Summary
Descriviamo un'originale piattaforma di analisi del RNA di trasferimento denominata SPOt (snella piattaforma per l'osservazione del tRNA). Punto misura contemporaneamente i livelli cellulari di tutti i tRNAs nei campioni biologici, in solo tre passi e in meno di 24 ore.
Abstract
RNA transfer (tRNA) sono abbondanti breve non codificanti RNA specie che sono in genere da 76 a 90 nucleotidi di lunghezza. tRNAs sono direttamente responsabili per la sintesi proteica, traducendo i codoni del mRNA in sequenze dell'amminoacido. tRNAs lungo sono stati considerati come molecole di mantenimento della casa che mancava funzioni di regolamentazione. Tuttavia, un corpo crescente di prova indica che i livelli cellulari di tRNA fluttuano in corrispondenza di condizioni variabili come il tipo di cella, l'ambiente e lo stress. La fluttuazione dell'espressione di tRNA condiziona direttamente la traduzione genica, favorendo o reprimere l'espressione delle proteine particolari. In ultima analisi, comprendere la dinamica della sintesi proteica richiede lo sviluppo di metodi in grado di fornire profili di tRNA di alta qualità. Il metodo che presentiamo qui è denominato SPOt, che sta per piattaforma semplificata per Observing tRNA. SPOt è costituito da tre passaggi a partire con l'etichettatura metabolica delle colture cellulari con ortofosfato radioattivo, seguita da guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio estrazione di RNA totale radioattivo e infine l'ibridazione su in-House stampati macroarrays. livelli di tRNA sono stimati di quantificare l'intensità di radioattività ad ogni spot di sonda. In protocollo presentato qui noi profilo tRNAs Mycobacterium smegmatis mc2155, un batterio non patogeno, spesso usato come organismo modello per studiare la tubercolosi.
Introduction
I livelli cellulari di tRNA fluttuano secondo condizioni come tipo di cella, ambiente e stress1,2,3. SPOt, snella piattaforma per l'osservazione di tRNA, è un originale, affidabile e semplice tecnica che permette la rapida e precisa quantificazione dei livelli di RNA di trasferimento negli organismi coltivate in laboratorio.
tRNAs hanno notevolmente stabili strutture secondarie e terziarie4. Essi mostrano anche numerose modificazioni post-trascrizionali5. Queste caratteristiche rappresentano strutturali significativi e blocchi stradali di sequenza polarizzazione o a volte impedire diretto e riproducibile tRNA profilatura mediante benchmark standard RNA quantificazione tecniche6. Gruppi di ricerca nel mondo sono stati costretti a sviluppare tecniche creative ma spesso contorte per valutare i livelli cellulari di tRNA. Alcuni di questi metodi includono: (1) separazione elettroforetica bidimensionale di metabolicamente con etichetta tRNAs combinato con assegnazione posto metodico di Northern blot1; (2) i singoli quantificazione mediante Northern blot utilizzando sonde DNA radioattivo accuratamente standardizzate7; (3) post-estrazione etichettatura con fluorocromi cianina seguita da microarray analysis3e (4) in vitro stripping di modifiche di tRNA utilizzando enzimi ricombinanti demodification combinati con trascrizione d'inversione e successivi sequenziamento High8.
SPOt è una combinazione semplice e originale di due approcci standard e semplice: corpo (1) RNA etichettatura, che consiste nella sintesi, nella coltivazione di organismi, di RNA totale radioattivo e (2) tRNA macroarrays, strumento di genomico sistematico e miniaturizzato ottimizzato per la segregazione di tRNA.
I campioni sono semplificati da organismi viventi per la piattaforma di quantificazione. Essi sono analizzati direttamente dopo l'estrazione e non elaborato qualsiasi ulteriore che limita notevolmente le distorsioni rispetto alle tecniche che richiedono l'amplificazione dell'alberino-estrazione o trattamenti enzimatici. SPOt è versatile e può essere facilmente combinato al frazionamento polisoma per identificare e quantificare le sottopopolazioni di tRNA che sono fisicamente associate con la traduzione di ribosomi.
Il protocollo presentato qui è ottimizzato per Mycobacterium smegmatis, ed è stato usato con successo anche per profilo tRNAs9 Escherichia coli,10 Saccharomyces cerevisiae, mouse e colture di cellule umane11 .
