Summary
Biz orijinal bir transfer RNA analizi platformu nokta (akıcı tRNA gözlemlemek için Platform) adlı tanımlamak. Nokta aynı anda hücresel düzeyde tüm tRNA biyolojik örnekleri, sadece üç adım ve 24 saatten az bir süre ölçer.
Abstract
Transfer RNA (tRNA) genellikle 76-90 nükleotid uzunluğunda olan bol kısa kodlamayan RNA türü bulunmaktadır. tRNA, mRNA içinde kodon amino asit dizileri haline çevirerek protein sentezi için doğrudan sorumludur. tRNA uzun düzenleyici fonksiyonları yoksun ev tutma molekül olarak kabul edildi. Ancak, kanıt büyüyen bir vücudun hücresel tRNA düzeyleri değişen koşullara hücre tipi, çevre ve stres gibi yazışma dalgalanma gösterir. TRNA ifade dalgalanma lehine veya ifade belirli proteinlerin bastırmak gen çeviri, doğrudan etkiler. Sonuçta protein sentezi dinamik kavrama yöntem yüksek kaliteli tRNA profilleri teslim etmek mümkün geliştirme gerektirir. Burada mevcut yöntemi için aerodinamik Platform için gözlem tRNA standları yer almıştır. Hücre kültürleri radyoaktif orthophosphate, radyoaktif toplam RNA'ların guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform çıkarma tarafından takip ile metabolik etiketleme ile başlayan üç adım nokta oluşur ve nihayet hibridizasyon in-house Tarih baskılı macroarrays. tRNA düzeyleri her sonda spot radyoaktivite Koyulukları miktarının tarafından tahmin edilir. Burada sunulan protokolünde Mycobacterium smegmatis mc2' de 155, sık sık bir model organizma tüberküloz çalışırdım nonpathogenic bir bakteri tRNA profil.
Introduction
Hücre tipi, çevre ve stres1,2,3gibi koşullara göre hücresel tRNA seviyeleri dalgalanma. Nokta, tRNA, gözlemlemek için aerodinamik Platform bir özgün, güvenilir ve laboratuvar yetiştirilen organizmalar transfer RNA düzeylerinin hızlı ve hassas miktar sağlar basit tekniği dir.
tRNA son derece kararlı ikincil ve üçüncül yapıları4var. Bunlar da çok sayıda çoğu değişiklikler5görüntüler. Bu özellikler önemli yapısal ve kutuplama ya da bazen doğrudan ve tekrarlanabilir standart kıyaslama RNA miktar teknikleri6kullanarak tRNA profil oluşturma önleyerek sıra yollara barikat temsil eder. Araştırma grupları dünya çapında hücresel tRNA düzeylerini değerlendirmek için yaratıcı ama kez kıvrık teknikleri geliştirmek zorunda kaldılar. Bu yöntemlerden bazıları şunlardır: (1) iki boyutlu elektroforetik ayrımı metabolik olarak etiketli tRNA kombine metodik nokta atama ile Kuzey leke1tarafından; (2) Kuzey tarafından bireysel miktar leke dikkatle standart radyoaktif DNA probları7kullanarak; (3) sonrası ayıklama siyanür fluorochromes ile etiketleme ardından Mikroarray analiz3ve (4) vitro rekombinant demodification enzimler ters transkripsiyon ile kombine ve sonraki kullanarak tRNA değişiklikler sıyırma yüksek işlem hacmi sıralama8.
Basit ve özgün birleşimi iki standart ve basit yaklaşım bir noktadır: organizmalar, radyoaktif toplam RNA'ların ve (2) tRNA macroarrays, sistematik ve kırılan genomik aracı büyüyen sentez, oluşan etiketleme, (1) RNA vücut tRNA ayrımı için en iyi duruma getirilmiş.
