Summary
Мы описываем оригинальной платформе анализ передачи РНК, именем пятно (обтекаемый платформа для наблюдения тРНК). Пятно одновременно измеряет клеточном уровнях всех tRNAs в биологических образцах, только три этапа в менее чем 24 часа.
Abstract
Передача РНК (тРНК) являются обильные короткие некодирующих РНК видов, которые являются как правило 76-90 нуклеотидов в длину. tRNAs непосредственно отвечают за синтез белка, переведя кодонов в мРНК в аминокислотных последовательностей. tRNAs долго считались домоустройства молекулы, которые не имеют функции регулирования. Однако растущее количество доказательств показывает, что клеточном уровнях tRNA колебаться в соответствие различных условий, таких как тип клеток, окружающей среды и стресса. Колебания выражений тРНКГлу непосредственно влияет ген перевод, пользу или подавлять экспрессию конкретных белков. В конечном итоге осмысления динамический синтез белка требует разработки методов способны доставить высококачественные tRNA профилей. Метод, который мы представляем здесь называется место, которое стоит для рационализации платформы для наблюдения тРНК. Пятно состоит из трех этапов, начиная с метаболической маркировки клеточных культур с радиоактивными ортофосфат, следуют Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ извлечение радиоактивных всего РНК и наконец гибридизации на собственных печатных macroarrays. tRNA уровни оцениваются путем количественной оценки интенсивности радиоактивности на каждом месте зонд. В протоколе, представленные здесь мы профиль tRNAs Mycobacterium smegmatis mc2155, непатогенных бактерии часто используется в качестве модельного организма для изучения туберкулеза.
Introduction
Клеточном уровнях tRNA колебаться согласно условий, таких как тип клеток, окружающей среды и стресса1,2,3. Пятно, обтекаемый платформы для наблюдения tRNA, является оригинал, надежный и простой метод, который позволяет быструю и точную количественную оценку уровней передачи РНК в организмах, выращенных в лаборатории.
tRNAs имеют удивительно стабильные вторичной и третичной структуры4. Они также показывают многочисленные модификации post-transcriptional5. Эти функции представляют собой значительные структурные и последовательности заграждения смещения или иногда предотвращение прямых и воспроизводимые tRNA профилирования с использованием стандартных критериев РНК количественная оценка методов6. Исследовательские группы во всем мире были вынуждены развивать творческие, но зачастую запутанной методики оценки клеточном уровнях тРНК. Некоторые из этих методов включают в себя: (1) двумерных электрофоретического разделения метаболически помечены tRNAs в сочетании с методической место назначения Северная помарка1; (2) индивидуальные квантификации по Северной пятно с помощью тщательно стандартизированных радиоактивных ДНК зонды7; (3) после экстракции маркировки с цианиновые флуорохромов следуют microarray анализ3и (4) в vitro зачистки tRNA модификаций с помощью рекомбинантной demodification ферментов в сочетании с обратной транскрипции и последующих высокопроизводительного секвенирования8.
Спот представляет собой простой и оригинальный сочетание двух стандартных и простой подходов: (1) РНК тела маркировки, которая состоит в синтезе, в растущих организмов, радиоактивных всего РНК и macroarrays (2) tRNA, систематической и миниатюрных геномной инструмент оптимизированный для tRNA сегрегации.
Образцы имеют обтекаемую форму из живых организмов к платформе количественной оценки. Они анализируются непосредственно после извлечения и не обрабатывается каких-либо дальнейших, который значительно ограничивает предубеждения, по сравнению с методами, требующих усиления после извлечения или ферментативной обработки. Ролик является универсальным и могут быть легко объединены для фракционирования Полисома для идентификации и количественной оценки tRNA субпопуляций, которые физически связаны с переводом рибосом.
Протокола, представленные здесь оптимизирован для Mycobacterium smegmatis, и она также успешно используется для профиля tRNAs в9 Escherichia coli,10 Saccharomyces cerevisiae, мыши и культурах клеток человека11 .
Protocol
1. Культура и метаболических маркировки
- Совать раз центр колпачок микро стерильные 1.5 мл пробирок с 18-калибровочного иглой позволяет надлежащей аэрации. Прививать 500 мкл дополнениями стерильный 7 ч 9 бульон с 5 мкл м. smegmatis от стартера культура выросли на ночь12.
