, une bactérie non pathogène, souvent utilisée comme un organisme modèle pour étudier la tuberculose.
Introduction
Les concentrations cellulaires de tRNA fluctuent en fonction des conditions telles que le type de cellule, l’environnement et stress1,2,3. SPOt, plateforme simplifiée pour l’observation des ARNt, est un original, fiable et une technique simple qui permet la quantification rapide et précise des niveaux d’ARN de transfert dans les organismes cultivés en laboratoire.
ARNt ont remarquablement stables structures secondaires et tertiaires,4. Elles affichent également les nombreuses modifications post-transcriptionnels5. Ces caractéristiques représentent structurels importants et barrages de séquence polarisation ou empêchant parfois directe et reproductible tRNA profilage à l’aide de la norme standard RNA quantification techniques6. Groupes de recherche du monde entier ont dû développer des techniques créatives mais souvent alambiquées pour évaluer les concentrations cellulaires de tRNA. Certaines de ces méthodes comprennent : (1) séparation par électrophorèse bidimensionnelle des ARNt métaboliquement marqués combinés avec affectation spot méthodique par Northern blot1; (2) individuelle quantification par Northern blot utilisant soigneusement normalisée radioactifs sondes ADN7; (3) après extraction d’étiquetage avec les fluorochromes cyanine suivie de microarray analysis3et (4) in vitro se déshabillant des modifications ARNt à l’aide d’enzymes recombinantes demodification combinées avec la transcription inverse et suivantes séquençage haut-débit8.
SPOt est une combinaison simple et originale de deux approches standards et simples : corps RNA (1), étiquetage, qui consiste dans la synthèse, en croissance d’organismes, d’ARN total radioactifs et ARNt (2) macroréseaux, un outil génomique systématique et miniaturisé optimisé pour la ségrégation de l’ARNt.
Les échantillons sont simplifiés d’organismes vivants à la plate-forme de la quantification. Ils sont analysés directement après extraction et pas traitement pas plus qui limite considérablement les préjugés par rapport aux techniques nécessitant une extraction après amplification ou traitements enzymatiques. SPOt est polyvalent et peut être facilement combiné au fractionnement de polysome pour identifier et quantifier des sous-populations de tRNA physiquement associés à traduire des ribosomes.
Le protocole présenté ici est optimisé pour Mycobacterium smegmatis, et on l’utilisait aussi avec succès à profil ARNt dans Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10, souris et cultures de cellules humaines11 .
Protocol
1. culture et marquage métabolique
- Piquez une fois le centre de la calotte d’un tubes de micro-centrifugeuse stérile de 1,5 mL avec une aiguille de calibre 18 pour permettre une aération adéquate. Inoculer 500 µL de milieu stérile 7H 9 bouillon 5 µl de M. smegmatis d’un starter culture cultivés au jour le jour12.
NOTE : La recette pour un litre de 7H 9 bouillon est : poudre de 4,7 g Commercial 7H 9, 2 mL glycérol, 1 mL de Tween 80 et 0,85 g NaCl, 5 g, l’albumine 2 g Dextrose, H2O (pour apporter un volume total de 1 L).- (Attention) Selon les pratiques de radioprotection standard, doper les milieux de culture avec 20 µCi/mL [32P] Na2HPO4. Cultiver les bactéries à l’agitation de 37 ° C et 1 200 tr/min, dans un incubateur shaker placé derrière un bouclier acrylique épais de 9 mm.
- Lors de la phase demi-phase (O.D.600 nm ~ 0,5), transférer la culture entière dans un tube à bouchon à vis 2 mL et granulés radioactifs bactéries à température ambiante par centrifugation à 2 min à 10 000 x g. recueillir le surnageant contenant l’orthophosphate radioactif non constituées en société en conteneur à déchets approprié.
2. préparation d’ARN total
NOTE : Total RNAs sont extraites de granulés bactériennes à l’aide d’un réactif d’extraction ARN commercial (contenant du thiocyanate de guanidinium, phénol et le chloroforme) suivant le protocole du fabricant.