Protocol
1. la cultura e l'etichettatura metabolica
- Una volta colpire il centro del tappo di un tubi micro-centrifuga sterili da 1,5 mL con un ago calibro 18 per consentire adeguata aerazione. Inoculare 500 µ l di completati sterile 7h 9 brodo con 5 µ l di M. smegmatis da un antipasto cultura cresciuti durante la notte12.
Nota: La ricetta per un litro di 7h 9 brodo è: 4,7 g commerciale 7h 9 polvere, 2 mL di glicerolo, 1 mL di Tween 80, 0,85 g NaCl, 5 g di albumina, 2 g di destrosio, H2O (per portare il volume totale di 1 L).- (Attenzione) In seguito le pratiche standard di radioprotezione, spike i terreni di coltura con 20 µ ci/mL di [32P] Na2HPO4. Crescere i batteri a 37 ° C e 1.200 giri/min agitazione, in un incubatore agitatore posizionato dietro uno scudo di acrilico spesso 9 mm.
- Fase di midlog (O.D.600 nm ~ 0,5), trasferire tutta la cultura in una provetta da 2 mL con tappo a vite e pellet radioattivi batteri a temperatura ambiente mediante centrifugazione per 2 min a 10.000 x g. raccogliere il surnatante contenente ortofosfato radioattivo non incorporata nel apposito contenitore per rifiuti.
2. preparazione di RNA totale
Nota: Il RNA totale è estratte dal pellet batterica utilizzando un reagente di estrazione RNA commerciale (contenente tiocianato di guanidinium, fenolo e cloroformio) seguendo il protocollo del produttore.
- Aggiungere 1 mL di reagente di estrazione RNA commerciali e circa 200 µ l di perline di vetro sul pellet. Tappare bene il tubo e perturbare il batterico in un omogeneizzatore per 2 min sotto massima agitazione, (impostazione numero cinque su strumento prescelto (Vedi la Tabella materiali)).
- Campione di centrifuga a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una provetta 2 mL nuova e scartare le perline in modo appropriato. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio e agitare vigorosamente tubo per 15 s. Centrifugare a 12.000 x g per 15 min a 4 ° C.
- Raccogliere la fase acquosa del campione in una provetta nuova di pesca il tubo a 45°. Evitare di trarre qualsiasi interfase o strato organico. Aggiungere 2 µ l di precipitante colorate e 0,5 mL di isopropanolo 100%. Agitare vigorosamente la provetta per 5 s. Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4° C.
- Rimuovere il surnatante dal tubo e scartare in modo appropriato come la frazione liquida può contenere tracce di radioattività. Aria secca pellet per 5 min poi risospendere in 200 µ l di soluzione salina-sodio citrato (SSC), 0,1% (p/v) sodio dodecil solfato (SDS) finale: 2x.
Nota: La composizione dello stock 20 X SSC è 3,0 M di NaCl, citrato di sodio 0,3 M, pH 7.0.
3. preparazione delle piastre di stampante ben 96
Nota: tRNA microarrays manualmente vengono stampati con quaranta due 70-mer oligonucleotides del DNA complementare all'estremità 3' di ogni tRNA M. smegmatis (CCA terminal esclusi) utilizzando un arrayer otto poli. Sono disponibili le sequenze delle sonde del oligonucleotide di DNA così come il layout di sonda nel pozzo-piastra e la matrice (File supplementari 1 - foglio 1 di 3 rispettivamente).
- Sonde di DNA di progettazione di primo recupero tRNA sequenze o geni codificanti tRNA dal database di tRNA quali il tRNA Genomic Database13. Trim conservato 3' estremità CCA se codificato. Complemento inverso la sequenza risultante. Sonda di ordine basato sui primi 70 nucleotidi.
- Risospendere le che sonde di DNA secco in acqua. Regolare la concentrazione di sonde a 100 µM. A 96 pozzetti, preparare 120 µ l di 50 µM oligos in 3 X SSC, finale di 0,01% (p/v) SDS (diluire 60 µ l di sonde stock in singoli bene con 60 µ l di 6 X SSC, 0,01% (p/v) SDS.
- Coprire la piastra con carta stagnola per evitare evaporazione o contaminazione, congelare immediatamente e conservare a-20 ° C fino a quando necessario.
4. stampa array
- Scongelare la piastra a 96 pozzetti a temperatura ambiente (dura circa 20 min).
- Etichettare i vetrini di vetro rivestite con ammina con una penna di diamante. Mettere i vetrini in unità di indicizzazione. Segui i posizionamenti di griglia e procedere come segue.
