Summary
Vi beskriver en opprinnelige overføring RNA analyse plattform kalt SPOt (strømlinjeformet plattform for å observere tRNA). Sted måler samtidig mobilnettet nivåer av alle tRNAs i biologiske prøver, bare tre trinn, og i mindre enn 24 timer.
Abstract
Overføre RNAs (tRNA) er rikelig kort ikke-koding RNA arter som er typisk 76 til 90 nukleotider i lengde. tRNAs er direkte ansvarlig for proteinsyntese ved å oversette kodon i mRNA i amino acid sekvenser. tRNAs ble lenge ansett som vaktmester molekyler som manglet juridiske funksjoner. Men indikerer en voksende mengde bevis at mobilnettet tRNA nivåer svinge i korrespondanse for varierende forhold som celle type, miljø og stress. Svingninger i tRNA uttrykket påvirker direkte genet oversettelse, favoriserer eller repressing uttrykk for bestemt proteiner. Til slutt forstå dynamikken i proteinsyntese krever utviklingen av metoder kunne levere høykvalitets tRNA profiler. Metoden som vi presenterer her kalles SPOt, som står for strømlinjeformet plattform for observere tRNA. Stedet består av tre trinn starter med metabolske merking av cellekulturer med radioaktivt orthophosphate, etterfulgt av guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform utvinning av radioaktivt totalt RNAs og til slutt hybridisering på interne trykt macroarrays. tRNA nivåer er anslått av kvantifisere radioaktivitet intensiteten på hver probe spot. I protokollen presenteres her profil vi tRNAs i Mycobacterium smegmatis mc2155, en attenueres bakterie ofte brukt som en modell organisme for å studere tuberkulose.
Introduction
Mobilnettet tRNA nivåene variere i henhold til vilkår som celle type, miljø og stress1,2,3. Stedet, strømlinjeformet plattform for å observere tRNA, er en original, pålitelig, og enkel teknikk som gjør at rask og presis kvantifisering av overføring RNA i laboratoriet dyrket organismer.
tRNAs har bemerkelsesverdig stabil sekundære og tertiære strukturer4. De viser også mange post-transcriptional modifikasjoner5. Disse funksjonene representerer betydelige strukturelle og sekvens veisperringer biasing eller noen ganger hindrer direkte og reproduserbar tRNA profilering bruker standard benchmark RNA kvantifisering teknikker6. Forskningsgrupper verden ble tvunget til å utvikle kreative men ofte convoluted teknikker for å vurdere mobilnettet tRNA nivåer. Noen av disse metodene: (1) todimensjonal electrophoretic separasjon av metabolically merket tRNAs kombinert med metodisk spot tildeling av nordlige blot1; (2) personlige kvantifisering av Northern blot bruke nøye standardisert radioaktivt DNA sonder7; (3) etter utvinning merking med cyanine fluorochromes etterfulgt av microarray analyse3, og (4) i vitro stripping av tRNA endringer ved hjelp av rekombinant demodification enzymer kombinert med omvendt transkripsjon og påfølgende høy gjennomstrømming sekvensering8.
Stedet er en enkel og original kombinasjon av to standard og enkel tilnærminger: (1) RNA kroppen merking, som består i syntese, i voksende organismer, radioaktivt totalt RNAs og (2) tRNA macroarrays, en systematisk og miniatyriserte genomisk verktøy optimalisert for tRNA raseskille.
Eksempler er strømlinjeformet fra levende organismer kvantifisering plattformen. De analyseres direkte etter ekstraksjon og behandlet ikke noen videre som grenser betydelig biases sammenlignet med teknikker som krever etter utvinning forsterkning eller enzymatisk behandlinger. Stedet er allsidig og kan lett kombineres til polysome fraksjoneres å identifisere og telle tRNA subpopulasjoner fysisk forbundet med oversette ribosomer.
Protokollen presenteres her er optimalisert for Mycobacterium smegmatis, og det ble også brukt til profilen tRNAs i Escherichia coli9 Saccharomyces cerevisiae10, musen og menneskelige cellekulturer11 .
Protocol
1. kultur og metabolske merking
- POKE når midten av hetten av en bakteriefri 1.5 mL mikro-sentrifuge rør med en 18-gauge nål å tillate riktig lufting. Vaksinere 500 µL av supplert sterilt 7T 9 buljong med 5 µL av M. smegmatis fra en forrett kultur dyrket overnatting12.
