Summary
Describimos a una plataforma de análisis de ARN de transferencia original llamada SPOt (plataforma optimizada para la observación de tRNA). Lugar simultáneamente mide los niveles celulares de todos los tRNAs en muestras biológicas, en sólo tres pasos y en menos de 24 horas.
Abstract
RNAs de transferencia (tRNA) son cortos no codificante del RNA especies abundantes que son típicamente de 76 a 90 nucleótidos de longitud. tRNAs son directamente responsables de la síntesis de proteínas por traducción de codones en el ARNm en secuencias del aminoácido. tRNAs durante mucho tiempo fueron considerados como moléculas de mantenimiento de la casa que carecían de funciones reguladoras. Sin embargo, un creciente cuerpo de evidencia indica que los niveles celulares de tRNA fluctúan en correspondencia a las condiciones variables tales como tipo de la célula, medio ambiente y el estrés. La fluctuación de la expresión de tRNA influye directamente en traducción de gene, favorece o reprime la expresión de proteínas particulares. En última instancia, comprender la dinámica de la síntesis de proteínas requiere el desarrollo de métodos capaces de ofrecer perfiles de tRNA de alta calidad. El método que presentamos aquí se llama SPOt, acrónimo de plataforma optimizada para el tRNA de la observación. Terreno consta de tres pasos a partir de etiquetado metabólico de cultivos celulares con ortofosfato radiactivo, seguido por la extracción de guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo de RNAs totales radiactivos y finalmente hibridación en el propio impreso macroarrays. se estiman que los niveles de tRNA mediante la cuantificación de las intensidades de la radiactividad en cada punto de la sonda. En el protocolo presentado aquí perfilamos tRNAs en Mycobacterium smegmatis mc2155, una bacteria no patógena de uso frecuente como un organismo modelo para el estudio de la tuberculosis.
Introduction
Niveles celulares de tRNA fluctúan según las condiciones como el tipo de la célula, medio ambiente y estrés1,2,3. Lugar, plataforma optimizada para la observación de tRNA, es original, confiable y sencilla técnica que permite la cuantificación rápida y precisa de los niveles de ARN de transferencia en organismos de laboratorio-crecido.
tRNAs tienen estructuras secundarias y terciarias notablemente estable4. También mostrarán numerosas modificaciones post-transcripcionales5. Estas características representan estructural significativo y obstáculos de la secuencia de polarización o prevenir a veces directo y reproducible tRNA perfiles de uso de técnicas de cuantificación de RNA de referencia estándar6. Grupos de investigación alrededor del mundo se vieron obligados a desarrollar técnicas creativas pero a menudo enrevesadas para evaluar los niveles celulares de tRNA. Algunos de estos métodos incluyen: (1) separación electroforética bidimensional de tRNAs metabólicamente etiquetado combinado con asignación punto metódico por Northern blot1; (2) cuantificación individual por Northern blot usando cuidadosamente estandarizada radiactivo DNA sondas7; (3) post extracción etiquetado con fluorocromos de Cianina seguido por análisis de microarray3y (4) en vitro de modificaciones de tRNA mediante enzimas recombinantes demodification combinadas con la reversa de la transcripción y posterior secuenciación de alto rendimiento8.
Es una sencilla y original combinación de dos enfoques estándar y sencillos: cuerpo (1) RNA de etiquetado, que consiste en la síntesis, en el cultivo de organismos, de RNAs totales radiactivos y macroarrays tRNA (2), una herramienta genómica sistemática y miniaturizada optimizado para segregación de tRNA.
Las muestras son racionalizadas de organismos vivos a la plataforma de cuantificación. Se analizan directamente después de la extracción y procesado no más lejos que limita significativamente los prejuicios frente a técnicas que requieran amplificación post extracción o tratamientos enzimáticos. Es versátil y se puede combinar fácilmente a fraccionamiento polysome para identificar y cuantificar las subpoblaciones de tRNA físicamente asociados con la traducción de los ribosomas.
El protocolo presentado aquí está optimizado para Mycobacterium smegmatis, y fue utilizado también con éxito a perfil tRNAs en Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10, ratón y células humanas culturas11 .
Protocol
1. la cultura y el etiquetado metabólico
- Pincha una vez el centro de la tapa de a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estéril con una aguja de calibre 18 para permitir la aireación adecuada. 500 μl de suplido estéril 7H 9 de inocular caldo con 5 μl de M. smegmatis desde un inicio la cultura cultivados durante la noche12.
