Summary
Vi præsenterer en metode til mikrofluid analyse af enkelte bakteriel celle lineages med Bacillus subtilis som eksempel. Metoden overvinder mangler af traditionelle analysemetoder i mikrobiologi ved at give observation af hundredvis af celle generationer under stramt styres og ensartet vækstbetingelser.
Abstract
Mikrofluid teknologi overvinder mange begrænsninger for de traditionelle analysemetoder i mikrobiologi. I modsætning til bulk-kultur metoder tilbyder det enkelt celle opløsning og lange observation gange spænder over hundredvis af generationer; i modsætning til Agarosen pad-baserede mikroskopi har det ensartede vækstbetingelser, der kan styres stramt. Fordi den konstant flow af vækstmediet isolerer cellerne i en mikrofluid enhed fra uforudsigelige variationer i den lokale kemiske miljø forårsaget af cellevækst og metabolisme, autentiske ændringer i genekspression og cellevækst i svar på bestemte stimuli kan observeres mere trygt. Bacillus subtilis bruges her som en model bakteriearter at påvise en "mor maskine"-Skriv metode for cellulære analyse. Vi viser, hvordan at konstruere og plumb en mikrofluid enhed, indlæse det med celler, indlede mikroskopisk billeddannelse og udsætte celler til et incitament ved at skifte fra én vækstmediet til en anden. En stress-responderende reporter bruges som et eksempel til at afsløre typen data, der kan opnås ved denne metode. Vi også kort diskutere yderligere anvendelser af denne metode til andre typer af forsøg, som analyse af bakteriel sporedannelse.
Introduction
En af de mest slående træk af livet på jorden er dens stor modstandsdygtighed og sort. Et centralt mål i Molekylærbiologi er at forstå den logik, som celler bruge gener og proteiner til at maksimere deres vækst og fitness under en bred vifte af miljøforhold. For at nå dette mål, skal forskerne kunne trygt iagttage hvordan individuelle celler vokse, kløft, og udtrykke deres gener under et givet sæt betingelser, at bemærke, hvordan celler reagerer på efterfølgende ændringer i deres miljø. Imidlertid har traditionelle analysemetoder i mikrobiologi tekniske begrænsninger, der påvirker typerne af spørgsmål, der kan behandles. For eksempel hovedparten kulturbaserede analyser har været meget nyttige i årenes, men de tilbyder kun befolkningen niveau data, som kan maskere meningsfuldt celle til celle variationer eller adfærd af mindre delpopulationer af celler i den samlede befolkning. Encellede analyser af levende bakterier baseret på lysmikroskopi afsløre encellede adfærd men også teknisk begrænset. Bakterier er typisk immobiliseret på Agarosen puder indeholdende vækstmediet, men celle vækst og division skarer visningen mikroskopiske og udtømmer de tilgængelige næringsstoffer efter blot et par celle cyklusser, betydeligt begrænser observation tid1, 2. Desuden, den lokale nedbrydning af næringsstoffer og den ledsagende ophobning af metaboliske biprodukter på grund af cellevækst konstant ændrer lokale celle vækst miljøet på måder, der er vanskelige at måle eller forudsige. Sådanne miljømæssige ændringer ved hjælp af Agarosen puder udgøre en udfordring for undersøgelser af steady-state adfærd eller cellulære svar til specifikke ændringer i vækst betingelser3.
Mikrofluid teknologi, hvor en flydende medium er konstant flød gennem microfabricated enheder, tilbyder en løsning til klassiske eksperimentelle begrænsninger. En mikrofluid enhed kan holde individuelle celler i holdning til live-celle mikroskopi, mens strømmen af vækstmediet konstant giver celler med friske næringsstoffer og vasker væk metaboliske biprodukter og overskydende celler, hvorved der skabes en meget ensartet vækst miljø. Under konstant vækstbetingelser, kan celle adfærd ses isoleret fra indflydelsen af miljøfaktorer, tillader en uhindret udsigt over den indre logik i celler. Som den flydende flow forhindrer mikrofluid enheden fra at blive overfyldt med celler, bliver observation af enkelt celle lineages for snesevis eller hundredvis af generationer muligt4,5. Sådanne lange observation gange muliggøre påvisning af ellers målbart langsigtede eller sjældne celle adfærd. Endelig vil sammensætningen af det medium, der løber gennem enheden kan ændres på, så celler skal overholdes som de reagerer på udbrud af en stress eller at indførelsen eller fjernelse af et bestemt stof.