- Ajouter 1 mL de réactif d’extraction d’ARN commercial et environ 200 µL de perles de verre sur le culot. Boucher le tube solidement et perturber les bactéries dans un homogénéisateur pendant 2 min sous agitation maximale, (définition de numéro cinq sur l’instrument choisi (voir la Table des matières)).
- Échantillon de centrifugation à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 2 mL et jeter les perles convenablement. Ajouter 0,2 mL de chloroforme et agiter vigoureusement le tube à la main, pour 15 à s. Centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
- Recueillir la phase aqueuse de l’échantillon dans un nouveau tube de pêche à la ligne le tube à 45°. Éviter d’attirer l’interphase ou la couche organique. Ajouter 2 µL de précipitant colorée et 0,5 mL d’isopropanol 100 %. Agiter le tube vigoureusement à la main pendant 5 à s. Centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min à 4° C.
- Éliminer le surnageant du tube et jeter de manière appropriée comme la fraction liquide peut contenir des traces de radioactivité. Air des granulés secs pendant 5 min puis remettre en suspension dans 200 µL de 2 X solution saline-sodium citrate (SSC), 0,1 % (p/v) dodécyl sulfate de sodium (SDS) final.
Remarque : La composition du stock 20 X SSC est de 3,0 M NaCl, citrate de sodium 0,3 M, pH 7,0.
3. préparation des plaques de 96 puits imprimante
NOTE : microarrays ARNt sont manuellement imprimées avec quarante-deux 70-mer oligonucléotides d’ADN complémentaires à l’extrémité 3' de chaque ARNt M. smegmatis (terminal LCC exclus) à l’aide d’un arrayer huit broches. Les séquences des sondes oligonucléotides d’ADN ainsi que la présentation de la sonde dans la plaque du puits et le tableau sont fournis (fichier complémentaire 1 - feuille 1 à 3 respectivement).
- Des sondes d’ADN de conception par premières séquences récupération de tRNA ou gènes codant tRNA de tRNA bases de données comme l’ARNt génomiques13de la base de données. Garniture conservés 3' extrémité CCA si codé. Inverser la séquence résultante de complément. Sonde de commande basée sur les 70 premiers nucléotides.
- Remettre en suspension des sondes d’ADN secs dans l’eau. Ajuster la concentration de sondes à 100 µM. Dans une plaque de 96 puits, préparer 120 µL de 50 µM oligos en 3 X SSC, 0,01 % (p/v) SDS final (diluer 60 µL de stocks sondes dans les puits individuels avec 60 µL de 6 X SSC, 0,01 % (p/v) SDS.
- Plaque avec papier d’aluminium pour empêcher l’évaporation ou contamination, geler immédiatement et conserver à-20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
4. impression du tableau
- Dégelez la plaque 96 puits à température ambiante (prend environ 20 min).
- Lames de verre étiquette amine-enduit avec un stylo de diamant. Placer les lames dans l’unité d’indexation. Suivez le positionnement de la grille et procédez comme suit.
- Soigneusement tremper les broches replicator dans les puits.
- Doucement, affiche le tableau sur les lames de verre, à l’aide d’une pression minimale (vous vous sentirez une petite résistance). Vous pouvez imprimer sans nettoyage l’arrayer jusqu'à la fin avec bloc A.
- Lorsque vous êtes prêt à passer au bloc suivant, suivez la procédure de nettoyage décrite ci-dessous.
- Trempez replicator dans l’eau de Javel 5 % et agiter doucement.
- Appuyez sur replicator dans du papier absorbant.
- Tremper replicator dans l’eau distillée, agiter doucement et presser dans le papier. Répétez cette opération une fois.
- Plongez replicator dans l’isopropanol, agiter doucement et appuyez sur le papier.
- Sécher le réplicateur sur le ventilateur pour environ 20 s avant de passer au bloc suivant de la plaque à 96 puits. Continuer le nombre désiré de tirages.