- Attentamente e immergere i perni replicator nei pozzetti.
- Stampare delicatamente la matrice sulle lastre di vetro, utilizzando una pressione minima (vi sentirete una piccola resistenza). Continuare a stampare senza pulizia arrayer fino al termine con blocco A.
- Quando si è pronti per passare al blocco successivo, seguire la procedura di lavaggio descritta di seguito.
- Immergere replicator in 5% candeggina e agitare delicatamente.
- Replicatore di stampa in carta assorbente.
- Immergere replicator in acqua distillata, agitare delicatamente e premere in carta. Ripetere questo passaggio una volta.
- Immergere replicator in isopropanolo, agitare delicatamente e premere nella carta.
- Asciugare il replicatore sulla ventola per circa 20 s prima di passare al blocco successivo della piastra 96 pozzetti. Proseguire fino al numero desiderato di stampe.
- Lasciare i vetrini asciugare quindi crosslink oligos alla diapositiva utilizzando un reticolante UV 254 nm.
- Impostare il livello di energia a 999.990 µ j/cm2.
- Mettere il volto di diapositive su una superficie pulita nel reticolante. Premere il tasto "start".
- Bloccare le matrici pernottamento in 450 mL di soluzione su un agitatore magnetico, a temperatura ambiente e sotto lenta agitazione di blocco. Raccogliere e riutilizzare la soluzione bloccante fino a quattro volte.
Nota: La ricetta per la soluzione bloccante è: 125 mM di tampone fosfato (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2,25% SDS (w/v), 0,5 mM EDTA, 0,5 X SSC, BSA 1% (p/v). - Lavare i vetrini 2 volte per 5 min a temperatura ambiente in 500 mL di acqua distillata. Asciugare i vetrini mediante centrifugazione per 10 s a temperatura ambiente in una centrifuga di microarray. Archivio matrici in un luogo asciutto e buio fino a 6 mesi.
5. ibridazione
- Prima di ibridazione sciacquare i vetrini in acqua bollente e asciugare mediante centrifugazione (come in 4,6).
- Inserire la matrice all'interno di una cassetta di ibridazione e caricare un esempio di RNA radioattivo.
- Eseguire la stazione di ibridazione-lavaggio automatica per la massima riproducibilità.
- Passi di programma come segue. Guarnizioni di condizione per 2 min a 75 ° C. Introdurre la sonda a 60 ° C.
Denaturare sonde e campioni 5 min a 90 ° C. Ibridare campioni per 3 h a 60 ° C.- Lavare i vetrini a 50 ° C due volte con 2 X SSC, 0,1% (p/v) SDS, flusso 10 s e tenere 20 s. lavare a 42 ° C due volte con 0.1 X SSC, 0.1% SDS, flusso 10 s e tenere 20 s. lavaggio vetrini a 42 ° C due volte con 0,1 X SSC , portata 10 s e tenere premuto 20 s.
- Passi di programma come segue. Guarnizioni di condizione per 2 min a 75 ° C. Introdurre la sonda a 60 ° C.
- A secco di diapositive mediante centrifugazione (come in 4,6).
6. quantificazione di matrice
- Avvolgere le diapositive utilizzando una sottile pellicola di plastica. Verifica diapositive per segnale radioattivo utilizzando un contatore di Geiger sulla sua impostazione più sensibile. Esporre le diapositive su uno schermo al fosforo di deposito in una cassetta di esposizione a temperatura ambiente per 10 a 90 h a seconda della potenza del segnale.
Nota: Come sensibilità di contatori Geiger variano da uno strumento a altro, tempi di esposizione devono essere ottimizzati empiricamente. - Scansione di diapositive a 50 µm risoluzione utilizzando un phosphorimager. Quantificare e sfondo-sottrarre intensità di radioattività ad ogni spot della sonda utilizzando il software gratuito Image J aggiornato con un profiler di microarray.
- Organizzare ed elaborare i dati utilizzando un foglio di calcolo elettronico. Generare mappe di calore utilizzando lo strumento di formattazione condizionale. Ad esempio rappresentare ogni segnale di sonda come una frazione (espressa in ‰) del segnale sonda totale.