Mikrofluidik har allerede haft en række vigtige applikationer. For eksempel, har det været brugt i væv, organ- eller krop-on-a-chip enheder, hvor flere menneskelige celletyper er co kulturperler at simulere en i vivo betingelse6; for studiet af nematodeprøveudtagning bevægelse i microstructured miljøer7; at undersøge interaktioner blandt bakterielle biofilm (fx, 8); og for indkapsling og manipulation af små mængder af celler eller kemikalier (f.eks., 9). Mikrofluid enheder er også blevet stadig mere populære inden for Mikrobiologi (for fremragende anmeldelser, se 10 og 11), især som deres fysiske og flowegenskaber er godt matchede til naturlige mikrobielle nicher12. For eksempel, har mikrofluidik været for nylig ansat mikrobiologer til sådanne formål som netop måle celle vækst og division13,14,15, analysere patogen bevægelse16, overvågning quorum sensing17 og fysiologiske overgange18, og protein tælle19, blandt mange andre eksempler. Metoden præsenteres her er specielt designet til analyse af enkelt bakteriel celle lineages snarere end kombinationer af stammer eller arter. Mikrofluid enheden demonstreret her udnytter en variation af "mor maskine" design4, hvor celler dyrkes enkelt-fil inden for en mikrofluid grøft med en lukket ende og en åben ende; cellevækst og division skubber afkom celler op og ud af den åbne ende i den flydende flow. Vores analyser typisk fokuserer udelukkende på den "mor" celle, der er begrænset på den lukkede ende af renden. Vi anser denne metode som en fremgang over tidligere lette mikroskopi-baserede encellede analytiske teknikker, såsom celle immobilisering på Agarosen puder. Mens B. subtilis bruges som model her, metoden gælder også for andre bakteriearter (Escherichia coli er en anden fælles model, nogle arter med forskellige cellestørrelser eller morfologier kan kræve fabrikation af nye enheder med forskellige dimensioner). Brug af fluorescerende journalister til at markere celler og at visualisere ændringer i genekspression kræver brug af genetisk tractable arter; analyser af cellevækst og morfologi er imidlertid muligt selv uden fluorescerende markører.
Denne protokol udelukker at opdigte silicium master ved hjælp af fotolitografi, som er blevet grundigt beskrevet andetsteds5; mastere kan også være let outsourcede fra microfabrication faciliteter. Det omfatter støbning af en PDMS enhed fra en forstærket silicium master; limning enhed til et stykke cover glas; montage mikrofluid fjorden og outlet VVS, ventiler herunder knivspids for at tillade medium skifte; passivating enheden og forberede bakterieceller læsning enhed med bakterieceller; vedhæftes enheden som VVS og equilibrating celler; og lastning enhed på et fluorescens mikroskop til billedbehandling. Fordi mange forskellige image erhvervelse og forarbejdning software værktøjer kan bruges til at visualisere og analysere forskellige data af renter4,5, er vist eksempler på billeder, men billedoptagelse metoder er ikke inkluderet i denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PDMS enhed støbning
- I et støvfrit miljø, bland PDMS polymer og hærder i forholdet 10:1 og degas under vakuum i mindst 10 min.
- Placer en silicium master (eller en epoxy eller polyurethan replika heraf) på et stykke ubrudt alufolie i en polystyren Petri plade. Hæld den afgassede PDMS blandingen over master til en dybde på ca 5 mm. Degas Petri plade i mindst 10 min. Brug en blid luftstrøm til at bryde overflade bobler.
Bemærk: Dimensionerne af de to-differentieret enhed, der bruges er forudsat i den ledsagende CAD fil5 (Se supplerende fil 1). En plastik replika master kan delvist flyde under afgasning; Hvis dette sker, skubbe ned replikaen med en ren plast applikator. - Helbrede PDMS i mindst 1 time i en ovn ved 60 ° C og afkøles til stuetemperatur. Fjerne den aluminiumsfolie, der indeholder den master og hærdede PDMS fra Petri plade. Omhyggeligt skalle af aluminiumsfolie fra bagsiden af master, så omhyggeligt skræl PDMS fra masteren.
Bemærk: Alternativt PDMS kan helbredes natten over ved stuetemperatur. Den relative skrøbelighed af en silicium-wafer master kan overvindes med epoxy lim til permanent obligation wafer til en 1/16 tommer-tyk aluminium plade af samme størrelse som wafer. - Som en wafer omfatter typisk flere mikrofluid enheder med lidt forskellige dimensioner (Se supplerende fil 1), skåret en enkelt enhed til at størrelse ved hjælp af en ren, skarpe skalpel.