Örnekler canlı organizmalar miktar platforma aerodinamik. Onlar doğrudan çıkarma sonra analiz edilir ve önyargıları sonrası ayıklama amplifikasyon veya enzimatik tedavi gerektiren teknikleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde sınırlayan daha fazla işlenen değil. Nokta çok yönlü ve kolayca tanımlamanıza ve ribozomlar çeviri ile fiziksel olarak ilişkili tRNA altgrupları ölçmek için polysome ayırma için kombine edilebilir.
Burada sunulan protokolü Mycobacterium smegmatisiçin optimize edilmiş ve o da başarıyla profil tRNA Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10, fare ve insan hücre kültürleri11 için kullanılan .
Protocol
1. Kültür ve metabolik etiketleme
- Bir kez bir steril 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri kap ortasına doğru havalandırma izin vermek için bir 18'lik iğne ile poke. İlave steril 7 h 9 500 µL aşılamak suyu M. smegmatis 5 µL bir marş--dan ile Kültür yetişkin gece12.
Not: Tarifi için bir 7H 9 litre suyu: 4,7 g ticari 7H 9 tozu, 2 mL gliserol, 1 mL Tween 80, 0,85 g NaCl, 5 g Albumin, 2 g dekstroz, (Toplam hacim 1 M'ye getirmek için) H2O.- (Dikkat) Standart radioprotection yöntemleri 20 µCi/mL [32P] Na2HPO4kültür ortamıyla spike. Bakteri bir 9 mm kalınlığında akrilik kalkanın arkasında yerleştirilen bir shaker kuluçka 37 ° C ve 1200 rpm ajitasyon, büyümek.
- Midlog aşamasında (O.D.600 nm ~ 0.5), tüm kültür 2 mL vida-Kapiler tüp içine aktarmak ve 10.000 x g., 2 dk toplamak için süpernatant içeren unincorporated radyoaktif orthophosphate içinde oda sıcaklığında radyoaktif bakteri centrifuging tarafından cips uygun atık konteyner.
2. Toplam RNA'ların hazırlanması
Not: Toplam RNA'ların (guanidinium thiocyanate, fenol ve kloroform içeren) ticari bir RNA ayıklama reaktif kullanarak bakteriyel çökeltilerini ayıklanır üreticinin protokol sonrası.
- 1 mL ticari RNA ayıklama reaktif ve yaklaşık 200 µL cam boncuk Pelet üzerine ekleyin. Tüp güvenli bir şekilde kap ve bir homogenizer en fazla ajitasyon altında 2 min için bakteriyel bozabilir (beş numaralı seçilen araç üzerinde ayarlama ( Tablo reçetesigörmek)).
- Santrifüj örneği 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika ' Yeni bir 2 mL tüp süpernatant aktarım ve boncuklar uygun şekilde atın. Kloroform 0.2 mL ekleyin ve tüp el ile 12.000 x g de 15 s. santrifüj 4 ° C'de 15 dakika için shake şiddetle
- Sulu faz örnek yeni bir tüp içine tüp 45 ° de olta balıkçılığı toplamak. Interphase veya organik katman çizim kaçının. 2 renkli precipitant µL ve % 100 isopropanol 0.5 mL ekleyin. Tüp el ile 12.000 x g de 5 s. santrifüj 4 ° C'de 10 dakika için shake şiddetle
- Tüm tüpünden süpernatant kaldırmak ve uygun şekilde atın gibi sıvı kesir radyoaktivite izleri içerebilir. 5 min için Kuru Pelet hava sonra 200 µL serum sodyum sitrat (SSC), % 0,1 (w/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) son X 2 resuspend.
Not: Stok 20 bileşimi X SSC 3,0 M NaCl, 0,3 M sodyum sitrat, pH 7,0 olduğunu.
3. 96 iyi yazıcı plakaları hazırlanması
Not: tRNA microarrays el ile kırk iki 70-mer DNA oligonucleotides 3' sonuna bir 8-pin arrayer kullanarak (terminal CCA hariç) her M. smegmatis tRNA tamamlayıcı birlikte yazdırılır. DNA Oligonükleotid probları yanı sıra iyi plaka ve dizi sonda düzende dizilerini sağlanır (ek dosya 1 - sayfa 1-3 sırasıyla).