Примечание: Рецепт один литр 7 ч 9 является отвар: 4,7 г коммерческих 7H 9 порошка, 2 мл глицерина, 1 мл анимации 80, 0,85 г NaCl, 5 г альбумина, 2 г декстрозы, H2O (довести объем до 1 Л).- (Осторожно) После стандартной радиационной практики Спайк культуры СМИ с 20 Μки/мл [32P] Na2HPO4. Рост бактерий при 37 ° C и 1200 об/мин агитации, в шейкер инкубатор, за 9-мм толщиной акриловый щит.
- На midlog этапе (O.D.600 Нм ~ 0,5), передача всей культуры в колпачок 2-мл пробирку и Пелле радиоактивных бактерий при комнатной температуре центрифугированием за 2 мин в 10 000 x g. собирать супернатанта содержащий неинкорпорированных радиоактивных ортофосфата в соответствующий контейнер для отходов.
2. подготовка общего РНК
Примечание: Общая RNAs извлекаются из бактериальных окатышей с использованием коммерческих РНК добыча реагента (содержащего тиоцианат Гуанидиновые, фенола и хлороформа) после производителя протокол.
- Добавьте 1 mL реагента коммерческих РНК добыча и приблизительно 200 мкл стеклянных шариков на пеллеты. Кепи трубка надежно и нарушить бактерий в гомогенизатор для 2 минут при максимальной агитации, (установка номер пять выбранного инструмента (см. Таблицу материалы)).
- Центрифуга образца на 12000 g x 10 мин при 4 ° C. Передача супернатант новый 2-мл пробирку и отбросить бисер надлежащим образом. Добавить 0,2 мл хлороформа и встряхнуть трубки вручную для 15 s. центрифуги на 12000 g x 15 мин при 4 ° C.
- Соберите водной фазе образца в новой трубки, рыбалка трубку под углом 45°. Избегайте рисунок интерфаза или органического слоя. Добавьте 2 мкл цветных осадителя и 0,5 мл 100% изопропиловый спирт. Встряхнуть трубки вручную для 5 s. центрифуги на 12000 g x 10 мин при 4° C.
- Удалить супернатант из трубки и надлежащим образом отбросить как жидкая фракция может содержать следы радиоактивности. Воздух сухой Пелле за 5 мин, затем Ресуспензируйте в 200 мкл 2 X солевой раствор натрия цитрата (SSC), 0,1% (w/v) додецилового сульфата натрия (SDS) окончательный.
Примечание: Состав акций 20 X SSC – 3,0 М NaCl, цитрат натрия 0,3 М, pH 7.0.
3. Подготовка 96 хорошо принтер пластин
Примечание: вручную tRNA microarrays печатаются с сорок две 70-mer ДНК олигонуклеотиды дополнение к 3' конца каждого tRNA м. smegmatis (терминал ОСО исключены) с помощью 8 контактный arrayer. Последовательности ДНК олигонуклеотидных зондов, а также макет зонд в колодец плиты и массив предоставляются (дополнительный файл 1 - лист 1-3 соответственно).
- Дизайн ДНК зондов первый извлечение tRNA последовательностей или tRNA кодирования гены от tRNA баз данных, например геномные tRNA базы данных13. Обрезать сохраняется 3' конец ОАС, если кодировке. Отменить дополнения результирующей последовательности. Порядок зонд на основе первых 70 нуклеотидов.
- Ресуспензируйте сухой ДНК-зондов в воде. Отрегулируйте датчики концентрации до 100 мкм. В 96 хорошо плита готовить 120 мкл 50 мкм oligos в 3 X SSC, 0,01% (w/v) SDS финал (разбавляют 60 мкл запасов зондов в отдельных хорошо с 60 мкл 6 X SSC, 0,01% (w/v) SDS.
- Крышка с фольгой олова для предотвращения испарения или загрязнения, немедленно заморозить и хранить при-20 ° C до тех пор, пока требуется.
4. массив печати
- Оттепель 96-луночных пластины при комнатной температуре (занимает около 20 минут).
- Ярлык Амин покрытием стекла слайды с пером алмаз. Место слайды в индексации блок. Следуйте сетки размещения и сделать следующим образом.
- Тщательно окуните репликатор булавки в скважинах.
- Аккуратно печатайте массив на стеклянных вставках, используя минимальное давление (вы почувствуете небольшое сопротивление). Продолжить печать без очистки arrayer пока не закончил с а. блока
- Когда вы будете готовы перейти к следующему блоку, следуйте описанной ниже процедуры стирки.