Bemærk: For rutine B. subtilis arbejde, bruge enheder med 1,0 µm hele cellen skyttegrave, som er markeret med en C eller F i den ledsagende CAD-filen.
2. enheden stansning og limning
- Plads et stykke gennemsigtigt office tape (Se Tabel af materialer) over den mønstrede side af enheden for at øge synligheden af de mønstrede funktioner. Indsugnings- og udstødningsporte identificeres som cirkulære områder på modsatte ender af de synlige fluidic kanaler (figur 1). For at forbedre deres synlighed, når stansning huller i indsugnings- og udstødningsporte benene enheden, skal du markere indgange og udgange med prikker ved hjælp af en fin spids markør.
Bemærk: For at sikre, at tilgangs- og afgangsåbninger benene ikke er overfyldt, hver anden kanal er hullede, begynder med kanal lige under den alfabetiske betegnelse for enheden. - Flip PDMS enhed, således at den mønstrede side er nede, og punch gennem enheden til de markerede prikker ved hjælp af en 0,75 mm biopsi punch; Kassér punchings.
Bemærk: Enhederne er hullede med den mønstrede side ned, fordi hullet genereret af biopsi punch er typisk lidt blussede hvor punch ind polymeren. Stansning enhed i en inverteret orientering sikrer, at hullet på den mønstrede side har en skarp kant. - Ved hjælp af et stereomikroskop, sikre at de udstansede huller overlapper med områderne indsugnings- og udstødningsporte på enheden. Brug en fin spids pincet til at fjerne enhver fremmed fragmenter af PDMS fra de udstansede huller.
- Bruge dobbeltklæbende tape til at fjerne støv fra begge sider af enheden og sted i en ren polystyren Petri plade. Forbered en 22 mm x 40 mm cover glas ved fugtning med 100% isopropylalkohol og gnide med et renrum tørre; tør med en strøm af støv-fri luft eller kvælstof.
- Læg den udstansede PDMS enhed funktion side op sammen med de rensede cover glas i en ilt plasma renere.
- Plasma-treat enhed med følgende indstillinger: vakuum, 70 mTorr; O2 pres, 200 mTorr; varighed, 15 s; magt, 30 W. umiddelbart efter behandlingsperioden plasma er færdig, Fjern enhed og dække glas fra plasma renere.
- Vend PDMS og placere det på midten af dækslet glas, så den mønstrede side kontakter glas; sikre at de fodring kanaler (kører mellem områderne indsugnings- og udstødningsporte) er afstemt med den lange akse af dækslet glas. Tryk ned meget forsigtigt for at sikre, at PDMS forseglinger mod glasset.
- Bage den samlede enhed i en ovn for mindst 1 h ved 60 ° C. Efter bagning, manuelt kontrollere at PDMS er bundet til glasset ved at skubbe blidt på det ene hjørne af enheden.
Bemærk: Når enheden er fæstnede, det bør anvendes inden for 24 timer, da polymeren bliver i stigende grad hydrofobe med stigende tid efter plasma behandling.
3. mikrofluid VVS forberedelse
- Skære længder af polymer slanger (indre diameter (ID) 0,02 tomme, ydre diameter (OD) 0,06 tommer) til passende længder at nå fra sprøjten pumpe til skifte apparatet (hvis anvendt) og enheden, når den er monteret på mikroskopet. Skær så mange længder, da der er mikrofluid baner.
- Samle Y kryds til knivspids ventiler (hvis du bruger) ved skæring og vedhæfte 2-cm længder af fleksibel silikone slanger (0,03 tommer ID, 0.065 tommer OD) til de øverste modhager "Y" og 1-cm længder af silikone slange til bunden barb "Y".
- Klip 10-cm (eller fald) længder af polymer slangen; forbinde dem i den ene ende til switchen krydset ved at indsætte dem i 1-cm silikone slanger segmenter på bunden barb "Y". Forbinde dem i anden enden til 21G nåle, der er blevet fjernet fra deres plast sprøjte adaptere og bent ca 90 ° ca. 9 mm fra nål afslutning.
- Tilslut 21G stump nåle til den ene ende af slangen segmenter, der vil køre fra sprøjter til skifte apparat ved indsættelse nåle ind i slangen. Indsæt anden ende af hver længde af slange i silikone slanger segmenter på fjorden modhager af Y kryds.