Merk: Oppskriften på en liter 7T 9 suppen er: 4.7 g kommersielle 7T 9 pulver, 2 mL glyserol, 1 mL Tween 80, 0,85 g NaCl, 5 g Albumin, 2 g druesukker, H2O (for å ta totalt volum til 1 L).- (Advarsel) Følgende standard radioprotection praksis, spike kultur media med 20 µCi/mL [32P] Na2HPO4. Vokse bakterier på 37 ° C og 1200 rpm agitasjon, i en shaker inkubator plassert bak en 9 mm tykk akryl skjold.
- På midlog fase (O.D.600 nm ~ 0,5), overføre hele kultur i en 2-mL skrukork rør og pellets radioaktivt bakterier ved romtemperatur av sentrifugering for 2 min på 10 000 x g. samle supernatant som inneholder kommunefritt radioaktivt orthophosphate i aktuelle avfallsbeholderen.
2. utarbeidelse av totale RNAs
Merk: Totalt RNAs er trukket ut fra bakteriell pellets med en kommersiell RNA utvinning reagens (inneholder guanidinium thiocyanate, fenol og kloroform) etter produsentens protokoll.
- Legg 1 mL av kommersielle RNA utvinning reagens og ca 200 µL av glassperler på pellet. Cap røret sikkert og forstyrre bakteriell i en homogenizer i 2 minutter under maksimal agitasjon, (angi nummer fem på valgt instrument (se Tabell for materiale)).
- Sentrifuger eksempel på 12.000 x g i 10 min på 4 ° C. Overføre nedbryting til en ny 2-mL tube og kaste perler riktig. Legg 0,2 mL kloroform og rist tube kraftig hånd for 15 s. sentrifuge 12.000 x g i 15 min på 4 ° C.
- Samle den vandige fasen av utvalget i en ny tube av angling røret på 45°. Unngå tegning interphase eller organisk lag. Legg 2 µL av farget precipitant og 0,5 mL av 100% isopropanol. Rist røret kraftig hånd for 5 s. sentrifuge 12.000 x g for 10 min på 4° C.
- Fjern nedbryting fra røret og forkaste riktig som flytende brøken kan inneholde spor av radioaktivitet. Luften tørr pellet i 5 min deretter resuspend i 200 µL av 2 X saltholdig-natriumsitrat (SSC), 0,1% (w/v) natrium dodecyl sulfate (SDS) siste.
Merk: Sammensetningen av lager 20 X SSC er 3,0 M NaCl, 0,3 M natriumsitrat, pH 7.0.
3. forberedelse av 96 godt skriver plater
Merk: tRNA microarrays skrives manuelt med førti to 70-mer DNA oligonucleotides utfyllende til 3 slutten av hver M. smegmatis tRNA (terminal CCA utelukket) med en åtte-pinners arrayer. Sekvenser av DNA oligonucleotide sonder som oppsettet sonde i godt-platen og matrisen tilbys (supplerende fil 1 - ark 1 til 3 henholdsvis).
- Design DNA sonder første henting tRNA sekvenser eller tRNA koding gener fra tRNA databaser som Genomic tRNA Database13. Trim bevarte 3' slutten CCA hvis kodet. Omvendt supplement resulterende sekvensen. Bestill sonde basert på de første 70 nukleotider.
- Resuspend tørr DNA sonder i vann. Justere sonder konsentrasjon å 100 µM. I en 96 godt-plate, forberede 120 µL av 50 µM oligos i 3 X SSC, 0,01% (w/v) SDS finalen (fortynne 60 µL av lager sonder i individuelle godt med 60 µL av 6 X SSC, 0,01% (w/v) SDS.
- Dekkramme med aluminiumsfolie forhindre fordampning eller forurensning, fryse umiddelbart og holde på 20 ° C til nødvendig.
4. matrise utskrift
- Tine 96-brønns platen ved romtemperatur (tar ca 20 min).
- Etiketten Amin-belagt glass lysbilder med en diamant. Plasser lysbilder til indeksering enhet. Følg rutenettet plasseringene og gjør som følger.
- Nøye dukkert replikator pinnene i brønnene.
- Forsiktig ut matrisen på glass lysbilder, med minimal trykk (du vil føle en liten motstand). Fortsette utskriften uten arrayer til ferdig med blokk A.
