Summary
우리는 원래 전송 RNA 분석 플랫폼 자리 (유선형 플랫폼 관찰 하는 tRNA) 라는 설명 합니다. 자리 동시에 세포 수준의 생물 학적 샘플, 3 단계, 그리고 24 시간 이내에 모든 tRNAs 측정합니다.
Abstract
전송 RNAs (tRNA)는 풍부한 짧은 비 코딩 RNA 종 일반적으로 76 ~ 90 뉴클레오티드 길이에서. tRNAs는 codons mRNA에 아미노산으로 변환 하 여 직접 단백질 합성에 대 한 책임이 있습니다. tRNAs 했다 긴 집 유지 분자 규제 기능 부족으로 간주 됩니다. 그러나, 증거의 성장 몸은 셀룰러 tRNA 레벨 셀 유형, 환경, 스트레스 등 다양 한 조건에 대응에 변동 나타냅니다. TRNA 식의 변동 진 번역을, 선호 또는 특정 단백질의 식을 억압에 직접 영향을 줍니다. 궁극적으로 단백질 합성의 동적 이해 높은-품질 tRNA 프로필을 제공할 수 있는 방법의 개발을 필요 합니다. 우리가 여기에 제시 하는 방법 자리 관찰 tRNA를 위한 간소화 된 플랫폼에 대 한 의미 하는 이름입니다. 자리 방사성 orthophosphate, guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출 방사성 총 RNAs의 뒤와 세포 배양의 대사 라벨로 시작 하는 3 단계 구성 하 고 마지막으로 사내에 교 잡 인쇄 macroarrays입니다. tRNA 레벨은 각 조사 현장에서 방사능 농도 측정 하 여 견적 된다. 여기에 제시 된 프로토콜에서 우리는 진 균 smegmatis mc2155, 결핵 연구에 모델 생물으로 자주 사용 nonpathogenic 박테리아에에서 tRNAs 프로필입니다.
Introduction
세포질 tRNA 레벨 셀 유형, 환경, 스트레스1,2,3등 조건에 따라 변동. 자리, tRNA, 관찰을 위한 효율적인 플랫폼 이며 원본, 신뢰할 수 있는, 실험실 성장 유기 체에서 전송 RNA 레벨의 신속 하 고 정확한 정량화를 허용 하는 간단 기술.
tRNAs 있다 현저 하 게 안정 된 2 차 및 3 차 구조4. 그들은 또한 수많은 post-transcriptional 수정5를 표시합니다. 이러한 기능은 중요 한 구조 및 시퀀스 검문소 바이어 싱 또는 때로는 직접적이 고 재현 tRNA 표준 벤치 마크 RNA 정량화 기법6을 사용 하 여 프로 파일링 방지를 나타냅니다. 전 세계 연구 단체 세포질 tRNA 수준을 평가 하 창조적인 하지만 종종 복잡 한 기술을 개발 하도록 강요 했다. 이러한 방법 중 일부를 포함: (1) 2 차원 전기 이동 별거 metabolically 레이블이 tRNAs의 조직적 자리 배정 북부 오 점1;에 의해 결합 (북부 여 2) 개별 정량화 되 신중 하 게 표준화 된 방사성 DNA 프로브7;를 사용 하 여 리 (microarray 분석3, 그리고 (4) 생체 외에서 의 tRNA 수정 반전 녹음 방송 결합 및 후속 재조합 demodification 효소를 사용 하 여 스트립 다음 cyanine 형광와 라벨 3) 게시물 추출 높 처리량 연속8.
자리는 2 개의 표준 및 간단 접근의 간단 하 고 원래의 조합: (1) RNA 몸, 성장 하는 유기 체, 방사성 총 RNAs tRNA (2) macroarrays, 체계적이 고 소형 게놈 도구의 합성에서으로 구성 된 tRNA 분리에 대 한 최적화.
샘플은 정량화 플랫폼에 살아있는 유기 체에서 간소화 됩니다. 그들은 직접 추출 후 분석 하 고 어떤 더 크게 증폭 후 추출 또는 효소 치료 기법에 비해 편견 제한 처리 되지 않습니다. 자리는 다양 하 고 식별 하 고 물리적으로 연결 된 리보솜 번역 tRNA 모집단 계량 polysome 분별에 쉽게 결합 될 수 있다.
여기에 제시 된 프로토콜은 진 균 smegmatis, 최적화 되어 있으며 그것은 또한 성공적으로 대장균9, Saccharomyces cerevisiae10, 마우스, 그리고 인간의 세포 배양11 프로필 tRNAs에 사용 되었다 .