Bemærk: Brug en slags apparater for at holde knivspids ventiler og vejkryds på plads; Dette kan nemt gøres fra en mikropipette tip box (figur 2D). - Skære længder af polymer rør til at transportere affald fra afgangen fra enheden til en affald bægerglas. Forbinde dem i den ene ende til bent 21G nåle forberedt som beskrevet ovenfor. Tape anden enden af rørene i en affald bægerglas.
- Udarbejde passende mængder af medier indeholdende 0,1 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) og fyld den ønskede størrelse og antallet af sprøjter. Tilslut de BSA-loaded sprøjter til rede 21G nåle knyttet til fjorden rør og belastning sprøjter ind i sprøjten pumper.
Bemærk: For typiske eksperimenter 5 kanaler af enheden bruges, hver med en 20-mL sprøjte. Et eksperiment, hvor mediet er skiftet vil kræve 2 banker af 5 sprøjter. Her, den pumpe, der indeholder den første bank kaldes fase-1 pumpe, og pumpen indeholdende den anden bank, med post switch medium, kaldes fase-2 pumpe. - Rense luften fra fjorden VVS ved at køre sprøjte pumper på en høj gennemstrømning (> 500 µL/min), der begynder ved at orientere sprøjte pumper lodret og trykke sprøjter for at bringe luftbobler til toppen. Når luften er blevet renset fra sprøjter, placere sprøjten pumpe vandret og gradvis tryk eller svirp polymer linjer fra sprøjter op gennem skifte apparat til at løsne og fjerne luftbobler. Gentag processen for den anden bank af sprøjter (hvis skifter media).
- Efter luftbobler er udrenset, indstille fase-2 sprøjten pumpe (dvs.med det medium, der skal bruges anden, efter at have skiftet) til 1,5 µL/min., derefter pause strømmen. Placere små bindemiddel klip på segmenter af fleksible slanger på grenen af Y kryds svarende til den anden medium fase. Fortsætte med at køre fase-1 sprøjten pumpe på en beskeden strømningshastighed (f.eks, 10 µL/min) i mindst 30 min at rense det andet medium fra inlet-slangen neden for Y krydset.
4. celle kultur forberedelse
- Vokse en preculture fra stammen af interesse i den ønskede medium natten over, til stationære fase. Den bakterielle stamme bør indeholde en mutation, der gør cellerne immobile, således at cellerne ikke svømme ud af kanaler af enheden.
Bemærk: I denne protokol, den bakterielle stamme er B. subtilis 3610 indeholdende en HOJA233V substitution (denne mutation der forårsager fimrehår at være lige frem for spiralformet, forebyggelse celle motilitet), et PrsbV- mNeonGreen reporter for celle stress, og en konstitutiv Phyperspank- mNeptune (rød) reporter at fremhæve celler. LB Lennox medium bruges i eksempel-protokollen. Typiske stammer for mikrofluidik eksperimenter indeholder en eller flere fluorescerende transcriptional journalister og en constitutively produceret, cytoplasmatisk fluorescerende proteiner for at lette automatiseret påvisning af celler. Vækst defekter blev ikke observeret når LB Lennox rig medium blev brugt, men B. subtilis vækst i minimal medier kan hæmmede mikrofluid betingelser, fordi udskilles siderophores er skyllet væk af den medium flow. Under sådanne omstændigheder, vækst, gendannes ved tilsætning af natriumcitrat og ferrichloridopløsning til mediet, som rapporterede for S750 medium11. - Om morgenen af eksperimentet, fortyndes B. subtilis celler 1:50 til en forbløffet 250 mL målekolbe indeholdende 25 mL af vækstmediet. Vokse celler for 5-6 h i ryster kultur ved 37 ° C til en optisk tæthed af større end 1.
Bemærk: En tætte cellekultur er at foretrække, fordi den stationære fase B. subtilis celler er mindre og mindre ofte fundet i celle kæder, lette enhed lastning. Forskellige bakteriearter kan kræve andre medium eller vækst betingelser for optimal ladning. - Ved hjælp af en sprøjte med et 5 µm pore-størrelse filter filter ca. 15 mL cellekultur i en 15 mL konisk slange til at fjerne B. subtilis celle kæder (det er unødvendigt for E. coli og kan ikke være nødvendigt med andre arter).