- DIP репликатор в отбеливатель 5% и осторожно встряхнуть.
- Пресс репликатора в фильтровальную бумагу.
- Окунуть репликатор в дистиллированной воде, осторожно встряхните и вставьте в документ. Повторите этот шаг один раз.
- Окуните репликатор в изопропаноле, осторожно встряхните и нажмите на бумагу.
- Сухие replicator на вентиляторе около 20 s перед переходом на следующий блок 96-луночных пластины. Продолжать нужное количество отпечатков.
- Разрешить слайды высохнуть затем crosslink oligos на слайд с помощью сшивателя УФ 254 Нм.
- Установите уровень энергии 999,990 µJ/см2.
- Поместите слайды лицом на чистую поверхность в сшивателя. Нажать кнопку «Старт».
- Блокировать массивы на ночь в 450 мл преграждая разрешение на магнитной мешалкой, при комнатной температуре и под медленное возбуждение. Собирать и использовать блокировки решение в четыре раза.
Примечание: Это рецепт для блокирования решения: 125 мм фосфатного буфера (NaH2PO4восстановите2HPO4-) рН 7,2, 2,25% SDS (w/v), 0,5 мм ЭДТА, 0.5 X SSC, 1% BSA (w/v). - Вымойте слайды 2 раза по 5 минут при комнатной температуре в 500 мл дистиллированной воды. Сухие слайды центрифугированием 10 s при комнатной температуре в центрифуге microarray. Массивы, хранить в сухом и темном месте на срок до 6 месяцев.
5. массив гибридизации
- До гибридизации промойте слайды в кипящей воде и высушить центрифугированием (как и 4.6).
- Место массива внутри кассета гибридизации и нагрузки radiolabeled РНК образца.
- Запуск автоматизированных станция гибридизации мойки для максимальной воспроизводимость.
- Программа шаги следующим. Условия прокладки для 2 мин при 75 ° C. Вводить зонд при температуре 60 ° C.
Денатурируйте зондов и образцы 5 минут при 90 ° C. Гибридизируйте образцы 3 часа при температуре 60 ° C.- Мыть слайды при 50 ° C дважды с 2 X SSC, 0,1% (w/v) SDS, поток 10 s и 20 s. мыть слайды при 42 ° C дважды с 0,1 X SSC, 0.1% SDS, поток 10 сек и провести 20 s. мыть слайды при 42 ° C дважды с 0.1 X SSC , поток 10 s и удерживайте 20 s.
- Программа шаги следующим. Условия прокладки для 2 мин при 75 ° C. Вводить зонд при температуре 60 ° C.
- Сухой слайды центрифугированием (как и 4.6).
6. массив количественная оценка
- Оберните слайды с помощью тонкой пластиковой пленкой. Проверьте слайды для радиоактивных сигнала с помощью счетчика Гейгера на его наиболее чувствительных параметр. Разоблачить слайдов на экране хранения люминофора в экспозиции кассеты при комнатной температуре для 10 до 90 часов в зависимости от силы сигнала.
Примечание: Как чувствительность счетчиков Гейгера варьироваться от одного инструмента к другому, время экспозиции должны быть оптимизированы эмпирически. - Сканирование слайдов с разрешением 50 мкм с помощью phosphorimager. Количественно и фон вычитания интенсивности радиоактивности на месте каждый зонд, с помощью бесплатного программного обеспечения изображения J повышен с профилировщиком microarray.
- Организовывать и обрабатывать данные с помощью электронной таблицы. Генерировать тепло карт, используя средство условного форматирования. Представляют собой например каждый сигнал зонда как дробь (выраженный в ‰) всего зонда сигнала.
Representative Results
Три независимых биологического реплицирует показывают, что в условиях испытания роста, все smegmatis м. tRNAs изложенных выше уровень фона (рис. 1). В этой конкретной эксперимента наблюдаемые стандартное отклонение для каждого зонда состоит между 2% (Arg (TCT)) и 22% (Cys (ВКА)), при этом средний показатель в 5% (рис. 1). Ложных изменения между реплицирует значительно зависят от таких факторов, как массив подготовка и гибридизация. Высокая воспроизводимость достигается путем тщательного и последовательного массив печати, а также автоматической выборки гибридизации. Есть 5 раз разница между tRNA Иль (GAT) и тРНК (Валь (TAC), высокие и низкие изобилии видов соответственно. Пятно показывает, что выражение тРНК isoacceptors не является единообразной. Isoacceptors являются виды, которые держат же аминокислоты, но отображать различные антикодон последовательности и поэтому декодирования различных кодонов на мРНК. Например, все isoacceptors аланина выражаются на аналогичных уровнях, тогда как высокие и низкие аргинин, принимая tRNAs отличаются по 3 раза.