- Tasarım DNA ilk alınırken tRNA dizileri veya genomik tRNA gibi tRNA veritabanlarındaki tRNA kodlama genler tarafından veritabanı13sondalar. Söve korunmuş 3' ucu kodladıysanız CCA. Tamamlayıcı elde edilen sıra ters. Sipariş sonda üzerinde ilk 70 nükleotit dayalı.
- Kuru DNA probları suda resuspend. Probları konsantrasyon 100 µM için ayarlayın. 96 bir şey-tabak içinde 3 X SSC, %0.01 (w/v) SDS final (seyreltik 60 µL bireysel iyi hisse senedi probları,-ile 6 X SSC'yi destek veriyor, %0.01 (w/v) SDS 60 µL. 50 µM oligos 120 µL hazırlamak
- Plaka folyo buharlaşma veya kontaminasyonu önlemek, hemen donma ve -20 ° C de ihtiyaç kadar tutmak için kapağı.
4. dizi yazdırma
- 96-şey plaka (yaklaşık 20 dakika sürer) oda sıcaklığında erimek.
- Amin kaplı cam slaytlar bir elmas kalemi ile etiketleyin. Slaytlar dizin oluşturma birim içine yerleştirin. Kılavuz yerleşimler izleyin ve aşağıdaki gibi yapın.
- Dikkatle Wells Çoğalıcı iğne batır.
- Yavaşça dizi en az basınç (küçük bir direnç hissedeceksiniz) kullanarak cam slaytlarda yazdırın. Blok a ile bitene arrayer temizlemeden yazdırmaya devam etmek
- Hazır olduğunuzda sonraki bloğa geçmek, aşağıda açıklanan çamaşır yordamı izleyin.
- Çoğalıcı %5 çamaşır suyu daldırma ve hafifçe çalkalanır.
- Çoğalıcı emici kağıt basın.
- Çoğalıcı distile su içinde daldırma, yavaşça sallayın ve kağıt basın. Bir kez bu adımı yineleyin.
- Çoğalıcı isopropanol içinde daldırma, yavaşça sallayın ve kağıt basın.
- Çoğalıcı yaklaşık 20 için fan üzerinde kuru s 96-şey plaka sonraki bloğuna geçmeden. Parmak izi istediğiniz sayıya devam.
- Slaytların crosslink oligos 254-nm UV crosslinker kullanarak slayt için Kuru izin.
- Enerji seviyesi 999,990 µJ/cm2olarak ayarlayın.
- Crosslinker temiz bir yüzey üzerinde slaytlar yüz koy. "Başlat" tuşuna basın.
- Bir manyetik karıştırıcı, oda sıcaklığında ve yavaş ajitasyon altında çözüm engelleme 450 mL gecede dizide engelleyin. Toplamak ve dört kat engelleme çözüm yeniden.
Not: Engelleme çözüm için reçetedir: 125 mM fosfat tampon (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, %2.25 SDS (w/v), 0,5 mM EDTA, 0.5 X SSC, % 1 BSA (w/v). - 500 mL distile su içinde oda sıcaklığında 2 kez 5 min için slaytlar yıkayın. Slaytlar için 10 centrifuging tarafından kuru s Mikroarray santrifüj oda sıcaklığında. Mağaza diziler için 6 aya kadar kuru ve karanlık bir yerde.
5. dizi hibridizasyon
- Hibridizasyon için önceden slaytlar kaynar suda yıkayın ve tarafından Santrifüjü (4.6) olduğu gibi kuru.
- Dizi içinde hibridizasyon kaset yerleştirin ve radiolabeled RNA örnek yükleyin.