Bemærk: Relativt få celler bør fjernes; filtratet skal være grumset. - Der centrifugeres den filtrerede kultur i 10 min på 4.000 x g ved stuetemperatur. Hæld supernatanten og resuspenderes celle i den resterende supernatanten væske tilbage i røret, tilføje ca 500 µL af frisk medium, hvis det er nødvendigt at lette pipettering cellesuspension.
5. enhed lastning
- Anbring forsigtigt tomme tynd gel-loading mikropipette tips (Se Tabel af materialer) ind i outlet hullerne i mikrofluid enheden.
- Ved hjælp af tynde gel-loading tips med en P200 mikropipette, passivering enheden ved at indsprøjte medium indeholdende 1 mg/mL BSA i inlet hullerne, observere tips i outlet huller til at overvåge udfyldning af mikrofluid kanaler (figur 2A). Inkuber enhed ved stuetemperatur i ca 5 min.
Bemærk: BSA er almindeligt anvendt som en blokering eller passivation agent, der vil binde sig til hydrofobe overfladen af PDMS polymer, øge sin hydrofiliciteten og reducere bindingen af andre proteiner eller celler (via celle overflade molekyler). - Ved hjælp af tynde gel-loading tips, indlæse hver kanal med de resuspenderede celler (fra afsnit 4), ved hjælp af tips i outlet-kanal til at overvåge status for cellerne gennem enhed (figur 2B).
Bemærk: Indlæsning lettes ved at indstille P200 mikropipette til sin maksimale 200 µL volumen og derefter sugning en pude af luft før sugning en lille mængde (ca halv omfanget af den tynde del af pipette tip) celler. Mængden af resuspenderede celler behøver ikke være præcis, da omfanget af PDMS enhed er lille i forhold til mikropipette. Vi kender ingen øvre grænse for massefylden af de resuspenderede celler, så længe cellesuspension kan være pipetted i enheden. Celle klumper kan blokere enheden og bør undgås af grundig pipettering og/eller vortex blanding. - Fjern forsigtigt gel-loading tips fra outlet huller, arbejder en ad gangen for at undgå at beskadige enheden.
- Der centrifugeres enhed i en bænk-top microcentrifuge i en passende rotor adapter på ca 6000 x g i 10 min. (figur 2 c).
Bemærk: En custom-bearbejdet aluminium rotoren adapter, der var designet til at passe ind i en microcentrifuge rotor (figur 2 c) blev brugt; forskellige centrifuge modeller kan anvendes med passende rotor adaptere. Den vigtigste funktion af adapteren er at det giver lateral kraft i retning af de lukkede ender af celle skyttegrave, hvilket tvinger celler i side-kanaler. - Bekræft vellykket lastning under mikroskop (figur 3), men uden paaklaebning enhed til dias indehaveren/fase indsætte.
Bemærk: I denne protokol, et 60 X, 1.4 NA Ph3 oliebestan mål anvendes for både verifikation i denne fase og efterfølgende billeddannelse.
6. enhed forsamling, ækvilibrering og montering
- Omhyggeligt montere indlæst enheden på en stage indsætte ved at tape cover glas på begge sider af PDMS til bunden af scenen Indsæt (dvs., invertere fase Indsæt før den vedhæftes enheden). Invertere fase Indsæt-enhed forsamling, så at PDMS står og læg på en blød overflade, såsom en støvfri tørre (figur 2D).
- Justere flow af fase-1 sprøjten pumpe til 35 µL/min. arbejder med én vognbane ad gangen, indsætte inlet nålen og derefter outlet nål (dvs., kører over i bægerglasset, affald; Figur 2E).
- Tørre væk eventuelle overskydende medium med en ren støvfri tørre og visuelt inspicere enheden for utætheder. Undersøge outlet slangen for udseendet af overskydende celler (typisk optræder som en grumset stribe) og mellemstore menisken, der langsomt flytter mod affald bægerglasset.
- Tillad enheden at køre på 35 µL/min i ca 15-30 min, indtil alle de tilsluttede baner afløb i den affald bægerglas.
- Indstil fase-1 sprøjten pumpe til 1,5 µL/min og afbryde strømmen. Bringe det hele pumpen og enhed apparater til mikroskop (denne proces er hjulpet ved at placere det hele på en rullende vogn) og genstarte den fase-1 medium flow på 1,5 µL/min. omhyggeligt montere fase Indsæt med enheden på en inverteret fluorescens mikroskop, ved hjælp af tape som nødvendigt for at dirigere indløb og outlet rør.