Representative Results
Tre biologico indipendente replica spettacolo che, sotto le condizioni di crescita testati, tutte le M. smegmatis tRNAs sono espressi sul livello sfondo (Figura 1). In questo particolare esperimento, la deviazione standard osservata per ogni sonda è compreso tra il 2% (Arg (TCT)) e il 22% (Cys (GCA)) con una mediana al 5% (Figura 1). False le modifiche tra repliche sono significativamente influenzate da fattori quali la preparazione della matrice e l'ibridazione. Alta riproducibilità è raggiunto attraverso la stampa di matrice accurato e coerente così come automatizzato l'ibridazione del campione. C'è una differenza di 5 volte tra il tRNA Ile (GAT) e tRNA (Val (TAC), la specie più alta e più basso abbondante rispettivamente. SPOt Mostra che l'espressione di tRNA isoacceptors non è uniforme. Isoacceptors sono specie che tenere lo stesso amminoacido ma visualizzare sequenze anticodone diverso e quindi decodificare diversi codoni su mRNA. Per esempio, tutti i isoacceptors di alanina sono espressi a livelli simili, considerando che l'arginina più alto e più basso accettante tRNAs differiscono per 3 volte.
Figura 1: risultati macroarray rappresentante tRNA. (A) Scanned batterico, mouse e macroarrays umano. M. smegmatis matrici utilizzano soltanto 43 sonde anziché 48 per mouse e umani. Di conseguenza, la matrice batterica Visualizza 40 punti vuoti (sonde vengono replicati otto volte su ogni matrice) che si fondono con lo sfondo. La maggior parte di loro sono raggruppata in alto a sinistra. (B) istogramma e heatmap Rappresentanze di profili di tRNA in M. smegmatis sotto condizioni di crescita ottimali. Segnali sonda sono la media di tre esperimenti indipendenti (tra cui la crescita batterica, etichettatura metabolica, ibridazione estrazione e matrice) e sono espressi secondo mille valori di tRNAs totale. Deviazioni standard per le tre repliche sono indicate, rispettivamente, come barre di errore e tonalità di arancio sull'istogramma e heatmap. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Le emissioni di particelle beta sono noti agenti batteriostatici e battericidi14, tuttavia radiazioni nella gamma testata non hanno alcun impatto significativo sull'adeguatezza della cella. Conteggio delle scintillazioni ha mostrato che la radioattività è incorporata nel 25% del totale-cella estratti e successivamente, l'1% di RNA totale purificato.
Delle sonde identiche dimensioni, temperatura di fusione comparabile e contenuto di GC, insieme a un protocollo uniforme per macroarray spotting, ibridazione e quantificazione permette imparziale misura dei livelli di tRNA direttamente dai segnali spot.
SPOt è riproducibile e specifici. Sua grande gamma dinamica e la soglia facilmente regolabile permette di profilatura basso specie abbondanti, come tRNAs associato polisomi, semplicemente prolungando la matrice esposizione volte9. Dopo l'investimento iniziale per l'attrezzatura necessaria, il costo per campione, compresi materiali di consumo, di funzionamento media $15 a campioni.
SPOt è applicabile a qualsiasi organismo cui genoma è disponibile per il design della sonda. Organismi di modello che vengono coltivati in vitro sono candidati ideali per l'etichettatura metabolica. Come il genoma di mammiferi spesso codifica molti isodecoders (tRNAs che condividono identici anticodoni ma visualizzare piccole differenze nelle loro sequenze di corpo) sonde devono essere parzialmente degenerati per mantenere omogenea ibridazione delle specie di tRNA stretta. Infine, le cellule di mammiferi aderente producono in genere minori quantità di RNA totale rispetto agli organismi coltivati in sospensione come M. smegmatis, quindi le colture devono essere sostanzialmente scalato.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un grant SC INBRE dal National Institute of General Medical Science - NIH (P20GM103499 di R.G.) e concede CA555536 & CA154664 dal National Cancer Institute a P.H.H. Questo programma è stato sostenuto in parte da una sovvenzione per il College of Charleston l'Howard Hughes Medical Institute attraverso il pre-college & programma di educazione scientifica dello studente non laureato e da sovvenzioni dal centro nazionale per ricerca risorse (5 P20 RR016461) e il National Institute of General Medical Sciences (P20 8 GM103499) da istituti nazionali di salute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
| Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
| 96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
| Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
| Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
| Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
| Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
| Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
| Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
| [32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
| 0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
| Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
| Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
| Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
| DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
| UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
| Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
| Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
| Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
| 2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
| Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
| 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
| Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
| 20 X SSC | Lonza | 51205 | |
| SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
| hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
| Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
| 0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |
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