- Otomatik hibridizasyon yıkama istasyonu maksimum tekrarlanabilirlik için çalıştırın.
- Program aşağıdaki adımlardan. 75 ° C'de 2 min için koşul contalar 60 ° C'de sonda tanıtmak
Sonda ve örnekleri 5 dk 90 ° C'de denatüre 60 ° C'de 3 h için örnekleri melezlemek- Slaytları 2 X SSC, % 0,1 (w/v) SDS, akış 10 s ile iki kez 50 ° C'de yıkama ve 20 s. 0.1 X SSC, % 0,1 SDS, akış 10 s ile iki kez 42 ° C'de yıkama slaytlar ve iki kez 0.1 ile 42 ° C'de 20 s. yıkama slaytlar tutun tutun X SSC , akış 10 s ve tutun 20 s.
- Program aşağıdaki adımlardan. 75 ° C'de 2 min için koşul contalar 60 ° C'de sonda tanıtmak
- Kuru slayt Santrifüjü (olduğu gibi 4.6) tarafından.
6. dizi miktar
- İnce bir plastik film kullanarak slaytları sarın. Bir gayger sayacı onun en hassas ayarı kullanarak radyoaktif sinyali slaytlarını denetleyin. Slaytlar bir pozlama kaset, oda sıcaklığında 10-90 h bağlı olarak sinyal gücü için bir depolama fosfor ekrana maruz.
Not: Geiger sayaçları duyarlılığını farklı olarak bir enstrüman diğerine, pozlama süreleri ampirik olarak optimize edilmiş olması gerekir. - Slayt bir phosphorimager kullanarak 50 µm çözünürlükte tarama. Ölçmek ve radyoaktivite Koyulukları Mikroarray profiler ile yükseltilmiş ücretsiz görüntü J yazılımını kullanarak her sonda spot arka plan çıkarma.
- Düzenleyebilir ve bir elektronik tablo kullanarak verileri işlemek. Koşullu biçimlendirme aracını kullanarak ısı haritaları oluşturmak. Örneğin her sonda sinyal (‰ ifade edilir) bir kesir olarak toplam sonda sinyalinin temsil eder.
Representative Results
Üç bağımsız biyolojik, test büyüme koşullarda tüm M. smegmatis tRNA arka plan seviyesinden (şekil 1) ifade edilir göstermek çoğaltır. Belirli bu deneyde %2 (Arg (TCT)) ve medyan (şekil 1) % 5 ile % 22 oranında (Cys (GCA)) arasında gözlenen standart sapma her sonda için oluşur. Yanlış değişiklikleri çoğaltır arasında önemli ölçüde dizi hazırlık ve hibridizasyon gibi faktörlerden etkilenmektedir. Gibi örnek hibridizasyon otomatik yüksek tekrarlanabilirlik dikkatli ve tutarlı dizi baskı yoluyla elde edilir. TRNA arasında 5-fold fark Ile (GAT) ve tRNA (Val (TAC), en yüksek ve en düşük bol türler anılan sıraya göre. Nokta tRNA isoacceptors ifade tek tip olmadığını gösteriyor. Isoacceptors aynı amino asit tutun ancak farklı antikodon sıralarını görüntülemek ve bu nedenle farklı kodon mRNA'ların üzerinde kod çözme türü bulunmaktadır. Örneğin, tüm alanin isoacceptors benzer düzeyde ise ifade edilir kabul tRNA farklı tarafından 3-fold en yüksek ve en düşük arginin.