- Find ønskede positioner på enheden til billedbehandling og begynde imaging som ønsket. Bemærk, at cellerne kræver typisk et par timer (ca 10 generationer) at nå frem til steady-state eksponentielle-fase vækst, og udbrud af image erhvervelse kan være forsinket som ønskes således at billeddannelse begynder efter perioden ækvilibrering.
Bemærk: Steady-state vækst af celler i eksponentiel fase bør kontrolleres under efterfølgende billedanalyse af tracking celledeling gange og at sikre, at de har nået en konstant minimumværdi.
7. medium skifte
- Mellem successive runder af imaging, afbryde strømmen af fase-1 sprøjten pumpe. Omhyggeligt unclip bindemiddel klip fra fase-2 silikone slanger, der flytter hver til silikoneslanger på fase-1-grenen af Y krydset. Un-pause strømmen af fase-2 sprøjten pumpe, (som blev sat til 1,5 µL/min i trin 3.8) og fortsætte billeddannelse.
Bemærk: på 1,5 µm/min med et 10 cm længde af polymer slanger nedstrøms af Y kryds, når anden fase medium enhed i ca 50 min. Tid til enheden kan afprøves empirisk, ved hjælp af medier, der indeholder fluorescerende tracer partikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket oprindelige celle lastning, som vurderet af fasekonstrastmikroskopi før vedhæftes enheden, mikrofluid VVS vil anses for at have alle eller næsten alle mikrofluid side kanaler, der indeholder en eller flere bakterielle celler ( Figur 3A). Optimal lastning ville vise flere celler i hver kanal, men kanaler vil ikke desto mindre fylde med celler på grund af cellevækst i ækvilibrering periode (figur 3B). Baner med dårlig læsning, hvor relativt få (< 50%) side kanaler er indlæst med celler, kan anvendes, men den resulterende datatætheden vil være lavere som følge af færre celle lineages er afbildet på hver tænkelig position.
Når enheden er i første omgang indlæst, er det ekvilibreres ved fastgørelse af mikrofluid VVS og flydende medium gennem enheden ved en relativt høj gennemstrømning af 35 µL/min. Trinnet ækvilibrering serverer at fjerne luftbobler og overskydende celler i fodring kanal fra enheden, og at fremme cellerne i side-kanaler til at begynde voksende. De celler, der er fjernet fra enheden på medium flow kan ofte ses med det blotte øje som en lys-farvet band bevæger sig gennem outlet slangen mod spildbakken; bevægelse af bands fungerer som en visuel indikator for, at væsken flyder normalt gennem VVS og enheden. Mikroskopisk undersøgelse af en afbalancerede enhed skal afsløre et par celler er begrænset i enkelt fil i det meste af side kanalerne (figur 3B, 0 min).
Når en afbalancerede enhed er placeret på mikroskop under flow på 1,5 µL/min ved 37 ° C, genoptages cellerne uniform og konstant eksponentiel-fase vækst i løbet af ca 2 h (figur 3B). Konstant eksponentiel vækst bør kontrolleres direkte efter billedanalyse af udseendet af et plateau i generationstid af celler. På dette tidspunkt er cellerne klar til fluorescens og/eller brightfield imaging som ønsket. Et succesfuldt indlæst og afbalancerede enhed kan typisk være pålideligt afbildet i perioder af mindst 24 h (figur 4A, C). At indføre en mellemlang switch (figur 4A-C) udvider rækken af eksperimenter, der kan gennemføres, men også øger hyppigheden af katastrofale celledød begivenheder (figur 4D), formentlig gennem indførelse af luft bobler, som ikke var med held renset fra slangen. En anden begivenhed, der kan forårsage katastrofale celledød er at klynger af celler beliggende på fjorden kan blive forskubbet og passere gennem fodring kanalen, som vist i figur 4D. Vi forstår i øjeblikket ikke hvorfor dette forårsager katastrofale celledød i enheden, og vi har endnu ikke udviklet en metode til at forhindre sådanne hændelser opstår.