Рисунок 1: результаты macroarray представитель tRNA. (A) проверяемых бактериальных, мыши и человеческой macroarrays. М. smegmatis массивы вместо 48 только 43 зонды для человека и мыши. Как следствие бактериальный массив отображает 40 пустые пятна (зонды реплицируются восемь раз на каждый массив), которые сочетаются с фоном. Большинство из них сосредоточены в левом верхнем углу. (B) гистограммы и heatmap представления tRNA профилей в . м. smegmatis в условиях оптимального роста. Зонд сигналы в среднем трех независимых экспериментов (включая рост бактерий, метаболические маркировки, добыча и массив гибридизации) и выражаются в соответствии тысяч значений всего tRNAs. Стандартные отклонения для трех реплицирует обозначаются соответственно как погрешностей и оттенки оранжевого на гистограммы и heatmap. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Бета-частицы выбросов известны бактериостатическое и бактерицидное агентов14, однако излучений в проверенных диапазоне имеют не оказывает значительного влияния на клетки фитнес. Сцинтилляция подсчитывая показал, что радиоактивности включена в 25% всего клеточных экстрактов и впоследствии, 1% очищенного всего РНК.
Зонды одинаковых размеров, сопоставимых температуры плавления и GC содержания, а также единый протокол для macroarray пятнистость, гибридизации и количественная оценка позволяет объективное измерение уровней tRNA непосредственно от места сигналов.
Пятно, воспроизводимые и конкретными. Его большой динамический диапазон и легко регулируемый порог позволяет профилирования низкой обильные видов, таких как tRNAs, связанные с polysomes, просто путем продления массив воздействия раз9. После первоначальных инвестиций для необходимого оборудования стоимость одного образца, включая Расходные материалы, работает в среднем $15 за образцы.
Пятно применима к любой организм, чей геном доступен для Конструкция зонда. Модельные организмы, которые выращиваются в vitro являются идеальными кандидатами для метаболических маркировки. Как млекопитающих геномов часто кодировать многие isodecoders (tRNAs, которые разделяют одинаковые anticodons, но отображать небольшие различия в их тела последовательностей) датчики должны быть частично деградировавшие сохранения однородной гибридизации видов тесного tRNA. Наконец адэрентных клеток млекопитающих урожайности обычно нижнюю всего РНК, по сравнению с организмов, выращенных в подвеска таких м. smegmatis, поэтому культур должны быть существенно повышена.
Disclosures
Конфликта интересов не объявлен.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана SC INBRE грант от национального института Генеральной медицинской науки - низ (P20GM103499 р.г.) и предоставляет CA555536 и CA154664 из Национального института рака P.H.H. Эта программа была поддержана в части Грант Колледж Чарлстон Говард Хьюз медицинский институт через довузовского и Бакалавриат Наука образовательной программы и за счет субсидий из национального центра для исследования ресурсов (5 P20 RR016461) и национального института Генеральной медицинских наук (8 P20 GM103499) от национальных институтов здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
| Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
| 96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
| Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
| Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
| Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
| Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
| Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
| Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
| [32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
| 0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
| Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
| Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
| Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
| DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
| UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
| Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
| Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
| Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
| 2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
| Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
| 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
| Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
| 20 X SSC | Lonza | 51205 | |
| SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
| hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
| Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
| 0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |
References
- Emilsson, V., Kurland, C. G. Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli. EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).
- Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences. Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).
- Giegé, R., Jühling, F., Pütz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. Structure of transfer RNAs: similarity and variability. Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).
- Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
- Torres, A. G., Piñeyro, D., Rodríguez-Escribà, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-Léger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level. Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).
- Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Maréchal-Drouard, L. On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes. Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).
- Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing. Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).
- Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels. PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).
- Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases. PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).
- Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression. Cancers. 9 (7), (2017).
- Belanger, A. E., Hatfull, G. F. Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).
- Chan, P. P., Lowe, T. M. GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence. Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).
- Schmidt, C. F. The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli. J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).