Nota: La receta para un litro de 7H 9 caldo: 4,7 g comercial 7H 9 en polvo, 2 mL de glicerol, 1 mL de Tween 80, 0,85 g de NaCl, 5 g de albúmina, 2 g de dextrosa, H2O (para llevar el volumen total a 1 L).- (PRECAUCIÓN) Siguiendo las prácticas estándar de radioprotección, spike los medios de cultivo con 20 μCi/mL de [32P] Na2HPO4. Crecer las bacterias a 37 ° C y 1.200 r.p.m. agitación, en un Incubador agitador colocado detrás de un escudo acrílico grueso de 9 mm.
- En fase midlog O.D.600 nm (~ 0,5), transfiera toda la cultura en un tubo de tapón de rosca de 2 mL y pellet radiactivas bacterias a temperatura ambiente por centrifugación por 2 min a 10.000 x g. recoger sobrenadante que contiene ortofosfato radiactivo no incorporada en contenedor de residuos adecuado.
2. preparación de ARN total
Nota: RNAs totales se extraen de los pellets bacterianos usando un reactivo comercial de extracción de RNA (contiene tiocianato de guanidinio, fenol y cloroformo) siguiendo el protocolo del fabricante.
- Añadir 1 mL del reactivo de extracción de RNA comercial y aproximadamente 200 μL de abalorios en la pastilla. Cerrar bien el tubo y perturbar el bacteriano en un homogenizador durante 2 min en agitación máxima, (ajuste número cinco en el instrumento elegido (véase la Tabla de materiales)).
- Muestra de centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 2 mL y desechar apropiadamente los granos. Añadir 0,2 mL de cloroformo y agite el tubo vigorosamente a mano por 15 s. Centrifugar a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Recoger la fase acuosa de la muestra en un tubo nuevo de pesca el tubo a 45°. Evitar cualquier interfase o capa orgánica. Añadir 2 μl del precipitado coloreado y 0,5 mL de isopropanol al 100%. Agitar el tubo vigorosamente a mano durante 5 s. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4° C.
- Quite el sobrenadante del tubo y deseche adecuadamente como la fracción líquida puede contener trazas de radiactividad. Aire pellet seco durante 5 minutos y resuspender en 200 μL de 2 X citrato salino-sódico (SSC), 0.1% (p/v) sodio dodecil sulfato (SDS) final.
Nota: La composición de stock 20 X SSC es de 3.0 M de NaCl, citrato de sodio de 0.3 M, pH 7.0.
3. preparación de placas bien impresora 96
Nota: microarrays de tRNA se imprimen manualmente con cuarenta y dos 70-mer oligonucleótidos de ADN complementarios del extremo 3' de cada tRNA de M. smegmatis (terminal CCA excluido) con un arrayer de ocho pines. Se proporcionan las secuencias de las sondas de oligonucleótidos de ADN, así como el diseño de la sonda en la placa de la pozo y el arreglo de discos (archivos complementarios 1 - hoja de 1 a 3 respectivamente).
- Sondas de ADN de diseño por primera recuperar secuencias de ARNt o genes codificación tRNA de bases de datos de tRNA como el tRNA Genomic de la base de datos13. Adorno conservado 3' extremo CCA si codificado. Complemento reverso la secuencia resultante. Sonda de orden basada en los primeros 70 nucleótidos.
- Resuspender las sondas de ADN seco en agua. Ajustar la concentración de sondas a 100 μm. En una placa de 96 pozos, preparar 120 μl de 50 μm oligos en 3 X SSC, 0.01% (p/v) SDS final (diluir 60 μL de sondas comunes en cada pozo con 60 μL de 6 X SSC, 0.01% (p/v) de SDS.
- Cubra la placa con papel aluminio para evitar la evaporación o contaminación, congelar inmediatamente y mantener a-20 ° C hasta que se necesite.
4. impresión de la matriz
- Deshielo de la placa de 96 pocillos a temperatura ambiente (toma aproximadamente 20 minutos).
- Etiqueta de portaobjetos de vidrio recubierto de Amina con una pluma de diamante. Coloque los portaobjetos en la indexación de la unidad. Siga las ubicaciones de red y haga lo siguiente.