Figur 1: skematisk af enhedens mikrofluid. En skematisk enhed er vist ca til at skalere. Den alfabetiske sortering er mærket sammen med indsugnings- og udstødningsporte zoner, der er slået for at forbinde blunt-ended nåle. Halvdelen af de mønstrede kanaler bruges typisk, (skraverede grå). Celle skyttegravene er orienteret mod betegnelse. Ledsagende CAD-filen viser (Se supplerende fil 1) alle funktioner på enheden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: mikrofluid enhed passivation, celle lastning og ækvilibrering. (A) A agglomererede enhed efter passivation med BSA-holdige medium. Gel-loading tips holdes i outlet huller til at overvåge passage af medium og celler gennem enheden. Den medium menisk er synlige i den tynde del af gel-loading tips (pil). (B) enhed efter celle lastning. Cellerne er synlig som en gennemskinnelig hvidt lag i gel-loading tips (pil). (C) gel-loading tips er fjernet inden centrifugering i en brugerdefineret opdigtet centrifuge adapter. Medicinsk tape (blå) er placeret på aluminium dele at afbøde enheden. (D) efter centrifugering og verifikation af lastning, enheden er tapede til et mikroskop fase Indsæt og knyttet til indsugnings- og udstødningsporte benene. I billedet vist, er medium skifte muliggjort af knivspids ventiler og Y-stik, der er arrangeret i et apparat, fremstillet af en mikropipette tip box. (E) skematisk oversigt over en hel samlet enhed, fra sprøjten pumper til spildbakken. Outlet rør kører til en lille affald bægerglas. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: celle lastning og vækst i enhedens mikrofluid. (A) fra venstre mod højre, fase-kontrast micrographs af en enhed, der indeholder medium kun før celle læsning, den samme enhed efter celler er blevet tilføjet via pipettering men inden centrifugering og den samme enhed efter centrifugal lastning. (B) tid løbet af celle tilpasning og vækst i den enhed (LB, 37 ° C, flow 1,5 µL/min). I begyndelsen af tilpasning er stationære fase celler forholdsvis korte og smalle. Som cellerne tilpasse og vende tilbage til eksponentiel-fase vækst (60-120 min), vedtager de en længere og bredere morfologi. Efter 120 min, alle celler i enheden genoptage ensartet eksponentielle-fase vækst, og enheden er klar til billedbehandling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: celle vækst og medium skifte i enhedens mikrofluid. (A) Kymographs viser 550 min vækst før og 1.000 min vækst efter et medium switch (grå stiplet linje) i 2% ethanol som en stressor. Billeder blev fanget med 10 min mellemrum. Det øverste panel viser transcriptional mNeonGreen reporter (grøn kanal) for en stress-induceret genet. Bundpanelet viser en konstitutiv mNeptune reporter (røde kanal), der bruges i dette tilfælde til automatiseret celle segmentering. (B) Close-up Se af dele af kymographs i boksen stiplet i panelet A, viser en forbigående reaktion i den grønne kanal efter parameteren medium. Bemærk, at væksten fortsætter gennem kontakten, selvom tilstedeværelsen af ethanol får cellerne til at blive kortere og vokse i et lidt langsommere tempo. Tidsskalaen er vist af den vandrette linje, og afstanden er vist af en lodret linje. (C) eksempel spor af analyseret fluorescens data i en enkelt celle afstamning fra forsøget vist i panelet A. De lodrette stiplede linjer angiver parameteren medium til 2% ethanol som en stressor. (D) eksempel på en mislykket medium switch. Når det andet medium når cellerne, er celler i kanalerne mængden. Parameteren er ledsaget af et stort antal celler, der går forbi i den vigtigste kanal, forårsager en lyse fluorescerende signal (en re skalerede billede svarer til regionen udvasket er vist lige over det). Efter at have skiftet overholdes ingen yderligere celler, selv om svagt fluorescerende celle debris forbliver i kanalerne. Tidsskalaen er vist af den vandrette linje, og afstanden er vist af en lodret linje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne mikrofluidik protokol er fleksibel, idet mange i foranstaltninger kan ændres for at optimere dets anvendelse med en bestemt art, stamme eller til et bestemt formål. Faktisk, i denne protokol har vi foretaget ændringer til den oprindelige "mor maskine" koncept4 til at optimere dets anvendelse med B. subtilis. Ofte, udgør skyttegrave, hvor cellerne er begrænset en enkeltlags funktion, der henviser til, at i denne protokol bruger vi to-lags celle skyttegrave, med en lavvandet kanal omkring cellerne. To-lags design blev introduceret som en måde at maksimere flux af næringsstoffer til og metabolitter fra B. subtilis celler, især i lange (> 75 µm) skyttegrave5; dog enkeltlags funktioner ofte være tilstrækkeligt for optimal cellevækst og er almindeligt anvendt til E. coli, især når de er kortere (~ 25 µm)4. Vi bruger typisk længere skyttegravene, da de reducerer den frekvens, hvormed B. subtilis celle kæder, der opstår stochastically, er trukket ud af deres skyttegrave ved den medium flow i de vigtigste fodring kanal5.