Protocol
1. 문화 및 대사 라벨
- 적절 한 환기를 허용 하도록 18 게이지 바늘 한 번 살 균 1.5 mL 마이크로 원심 튜브의 뚜껑의 중심 찌른. 보충된 살 균 7 H 9의 500 µ L를 접종 선발에서 M. smegmatis 의 5 µ L로 국물 문화 성장된 하룻밤12.
참고: 7 H 9의 1 리터에 대 한 제조 법 국물은: 4.7 g 상업 7 H 9 분말, 2 mL 글리세롤, 1 mL 트윈 80, 0.85 g NaCl, 5 g 알 부 민, 2 g 포도 당, H2O (1 l 총 볼륨 려).- (주의) 표준 radioprotection 관행에 따라 스파이크 [32P] 나2HPO420 µCi/mL와 함께 문화 미디어. 9 m m 두꺼운 아크릴 방패 뒤에 흔드는 인큐베이터에서 37 ° C와 1200 rpm 동요에서 박테리아 성장.
- Midlog 단계 (O.D.600 nm ~ 0.5)에서 전체 문화 2 mL 스크류 캡 튜브에 전송과 centrifuging 여 실 온에서 방사성 박테리아 작은 공의 10000 x g. 2 분 수집 표면에 뜨는 포함 비법 인된 방사성 orthophosphate에 대 한 적절 한 폐기물 컨테이너입니다.
2입니다. 총 RNAs의 준비
참고: 총 RNAs (guanidinium 안산, 페 놀, 클로 프롬 포함) 상업적인 RNA 추출 시 약을 사용 하 여 세균성 알갱이에서 추출 제조 업체의 프로토콜을 따르고.
- 상업적인 RNA 추출 시 약의 1 mL 및 펠 릿에 유리 구슬의 약 200 µ L를 추가 합니다. 튜브를 안전 하 게 뚜껑과 최대 교 반, 아래 2 분 동안 균질 화기에 박테리아를 방해 (번호 5 선택한 악기에 설정 ( 재료의 표참조)).
- 4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기 샘플 새로운 2 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 구슬을 적절 하 게 삭제. 클로 프롬의 0.2 mL를 추가 하 고 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g에서 15 s. 원심 분리기에 대 한 손으로 적극적으로 튜브를 흔들어
- 낚시 튜브 45 °에 의해 새로운 관으로 샘플의 수성 단계를 수집 합니다. Interphase 또는 유기 레이어 그리기 하지 마십시오. 2 컬러 비례적의 µ L, 100% 소 프로 파 놀의 0.5 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g에 5 미 원심 분리기에 대 한 손으로 적극적으로 튜브를 흔들어
- 상쾌한 튜브에서 제거 하 고 적절 하 게 폐기 액체 분수 방사능의 흔적을 포함 수 있습니다. 공기 건조 펠 렛 5 분 후 염 분 나트륨 시트르산 (SSC) 0.1% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 마지막 X 2의 200 µ L에서 resuspend.
참고: 구성 주식 20 X SSC는 3.0 M NaCl, 0.3 M 나트륨 구 연산 염, pH 7.0.
3입니다. 96 잘 프린터 접시의 준비
참고: tRNA microarrays 40 2 70-메 르 DNA oligonucleotides 8 핀 arrayer를 사용 하 여 각 M. smegmatis tRNA (터미널 CCA 제외)의 3' 끝에 보완 수동으로 인쇄 됩니다. DNA oligonucleotide 조사 잘 판에 배열 프로브 레이아웃의 시퀀스 제공 됩니다 (추가 파일 1-시트 1 ~ 3 각각).
- 디자인 DNA 프로브 검색 첫 번째 tRNA 시퀀스 또는 tRNA 인코딩 유전자 게놈 tRNA 등 tRNA 데이터베이스에서 데이터베이스13제공 합니다. 트림 보존 3' 끝 CCA 인코딩된 경우입니다. 보완 결과 시퀀스를 역방향. 주문 조사 처음 70 뉴클레오티드에 따라입니다.
- Resuspend는 DNA 프로브 물에 건조. 100 µ m 프로브 농도 조정 합니다. 96 잘 접시에서 3 X SSC, 0.01% (w/v) SDS 최종 (희석 60 µ L에 개별 잘 재고 프로브와 6 X SSC, 0.01% (w/v) SDS의 60 µ L에서에서 50 µ M oligos의 120 µ L를 준비.
- 증발 또는 오염 방지 즉시 동결 하 고, 필요할 때까지-20 ° C에서 유지 하도록 깡통 호 일 접시 커버.
4. 배열 인쇄
- 상 온 (약 20 분 소요)에서 96 잘 접시 녹여
- 다이아몬드 펜 아민 코팅 유리 슬라이드 레이블. 슬라이드 인덱싱 장치에 놓습니다. 그리드 배치를 수행 하 고 다음과 같이 할.
- 신중 하 게 우물에 복제기 핀 수영.