- Laisser les lames à sécher, puis relier les oligos à la diapositive à l’aide d’une RETICULATION UV de 254 nm.
- Définissez le niveau d’énergie à 999 990 MJ/cm2.
- Mettre le visage de diapositives vers le haut sur une surface propre à la RETICULATION. Appuyez sur « start ».
- Bloquer les tableaux du jour au lendemain dans 450 mL de bloquant la solution sur un agitateur magnétique, à la température ambiante et sous agitation lente. Récupérer et réutiliser solution de saturation jusqu'à quatre fois.
NOTE : La recette pour la solution de saturation est : un tampon phosphate (NaH2PO4/Na2HPO4-) 125 mM, pH 7,2, SDS de 2,25 % (p/v), 0,5 mM EDTA, 0,5 X SSC, BSA 1 % (p/v). - Laver les diapositives 2 fois pendant 5 min dans 500 mL d’eau distillée à température ambiante. Sécher les lames par centrifugation pendant 10 s à température ambiante dans une centrifugeuse de microarray. Tableaux de magasin dans un endroit sec et sombre pendant 6 mois.
5. hybridation du tableau
- Avant l’hybridation rincer les lames dans l’eau bouillante et sécher par centrifugation (comme dans 4.6).
- Placer le tableau à l’intérieur d’une cassette d’hybridation et de charger l’échantillon radioactif de RNA.
- Exécuter la station de l’hybridation-lavage automatisée pour la reproductibilité maximale.
- Programmation des étapes comme suit. Joints de condition pendant 2 min à 75 ° C. Introduire la sonde à 60 ° C.
Dénaturer des sondes et des échantillons de 5 min à 90 ° C. Hybrider les échantillons pendant 3 h à 60 ° C.- Les lames à 50 ° C, deux fois avec 2 X SSC, SDS 0,1 % (p/v), débit 10 s et 20 s. lavage diapositives à 42 ° C, deux fois avec 0,1 s de débit 10 X SSC, SDS 0,1 % et tenir 20 diapositives de lavage s. à 42 ° C, deux fois avec 0,1 X SSC , débit 10 s et maintenez 20 s.
- Programmation des étapes comme suit. Joints de condition pendant 2 min à 75 ° C. Introduire la sonde à 60 ° C.
- Diapositives secs par centrifugation (comme dans 4.6).
6. quantification du tableau
- Envelopper les diapositives à l’aide d’une fine pellicule de plastique. Vérifier les diapositives pour signal radioactif en utilisant un compteur Geiger sur son cadre plus sensible. Exposer des diapositives sur un écran de phosphore de stockage dans une cassette d’exposition à la température ambiante pendant 10 à 90 h selon l’intensité du signal.
Remarque : Comme la sensibilité des compteurs Geiger varient d’un instrument à l’autre, temps d’exposition doivent être optimisés empiriquement. - Scanner de diapositive à 50 µm de résolution à l’aide d’un phosphorimager. Quantifier et fond-soustraction des intensités de radioactivité à chaque place de sonde en utilisant le logiciel gratuit d’Image J mis à niveau avec un profileur de microarray.
- Organiser et traiter des données à l’aide d’un chiffrier électronique. Produire des cartes de chaleur à l’aide de l’outil de mise en forme conditionnelle. Représentent par exemple chaque signal de la sonde sous forme de fraction (exprimé en ‰) du signal sonde total.
Representative Results
Trois biologiques indépendants réplique montrent que, dans les conditions de croissance testés, tous M. smegmatis tARNs sont exprimées au-dessus du niveau de fond (Figure 1). Dans cette expérience particulière, l’écart observé pour chaque sonde est comprise entre 2 % (Arg (TCT)) et 22 % (Cys (GCA)) avec une médiane à 5 % (Figure 1). Fausses changements entre les répétitions sont significativement influencées par des facteurs tels que la préparation du tableau et l’hybridation. Reproductibilité élevée est obtenue grâce à l’impression de tableau prudente et cohérente mais aussi automatisé d’hybridation de l’échantillon. Il y a une différence 5 fois entre ARNt Ile (GAT) et ARNt (Val (TAC), les plus hauts et plus bas abondantes espèces respectivement. SPOt montre que l’expression d’ARNt isoaccepteurs n’est pas uniforme. Isoaccepteurs sont des espèces qui détiennent le même acide aminé, mais affichent des séquences de l’anticodon différents et donc décodent les codons différents sur l’ARNm. Par exemple, tous les Alanine isoaccepteurs sont exprimés à des niveaux semblables, alors que l’Arginine maximale et minimale, acceptant des ARNt diffèrent par un facteur 3.