Şekil 1: temsilcisi tRNA macroarray sonuçları. (A) taranan bakteriyel, fare ve insan macroarrays. M. smegmatis diziler sadece 43 Probe prob 48 yerine fare ve insan için kullanın. Sonuç olarak, bakteriyel dizi arka plan ile Harman (probları her dizi üzerinde sekiz kez yinelenir) 40 boş noktalar görüntüler. Bunların çoğu sol üst köşesinde kümelenir. (B) çubuk grafik ve heatmap temsilleri M. smegmatis tRNA profillerinde optimal büyüme koşullar altında. Sonda sinyalleri üç bağımsız deneyler (dahil Bakteriyel büyüme, metabolik etiketleme, ayıklama ve dizi hibridizasyon) ortalama ve toplam tRNA bin değerleri başı olarak ifade edilir. Üç çoğaltır için standart sapmalar hata çubukları ve çubuk grafik ve heatmap turuncu tonları olarak sırasıyla belirtilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Ürünü test aralığındaki hücre fitness üzerinde önemli etkisi yoktur ancak beta parçacık emisyonları bakteriyostatik ve bakteri yok edici ajanlar14, bilinir. Mercek sayma radyoaktivite toplam-hücre özleri % 25'i ve daha sonra saf toplam RNA'ların % 1'i dahil gösterdi.
Probları aynı boyutlarda, karşılaştırılabilir erime sıcaklığı ve GC içeriğiyle macroarray lekelenme için Tekdüzen bir protokol hibridizasyon ve miktar tarafsız tRNA düzeylerinden spot sinyalleri doğrudan ölçümü için sağlar.
Tekrarlanabilir ve belirli bir noktadır. Onun geniş dinamik alan ve kolayca ayarlanabilir eşiği düşük gibi bol türlerin, sadece dizi pozlama kez9uzatan tarafından polizomlar ile ilişkili tRNA profil oluşturma sağlar. Sonra ilk yatırım için gerekli ekipman, sarf malzemeleri, dahil olmak üzere örnek maliyet çalışan $15-de örnekleri ortalamasını alır.
Nokta olan genom araştırma tasarımı için kullanılabilir herhangi bir organizma için geçerlidir. Vitro yetiştirilmektedir model organizmalar metabolik etiketleme için ideal aday olur. Memeli genleri genellikle birçok isodecoders (tRNA aynı anticodons paylaşmak, ancak onların vücut sekanslarında küçük farklılıklar görüntülemek) kodlamak gibi probları yakın tRNA türler homojen hibridizasyon korumak için kısmen dejenere olması gerekir. Son olarak, yapisan memeli hücreleri toplam RNA kültürleri önemli ölçüde ölçeklendirilmesi gereken süspansiyon gibi M. smegmatis, sonrasını organizmalar göre genellikle daha düşük miktarlarda verim.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu eser desteklenen bir SC INBRE hibe--dan Ulusal Enstitüsü genel tıp bilim - NIH (RG P20GM103499) ve CA555536 & CA154664 P.H.H. için Ulusal Kanser Enstitüsü'nden verir Bu program kısmen araştırma kaynakları (5 P20 RR016461) Howard Hughes tıp Enstitüsü öncesi üniversite ve lisans bilim eğitim programı aracılığıyla Charleston Koleji için bir hibe ve hibe Milli Merkezi tarafından desteklenen yapıldı. ve Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (8 P20 GM103499) ulusal sağlık Enstitüleri üzerinden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
| Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
| 96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
| Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
| Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
| Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
| Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
| Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
| Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
| [32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
| 0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
| Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
| Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
| Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
| DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
| UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
| Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
| Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
| Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
| 2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
| Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
| 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
| Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
| 20 X SSC | Lonza | 51205 | |
| SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
| hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
| Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
| 0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |
References
- Emilsson, V., Kurland, C. G. Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli. EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).
- Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences. Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).
- Giegé, R., Jühling, F., Pütz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. Structure of transfer RNAs: similarity and variability. Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).
- Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
- Torres, A. G., Piñeyro, D., Rodríguez-Escribà, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-Léger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level. Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).
- Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Maréchal-Drouard, L. On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes. Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).
- Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing. Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).
- Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels. PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).
- Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases. PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).
- Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression. Cancers. 9 (7), (2017).
- Belanger, A. E., Hatfull, G. F. Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).
- Chan, P. P., Lowe, T. M. GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence. Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).
- Schmidt, C. F. The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli. J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).