- 부드럽게 인쇄 (작은 저항을 느낄 것 이다) 최소한의 압력을 사용 하 여 유리 슬라이드에 배열. Arrayer 블록 a 완료 될 때까지 청소 하지 않고 인쇄를 계속
- 다음 블록을 이동할 준비를 하는 경우 아래 설명 된 세척 절차를 따릅니다.
- 5% 표 백제에 복제기와 부드럽게 악수.
- 흡수 성 종이에 복제기를 누릅니다.
- 복제기는 증류수에 찍어 부드럽게 흔들, 하 고 종이에 누릅니다. 일단이 단계를 반복 합니다.
- 소 프로 파 놀에 복제기, 부드럽게 흔들어와 종이에 눌러.
- 건조 한 약 20 팬에 복제기 96 잘 접시의 다음 블록을 이동 하기 전에 s. 인쇄의 원하는 번호를 계속 합니다.
- 건조 후 crosslink 254 nm UV crosslinker를 사용 하 여 슬라이드에 oligos 슬라이드 수 있습니다.
- 999,990 µ / c m2에 에너지 레벨을 설정 합니다.
- crosslinker에 깨끗 한 표면에 슬라이드 얼굴을 올려. "시작"을 누릅니다.
- 차단 차단 솔루션 자력, 실내 온도에 그리고 느린 동요의 밑에 450 mL에서 하룻밤 배열. 수집 및 재사용 차단 솔루션 최대 4 배.
참고: 차단 솔루션에 대 한 제조 법은: 125 m m 인산 버퍼 (NaH2포4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2.25 %SDS (w/v), 0.5 m m EDTA, 0.5 X SSC, 1 %BSA (w/v). - 500 mL의 증류수에 실 온에서 2 시간 5 분 대 한 슬라이드를 씻어. 슬라이드 10 centrifuging 여 건조 실내 온도 microarray 원심 분리기 s. 최대 6 개월까지 건조 하 고 어두운 장소에서 저장소 배열입니다.
5. 배열 교 잡
- 교 잡 하기 전에 끓는 물에 슬라이드를 헹 구 고 (4.6)에서 원심 분리 하 여 건조.
- 교 잡 카세트 안에 배열을 놓고 방사선된 RNA 샘플을 로드 합니다.
- 최대 재현성에 대 한 자동화 된 세척 교 잡 역을 실행 합니다.
- 다음으로 프로그램 단계입니다. 75 ° c.에서 2 분에 대 한 조건 가스 켓 60 ° c.에 프로브를 소개
프로브 및 샘플 90 ° c.에서 5 분 변성 60 ° c.에 3 h에 대 한 샘플을 교배- 20 두 번 0.1 X SSC, 0.1 %SDS, 흐름 10 s와 42 ° C에 세척 슬라이드 s. 누르고 0.1로 두 번 42 ° C에서 20 미 세척 슬라이드 슬라이드 2 X SSC, 0.1% (w/v) SDS 흐름 10 s로 두 번 50 ° C에 세척 누르고 X SSC 흐름 10 s와 홀드 20 s.
- 다음으로 프로그램 단계입니다. 75 ° c.에서 2 분에 대 한 조건 가스 켓 60 ° c.에 프로브를 소개
- 슬라이드 (4.6)에서 원심 분리 하 여 건조.
6. 배열 정량화
- 얇은 플라스틱 필름을 사용 하 여 슬라이드를 감싸 줍니다. 그것의 가장 중요 한 설정에가 거 카운터를 사용 하 여 방사성 신호에 대 한 슬라이드를 확인 합니다. 신호 강도 따라 10 ~ 90 h에 대 한 실내 온도에 노출 카세트에 저장 인광 체 스크린에 슬라이드를 표시 합니다.
참고:가 거 카운터의 감도 다른 하나의 장비에서 다, 노출 시간 낙관 되어야 한다 실험적으로. - 50 µ m 해상도 phosphorimager를 사용 하 여 슬라이드를 검사 합니다. 계량 하 고 배경 빼기 microarray 프로파일러와 함께 업그레이드 무료 이미지 J 소프트웨어를 사용 하 여 각 조사 현장에서 방사능 농도.
- 구성 하 고 전자 스프레드 시트를 사용 하 여 데이터를 처리 합니다. 조건부 서식 도구를 사용 하 여 열 맵을 생성 합니다. 대표 예 각 프로브 신호 (‰로 표현) 부분으로 총 프로브 신호.