- Når du er klar å gå videre til neste blokk, følg vask prosedyren beskrevet nedenfor.
- Dypp replikator i 5% blekemiddel og forsiktig risting.
- Trykk replikator på absorberende papir.
- Dypp replikator i destillert vann, forsiktig risting og trykk på papir. Gjenta dette trinnet når.
- Dypp replikator i isopropanol forsiktig risting og trykk på papiret.
- Tørr Replikatoren på viften for om 20 s før den går til neste blokk av 96-brønns plate. Fortsett til ønsket antall utskrifter.
- Gi lysbildene tørke deretter krysskobling oligos på lysbildet ved hjelp av et 254-nm UV crosslinker.
- Angi energi 999,990 µJ/cm2.
- Sette lysbilder ansiktet opp på en ren overflate i crosslinker. Trykk "start".
- Blokkere arrayene overnatting i 450 mL blokkerer løsningen på en magnetisk rørestang, ved romtemperatur og under langsom agitasjon. Samle og gjenbruke blokkerer løsning opptil fire ganger.
Merk: Oppskriften for blokkering løsningen er: 125 mM fosfatbuffer (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2,25% SDS (w/v), 0,5 mM EDTA, 0,5 X SSC, 1% BSA (w/v). - Vask lysbildene 2 ganger i 5 minutter ved romtemperatur i 500 mL destillert vann. Tørke lysbildene ved sentrifugering for 10 s ved romtemperatur i en microarray sentrifuge. Store matriser på et tørt og mørkt sted for inntil 6 måneder.
5. matrise hybridisering
- Før hybridisering skyll lysbilder i kokende vann og tørk med sentrifugering (som 4.6).
- Plassere matrisen i en hybridisering kassett og laste radiolabeled RNA prøven.
- Kjøre den automatiserte hybridisering-vaske stasjonen for maksimal reproduserbarhet.
- Programtrinn følgende. Tilstand pakninger i 2 minutter på 75 ° C. Introdusere sonde på 60 ° C.
Denature prober og prøver 5 min på 90 ° C. Hybridize prøver for 3t på 60 ° C.- Vask lysbilder ved 50 ° C to ganger med 2 X SSC, 0,1% (w/v) SDS, flyt 10 s og 20 s. vask lysbilder på 42 ° C to ganger med 0,1 X SSC, 0,1% SDS, flyt 10 s og holde 20 s. vask lysbilder på 42 ° C to ganger med 0,1 X SSC , flyt 10 s og hold 20 s.
- Programtrinn følgende. Tilstand pakninger i 2 minutter på 75 ° C. Introdusere sonde på 60 ° C.
- Tørr lysbilder med sentrifugering (som 4.6).
6. matrise kvantifisering
- Pakk lysbilder ved hjelp av en tynn plast film. Sjekk lysbilder for radioaktivt signalet med en Geiger-teller på den mest sensitive innstillingen. Utsett lysbilder på en lagring fosfor skjerm i en eksponering kassett ved romtemperatur for 10 til 90 h avhengig av signalstyrke.
Merk: Følsomhet Geiger tellere variere fra ett instrument til en annen, eksponeringstider må optimaliseres empirisk. - Skanne lysbilde 50 µm oppløsning ved hjelp av en phosphorimager. Kvantifisere og bakgrunn-trekke radioaktivitet intensiteter på hver probe sted å bruke gratis bilde J programvare oppgradert med et microarray profiler.
- Organisere og behandle data ved hjelp av en elektronisk regneark. Generere varme kart ved hjelp av betinget formatering verktøyet. Representere for eksempel hver probe signal som en brøk (uttrykt i ‰) av totale sonde.
Representative Results
Tre uavhengige biologiske replikerer viser at, under testet vekst betingelser, alle M. smegmatis tRNAs er uttrykt ovenfor bakgrunn nivå (figur 1). I dette bestemte eksperimentet består observerte standardavviket for hver probe mellom 2% (Arg (TCT)) og 22% (Cys (GCA)) med en median på 5% (figur 1). Falske endringer mellom gjentak er betydelig påvirket av faktorer som matrise forberedelse og blanding. Høy reproduserbarhet oppnås gjennom nøye og konsekvent matrise utskrift samt automatisert eksempel hybridisering. Det er en 5-fold forskjell tRNA Ile (GAT) og tRNA (Val (TAC), høyeste og laveste rikelig arten henholdsvis. SPOt viser at uttrykket av tRNA isoacceptors ikke er ensartet. Isoacceptors er arter som holder den samme aminosyren men vise forskjellige anticodon sekvenser og derfor dekode forskjellige kodon på mRNAs. For eksempel alle alanin isoacceptors uttrykkes på lignende nivåer, mens den høyeste og laveste arginin akseptere tRNAs avvike av 3-fold.