- Cuidadosamente sumerja las clavijas replicator en los pozos.
- Suavemente, imprimir la matriz en los portaobjetos de vidrio, con una presion minima (usted sentirá una pequeña resistencia). Continuar imprimiendo sin limpieza a arrayer hasta que termine con el bloque A.
- Cuando esté listo para pasar a la siguiente cuadra, siga el procedimiento de lavado que se describe a continuación.
- DIP de replicator en la lejía 5% y agitar suavemente.
- Duplicador de la prensa en papel absorbente.
- DIP replicador en el agua destilada, agite suavemente y presione en papel. Repita este paso una vez.
- Replicator en isopropanol de la inmersión, sacuda suavemente y presiona en el papel.
- Secar el replicador en el ventilador por unos 20 s antes de pasar a la siguiente cuadra de la placa de 96 pocillos. Continuar hasta el número deseado de copias.
- Deje que los portaobjetos se seque entonces reticulación los oligos a la diapositiva usando un crosslinker UV de 254 nm.
- Establecer el nivel de energía a 999.990 μj/cm2.
- Coloque el portaobjetos hacia arriba sobre una superficie limpia en el crosslinker. Presione "start".
- Bloquear las matrices durante la noche en 450 mL de solución en un agitador magnético, a temperatura ambiente y bajo agitación lenta de bloqueo. Recoger y reutilizar la solución de bloqueo hasta cuatro veces.
Nota: La receta para la solución de bloqueo es: 125 mM de tampón de fosfato (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2.25% SDS (p/v), EDTA 0,5 mM, 0,5 X SSC, BSA 1% (p/v). - Lavar el portaobjetos 2 veces durante 5 min a temperatura ambiente en 500 mL de agua destilada. Secar los portaobjetos por centrifugación durante 10 s a temperatura ambiente en una centrifugadora de microarrays. Tienda de arreglos de discos en un lugar oscuro y seco hasta por 6 meses.
5. hibridación de matriz
- Antes de la hibridación enjuague los portaobjetos en agua hirviendo y seque por centrifugación (como en 4.6).
- Colocar matriz dentro de un cassette de hibridación y carga radiactiva muestra de RNA.
- Ejecutar la estación de hibridación-lavado automatizada para la máxima reproducibilidad.
- Pasos de programa siguiente. Juntas de condición por 2 min a 75 º C. Introducir la punta de prueba a 60 ° C.
Desnaturalizar las puntas de prueba y muestras 5 min a 90 ° C. Hibridar las muestras por 3 h a 60 ° C.- Lavar los portaobjetos a 50 ° C dos veces con 2 X SSC, 0.1% (p/v) de SDS, flujo 10 s y 20 s. lavado diapositivas a 42 ° C dos veces con 0.1 X SSC, 0.1% SDS, flujo 10 s y mantener 20 diapositivas de lavado s. a 42 ° C dos veces con 0,1 X SSC , flujo 10 y espera 20.
- Pasos de programa siguiente. Juntas de condición por 2 min a 75 º C. Introducir la punta de prueba a 60 ° C.
- Diapositivas de seco por centrifugación (como en 4.6).
6. cuantificación de la matriz
- Envuelva el portaobjetos con una película plástica fina. Ver diapositivas de señal radiactiva, usando un contador Geiger en su posición más sensible. Exponer diapositivas en una pantalla de fósforo de almacenamiento en una cinta de exposición a temperatura ambiente durante 10 a 90 h dependiendo de la intensidad de la señal.
Nota: Como sensibilidad de contadores de Geiger varían de un instrumento a otro, tiempos de exposición deben optimizarse empíricamente. - Escanear diapositivas a 50 μm de resolución usando un phosphorimager. Cuantificar y fondo-restar intensidades de radiactividad en cada punto de la punta de prueba usando el software libre de la imagen J con un perfilador de microarrays.
- Organizar y procesar los datos usando una hoja de cálculo electrónica. Generar mapas de calor utilizando la herramienta formato condicional. Representar por ejemplo cada señal de la sonda como una fracción (expresada en ‰) de la señal total de la sonda.