Figure 1 : résultats de macroarray tRNA représentatif. (A) scanné bactérienne, souris et macroréseaux humaine. Les tableaux de M. smegmatis utilisent sondes seulement 43 au lieu de 48 pour la souris et l’homme. En conséquence, la matrice bactérienne affiche 40 places vides (sondes sont répliquées huit fois sur chaque tableau) qui se fondent avec le fond. La plupart d'entre eux est regroupée dans le coin supérieur gauche. (B) histogramme et heatmap représentations des profils de tRNA chez M. smegmatis dans des conditions optimales de croissance. Signaux de la sonde sont la moyenne des trois expériences indépendantes (y compris la croissance bactérienne, marquage métabolique, extraction et tableau d’hybridation) et sont exprimés selon les valeurs de milliers des ARNt total. Écarts-types pour les trois répétitions sont indiqués comme des barres d’erreur et les nuances d’orange sur l’histogramme et heatmap, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Les émissions de particules bêta sont connues des agents bactériostatiques et bactéricides14, cependant les rayonnements dans la gamme testée n’ont aucun incidence significative sur l’aptitude de la cellule. Comptage par scintillation a montré que la radioactivité est incorporée dans 25 % des extraits de cellules total et par la suite, 1 % d’ARN total purifiée.
Des sondes tailles identiques, température de fusion comparable et contenu en GC, ainsi qu’un protocole uniform pour macroarray spotting, hybridation et quantification permet impartiale mesurage des niveaux de tRNA directement à partir de signaux spots.
SPOt est précis et reproductible. Sa large gamme dynamique et seuil facilement réglable permet de profilage basses espèces abondantes, comme les ARNt associé polysomes, simplement en prolongeant de tableau exposition fois9. Après l’investissement initial pour le matériel nécessaire, le fonctionnement, coût par échantillon, y compris des consommables, en moyenne 15 $ par échantillons.
SPOt est applicable à tout organisme dont le génome est disponible pour la conception de la sonde. Organismes modèles qui sont cultivés in vitro sont des candidats idéaux pour le marquage métabolique. Comme les génomes de mammifères codent souvent beaucoup isodecoders (ARNt qui partage les anticodons identiques mais affiche des petites différences dans leur séquence de corps) sondes doivent être partiellement dégénérés pour préserver l’hybridation des espèces voisines de tRNA homogène. Enfin, des cellules de mammifères adhérentes produisent typiquement inférieure donne d’ARN total par rapport aux organismes cultivés en suspension telles que M. smegmatis, donc les cultures doivent être sensiblement intensifié.
Disclosures
Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de SC INBRE de la National Institute of General Medical Science - NIH (P20GM103499 à R.G.) et donne le CA555536 & CA154664 de l’Institut National du Cancer à P.H.H. Ce programme a été soutenu en partie par une subvention pour le Collège de Charleston par le Howard Hughes Medical Institute à travers le pré-college & programme d’enseignement de premier cycle sciences et par des subventions du National Center for Research Resources (5 RR016461 P20) et le National Institute of General Medical Sciences (P20 8 GM103499) des National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
| Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
| 96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
| Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
| Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
| Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
| Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
| Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
| Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
| [32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
| 0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
| Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
| Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
| Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
| DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
| UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
| Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
| Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
| Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
| 2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
| Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
| 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
| Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
| 20 X SSC | Lonza | 51205 | |
| SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
| hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
| Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
| 0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |
References
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