Representative Results
3 개의 독립적인 생물 복제 쇼, 테스트 성장 조건, 모든 M. smegmatis tRNAs 배경 수준 (그림 1) 위에 표시 됩니다. 이 특정 실험에서 관찰 된 표준 편차 각 프로브에 대 한 2% (Arg (TCT)) 및 5% (그림 1)에서 평균 22% (Cys (GCA)) 사이 구성 됩니다. 복제 사이의 허위 변경 배열 준비 및 교 잡 같은 요인에 의해 크게 좌우 된다. 높은 재현성은 샘플 교 잡 자동화 뿐만 아니라 신중 하 고 일관성 있는 배열 인쇄를 통해 이루어집니다. TRNA 사이의 5 차이 Ile (GAT) 및 tRNA (발 (전술), 높고 낮은 풍부한 종 각각. 자리는 tRNA isoacceptors의 표현 유니폼을 보여줍니다. Isoacceptors는 동일한 아미노산을 개최 하지만 다른 anticodon 시퀀스를 표시 하 고 따라서 mRNAs에 다른 codons를 디코딩 종입니다. 반면 모든 알라닌 isoacceptors 비슷한 수준에서 표시 됩니다 예를 들어 수락 tRNAs 3-fold 다른 최고 및 최저 아르기닌.
그림 1: 대표적인 tRNA macroarray 결과. (A) Scanned 박테리아, 마우스 및 인간의 macroarrays M. smegmatis 배열 마우스 및 인간의 48 대신만 43 프로브를 사용합니다. 결과적으로, 세균성 배열 40 빈 관광 명소 (프로브는 각 배열에 8 번 복제 됩니다) 그 배경과 조화를 표시 합니다. 그들의 대부분 왼쪽된 상단 클러스터링 됩니다. 최적의 성장 조건 하에서 M. smegmatis 에 tRNA 프로필의 (B) 히스토그램 및 heatmap 표현. 프로브 신호 (를 포함 하 여 세균 성장, 신진 대사 라벨, 추출 및 배열 교 잡) 3 개의 독립적인 실험의 평균 이며, 총 tRNAs의 천 값에 의하여 표현 됩니다. 3 복제에 대 한 표준 편차는 각각 오차 막대와 막대 그래프와 heatmap에 오렌지의 음영으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
그러나 베타 입자 배출 시험된 범위에 방사선 셀 체력에 큰 영향을 주지 않습니다 bacteriostatic 및 살 균 에이전트14,으로 알려져 있습니다. 섬광 계산 보여주었다 방사능의 총 세포 추출 물 25% 및 그 후, 정제 총 RNAs의 1%에 통합 됩니다.
프로브 동일한 크기, 비교 용융 온도 및 GC 콘텐츠, macroarray 안보에 대 한 균일 한 프로토콜 함께 교 잡 및 정량화 자리 신호에서 직접 tRNA 레벨의 편견된 측정에 대 한 수 있습니다.
재현할 수 및 특정입니다. 그것의 넓은 동적 범위와 쉽게 조정 가능한 임계값 낮은 풍부한 종, tRNAs 배열 노출 시간9연장 하면 polysomes, 연관 프로 파일링 수 있습니다. 필요한 장비에 대 한 초기 투자 후 샘플, 소모품를 포함 하 여 당 비용 실행 샘플 당 $15를 평균 한다.
자리는 누구의 게놈은 프로브 디자인에 사용할 수 있는 모든 유기 체에 적용 됩니다. 생체 외에서 재배 되는 모델 생물 대사 라벨에 대 한 이상적인 후보자 이다. 포유류 게놈 종종 많은 isodecoders (동일한 anticodons를 공유 하지만 그들의 몸 시퀀스에서 작은 차이 표시 tRNAs) 인코딩으로 프로브 가까운 tRNA의 동종 하이브리드를 보존 하기 위해 부분적으로 퇴 화 될 필요가 있다. 마지막으로, 부착 포유류 세포에 M. smegmatis, 같은 문화 실질적으로 확장 될 필요가 성장 하는 유기 체에 비해 총 RNA의 일반적으로 낮은 금액을 산출 한다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언.
Acknowledgments
이 작업을 지원 했다 사우스 캐롤라이나 INBRE 교부 금에서 국립 연구소의 종합 의료 과학-NIH에 의해 (립에 P20GM103499) 국립 암 연구소에서 P.H.H. CA555536 및 CA154664를 부여 이 프로그램 지원 부분에서 전 대학 & 학부 과학 교육 프로그램을 통해 하 워드 휴즈 의학 연구소에서 차 알 스턴의 대학에 교부 금에 의해 그리고 국립 센터에서 교부 금에 의해 연구 자원 (P20 RR016461 5) 그리고 국립 연구소의 일반 의료 과학 (8 P20 GM103499) 건강의 국가 학회에서.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
| Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
| 96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
| Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
| Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
| Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
| Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
| Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
| Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
| [32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
| 0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
| Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
| Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
| Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
| DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
| UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
| Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
| Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
| Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
| 2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
| Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
| 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
| Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
| 20 X SSC | Lonza | 51205 | |
| SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
| hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
| Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
| 0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |
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