Representative Results
Biológico independiente tres repeticiones muestran que, en las condiciones de crecimiento probado, todos los tRNAs de M. smegmatis se expresan sobre el nivel del fondo (figura 1). En este experimento particular, la desviación estándar observada para cada sonda está compuesta por entre 2% (Arg (TCT)) y 22% (Cys (GCA)) con una mediana de 5% (figura 1). Falsos cambios entre repeticiones son influenciados significativamente por factores como la preparación de la matriz y la hibridación. Alta reproducibilidad se logra a través de impresión de matriz cuidadosa y consistente como automatizado de hibridación de la muestra. Hay una 5-fold diferencia entre el tRNA Ile (TAG) y el tRNA (Val (TAC), la especie más abundante y más alto respectivamente. Lugar muestra que la expresión de isoacceptors tRNA no es uniforme. Isoacceptors son especies que sostienen el mismo aminoácido pero mostrar secuencias de anticodón diferentes y por lo tanto, decodificación diferentes codones en mRNAs. Por ejemplo, todos los isoacceptors de alanina se expresan en niveles similares, mientras que la arginina más alta y más baja aceptación tRNAs diferencian por 3-fold.
Figura 1: resultados de macroarray tRNA representante. (A) escaneada bacteriana, ratón y humano macroarrays. M. smegmatis las matrices utilizan sondas sólo 43 en lugar de 48 para el ratón y humanos. Como consecuencia, la matriz bacteriana muestra 40 puntos vacíos (sondas se replican ocho veces en cada arreglo de discos) que se mezclan con el fondo. La mayoría de ellos está agrupada en la esquina superior izquierda. (B) histograma y heatmap representaciones de perfiles de tRNA en M. smegmatis bajo condiciones de crecimiento óptimo. Las señales de la sonda son el promedio de tres experimentos independientes (incluyendo crecimiento bacteriano, etiquetado metabólico, extracción y matriz de hibridación) y se expresan según mil valores de tRNAs total. Desviación estándar para tres réplicas están indicadas como barras de error y tonos anaranjados en el histograma y el mapa de calor respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Emisiones de partículas beta son conocidas agentes bacteriostáticos y bactericidas14, pero las radiaciones en el rango probado ningún impacto significativo en la aptitud de la célula. Conteo por Cintilación demostró que la radiactividad se incorpora en el 25% de extractos celulares total y posteriormente, el 1% del ARN total purificada.
Las sondas tamaños idénticos, temperatura de fusión comparable y contenido de GC, junto con un protocolo uniforme para macroarray manchado, hibridación y cuantificación permite medición imparcial de niveles de tRNA de señales de lugares.
Punto es reproducible y específica. Su amplio rango dinámico y umbral fácilmente ajustable permite perfiles bajo especies abundantes, como tRNAs asociados a polisomas, simplemente por la prolongación de la matriz de tiempos de exposición9. Después de la inversión inicial para el equipo necesario, el funcionamiento costo por muestra, incluyendo consumibles, un promedio de $15 por muestras.
Punto es aplicable a cualquier organismo cuyo genoma está disponible para el diseño de la sonda. Organismos modelo que se cultivan en vitro son candidatos ideales para el etiquetado metabólico. Como genomas mamíferos codifican a menudo muchos isodecoders (tRNAs que comparten idénticos anticodones pero mostrar pequeñas diferencias en sus secuencias de cuerpo) las puntas de prueba deben ser parcialmente degenerado para preservar la hibridación homogéneo de cerca especies de tRNA. Finalmente, adherentes de células de mamífero producen normalmente menos cantidad de ARN total en comparación con organismos cultivados en suspensión tales como M. smegmatis, culturas necesitar ampliarse sustancialmente.
Disclosures
Ningún conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una subvención de INBRE SC de la National Institute of General Medical Science - NIH (P20GM103499 a R.G.) y CA555536 y CA154664 del Instituto Nacional del cáncer a P.H.H. Este programa fue apoyado en parte por una beca para la Universidad de Charleston de la Howard Hughes Medical Institute a través de la pre-college & licenciatura ciencia educación y subvenciones del centro nacional para recursos de investigación (5 RR016461 P20) y el nacional Instituto de General ciencias médicas (8 P20 GM103499) de los institutos nacionales de salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
| Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
| 96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
| Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
| Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
| Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
| Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
| Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
| Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
| [32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
| 0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
| Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
| Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
| Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
| DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
| UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
| Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
| Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
| Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
| 2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
| Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
| 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
| Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
| 20 X SSC | Lonza | 51205 | |
| SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
| hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
| Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
| 0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |
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