Yderligere kan ændringer, såsom anvendelse af enheder med forskellige indslag dimensioner (fx, kanal bredder) eller karakteristika (fxformen, antallet af åbne ender) erstattes af omstændighederne. For eksempel, er brug af celle skyttegrave, der er åbne i begge ender (i stedet for kun én enden i denne protokol) blevet brugt i andre undersøgelser1,20,21. Skyttegrave, som er åbent i begge ender undgå celle ældning, fordi de er konstant at være fyldt med nyfødte celler (i modsætning til mor maskiner, hvor den ældste celle er sporet og nyere celler er skubbet ud af kanalen), selv om det faktum, at ældre celler er skubbet ud af begge ender typisk begrænser deres observationelle vindue til færre end 10 generationer1,21. Vi typisk søger længere observationelle vinduerne (hundredvis af generationer) udbydes af en mor maskine, der gør det muligt at foranstaltningen selv memoryless processer som ventetider er snesevis eller hundredvis af generationer lange5. Vi har også brugt mor maskine designet til at observere celler, der ikke vokser eksponentielt, som i vores analyser af sporulering22. I sådanne tilfælde analyseres yderligere celler i hele væksten skyttegrave kan være meningsfuldt22.
Mange af trinnene i protokollen relativt tilgivende, fordi de kan ændres uden væsentligt påvirker protokollen resultatet. For eksempel, en tidligere version af protokollen kaldet til rengøring cover glas af sekventielle 10-min bad sonikering trin i 10 M KOH og derefter rent vand, men vi fandt, at god enhed limning og drift blev opnået ved hjælp af de enklere isopropanol-baseret rengøring trin beskrives her. Hvis en limning spørgsmålet opstod at kaste mistanke om renholdelse af dækslet glas, anbefales vende tilbage til en mere stringent rengøring protokol. På samme måde, mens vi bruger en centrifugering trin til at maksimere celle ilægning i celle skyttegrave, rimelig fuld belastning kan opnås selv uden dette trin, forudsat at meget koncentreret celler anvendes til lastning trin. Denne alternative strategi kan være særligt nyttigt for forskere, der ikke har en let tilgængelige centrifuge adapter til at dreje enheden. Igen, kan der anvendes forskellige koncentrationer af passiverende/smørende agent (BSA i denne protokol); Vi bruger rutinemæssigt koncentrationen så høj som 1 mg/mL. I tilfælde hvor en stamme kan være følsomme over for BSA, kan acceptable resultater opnås selv i mangel af en passiverende agent. Faktisk, når vi brugte en mikrofluid enhed til at undersøge sporulering, der kræver celle sult, vi var bekymrede, BSA kan fungere som en potentiel kilde til næringsstoffer til cellerne, og så vi udeladt det fra den medium flow uden at observere nogen væsentlig bivirkninger22.
Især, kan den kontinuerlig flow af medium gennem enheden fremkalde lidt forskellige fænotyper sammenlignet med cellevækst i et lukket system, som en kolbe. For eksempel kan næringsstof eller sammensatte udtynding udfordrende, som cellerne kan ofte skyllepumpetab spor forbindelser fra medium flow. Faktisk har vi observeret at inducere celle sporulering via sult kræver længere tid i en mikrofluid enhed end i en kolbe. På samme måde, vi har observeret, at induktion af energi stress ved hjælp af oxidativ fosforylering decoupler carbonyl cyanid m-chlorphenyl hydrazone (CCCP) kræver several-fold højere koncentrationer i mikrofluid enhed end rapporteret i kolben kultur 23. derfor nogle optimering kan være nødvendigt at opnå tilfredsstillende resultater med forskellige medium tilsætningsstoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af National Institutes of Health under GM018568. Denne protokol blev udført delvist på Center for nanoskala systemer (CNS), medlem af den nationale nanoteknologi koordineret infrastruktur netværk (NNCI), som støttes af National Science Foundation under NSF award no. 1541959. CNS er en del af Harvard University. Mange tak naturligvis Thomas Norman og Nathan Herren for deres arbejde med at blive gravid og opdigte master skabelonen bruges til enhederne, der vises her og i opbygningen af den oprindelige version af apparatet. Vi har også takke Johan Paulsson for hans værdifulde samarbejde rådgivning og takke medlemmerne af hans lab for deres rådgivning og fortsatte forbedringer af bakterielle mikrofluid apparater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
References
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), Basel. 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps". MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