Figur 1: Representative tRNA macroarray resultater. (A) skannet bakteriell, musen og menneskelige macroarrays. M. smegmatis benytter bare 43 sonder i stedet for 48 for musen og menneske. Som en konsekvens, viser bakteriell matrisen 40 tomme flekker (sonder kopiert åtte ganger på hver matrise) som blandes med bakgrunnen. De fleste av dem er gruppert i øvre venstre hjørne. (B) Histogram og heatmap representasjoner tRNA profiler i M. smegmatis under optimale forhold. Sonden er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter (inkludert bakterievekst, metabolske merking, utvinning og matrise hybridisering) og uttrykkes per tusen verdiene for totalt tRNAs. Standardavvik for de tre gjentak er angitt som feilfelt og nyanser av oransje på histogram og heatmap henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Beta partikler utslipp er kjent bakteriostatisk og bakteriedrepende agenter14, men stråler i testet området har ingen betydelig innvirkning på celle fitness. Scintillation teller viste at radioaktiviteten er innlemmet i 25% av total-celle ekstrakter og deretter 1% av renset totalt RNAs.
Sonder identisk størrelser, sammenlignbare Smeltetemperaturen og GC innhold, sammen med en ensartet protokoll for macroarray småblødninger, hybridisering og måling gir objektiv måling av tRNA direkte fra spot signaler.
Stedet er reproduserbare og bestemt. Dens stort dynamisk område og lett justerbar terskelen tillater profilering lav rikelig arter, som tRNAs knyttet til polysomes, ved å forlenge matrise eksponering ganger9. Etter den innledende investeringen for nødvendig utstyr gjennomsnitt kjøringen kostnad per utvalg, inkludert forbruksartikler $15 per prøver.
Stedet er gjelder for noen organismer som genom er tilgjengelig for sonden design. Modell organismer som dyrkes i vitro er velegnet for metabolske merking. Som pattedyr genomer koder ofte mange isodecoders (tRNAs som deler samme anticodons men vise små forskjeller i deres kropp sekvenser) må sonder være delvis degenerert å bevare homogen blanding av nært tRNA arter. Til slutt, tilhenger pattedyrceller gir vanligvis lavere mengder totale RNA sammenlignet organismer vokst i suspensjon som M. smegmatis, så kulturer må være vesentlig oppskalert.
Disclosures
Noen interessekonflikt erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en SC INBRE grant fra det nasjonale Institutt for General medisinsk vitenskap - NIH (P20GM103499 til R.G.) og gir CA555536 og CA154664 fra National Cancer Institute P.H.H. Dette programmet ble støttes delvis stipend til College of Charleston fra Howard Hughes Medical Institute gjennom pre college & Undergraduate Science Education Program og tilskudd fra National Center for forskning ressurser (5 P20 RR016461) og National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103499) fra nasjonalt institutter for helse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
| Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
| 96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
| Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
| Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
| Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
| Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
| Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
| Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
| [32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
| 0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
| Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
| Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
| Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
| DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
| UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
| Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
| Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
| Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
| 2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
| Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
| 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
| Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
| 20 X SSC | Lonza | 51205 | |
| SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
| hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
| Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
| 0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |
References
- Emilsson, V., Kurland, C. G. Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli. EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).
- Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences. Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).
- Giegé, R., Jühling, F., Pütz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. Structure of transfer RNAs: similarity and variability. Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).
- Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
- Torres, A. G., Piñeyro, D., Rodríguez-Escribà, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-Léger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level. Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).
- Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Maréchal-Drouard, L. On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes. Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).
- Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing. Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).
- Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels. PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).
- Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases. PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).
- Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression. Cancers. 9 (7), (2017).
- Belanger, A. E., Hatfull, G. F. Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).
- Chan, P. P., Lowe, T. M. GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence. Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).
- Schmidt, C. F. The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli. J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).
