Summary
Vi presenterar en metod för mikroflödessystem analys av enskilda bakteriecell härstamningar med Bacillus subtilis som exempel. Metoden övervinner brister av traditionella analytiska metoder i mikrobiologi genom att låta observation av hundratals cell generationer tätt kontrollerbar och enhetlig tillväxt villkor.
Abstract
Mikroflödessystem teknik övervinner många av begränsningar för traditionella analytiska metoder i mikrobiologi. Till skillnad från bulk-kultur metoder erbjuder det encelliga upplösning och lång observation tider som spänner över hundratals generationer. till skillnad från agaros pad-baserade mikroskopi har den enhetlig tillväxt villkor som kan kontrolleras noggrant. Eftersom ett kontinuerligt flöde av odlingsmedium isolerar cellerna i en mikroflödessystem enhet från oförutsägbara variationer i lokala kemiska miljön som orsakas av celltillväxt och metabolism, autentiska förändringar i genuttryck och celltillväxt i svar på specifika stimuli kan observeras mer tillförsikt. Bacillus subtilis används här som en modell bakterieart att demonstrera en ”mor maskin”-Skriv metod för cellulära analys. Vi visar hur du konstruera och lod en mikroflödessystem enhet, ladda den med celler, initiera mikroskopbilder och exponera celler till en stimulans genom att byta från ett odlingsmedium till en annan. Stress-lyhörd reporter används som ett exempel för att avslöja vilken typ av data som kan erhållas genom denna metod. Vi diskuterar också kort ytterligare tillämpningar av denna metod för andra typer av experiment, såsom analys av bakteriell sporulering.
Introduction
En av de mest slående funktionerna av liv på jorden är dess stor motståndskraft och mängd. Ett centralt mål för molekylärbiologi är att förstå logiken som celler använder gener och proteiner för att maximera sin tillväxt och kondition under en mängd olika miljöförhållanden. För att uppnå detta mål, måste forskarna kunna tryggt Observera hur enskilda celler växer, dela och uttrycka sina gener under en given uppsättning villkor, att notera hur celler svarar på ändringar i deras miljö. Traditionella analytiska metoder i mikrobiologi har dock tekniska begränsningar som påverkar vilka typer av frågor som kan lösas. Till exempel bulk kultur-baserade analyser har varit mycket användbar under åren, men de erbjuder bara befolkningen nivå data som kan maskera meningsfull cell till cell variationer eller beteenden av mindre delpopulationer av celler i den totala befolkningen. Enskild cell analyser av levande bakterier baserat på ljusmikroskopi avslöja encelliga beteende men är också tekniskt begränsad. Bakterier är oftast orörlig på agaros pads som innehåller odlingsmedium, men cell tillväxt och division folkmassorna vyn mikroskopiska och utarmar de tillgängliga näringsämnena efter bara några cell cykler, att avsevärt begränsa observation tid1, 2. Dessutom förändras lokala utarmning av näringsämnen och samtidig uppbyggnad av metaboliska biprodukter på grund av celltillväxt ständigt lokala cell tillväxt miljön på ett sätt som är svåra att mäta eller förutsäga. Sådana miljöförändringar som använder agaros kuddar utgör en utmaning att studier av steady state beteenden eller cellulära svar för vissa förändringar i tillväxt villkor3.
Mikroflödessystem teknik, där ett flytande medium kontinuerligt flödas igenom biochips enheter, erbjuder en lösning till klassiska experimentella begränsningar. En mikroflödessystem enhet kan hålla enskilda celler i position för live-cell mikroskopi medan flödet av odlingsmedium ständigt ger celler med färskt näringsämnen och tvättar bort metaboliska biprodukter och överskjutande celler, vilket skapar en mycket jämn tillväxt miljö. Under ständig tillväxt villkorar, kan cell beteenden observeras i isolering från påverkan av miljöfaktorer, tillåter en obehindrad utsikt över den inre logiken av celler. Strömningen förhindrar mikroflödessystem enheten från att bli trångt med celler, blir observation av enstaka cell härstamningar för tiotals eller hundratals generationer möjligt4,5. Sådan lång observation gånger möjliggöra upptäckt av annars omätbara långsiktiga eller sällsynta cell beteenden. Slutligen kommer sammansättningen av det medium som strömmar genom enheten kan ändras på, så att celler observeras när de svarar till uppkomsten av en stress eller införande eller borttagning av en särskild förening.
Mikrofluidik har redan haft ett antal viktiga tillämpningar. Till exempel, har det använts i vävnad-, orgel- eller organ-på-ett-chip enheter, där flera typer av mänskliga celler är samtidig odlade att simulera en i vivo villkor6. för studier av nematoder rörelse i microstructured miljöer7; att undersöka interaktionen mellan bakteriell biofilm (t.ex., 8); och för inkapsling och manipulation av små volymer av celler eller kemikalier (t.ex. 9). Mikroflödessystem enheter har också blivit allt populärare inom mikrobiologi (för utmärkt recensioner, se 10 och 11), särskilt som deras fysiska och flödet egenskaper är väl matchade till naturliga mikrobiella nischer12. Exempelvis har mikrofluidik nyligen anställts av mikrobiologer för sådana ändamål som just mäta cell tillväxt och division13,14,15, analysera patogen rörelse16, övervakning quorum sensing17 och fysiologiska övergångar18, och för protein räknar19, bland många andra exempel. Metoden presenteras här är specifikt utformad för analys av enda bakteriecell härstamningar i stället för kombinationer av stammar eller arter. Den mikroflödessystem enheten visat här använder en variant av den ”mor maskin” design4, där celler odlas ENFILIG inom en mikroflödessystem dike med en sluten och en öppen ände; celltillväxt och division skjuter avkomma celler upp och ut ur den öppna änden i strömningen. Våra analyser fokuserar oftast bara på cellen ”mor” som är begränsad i slutna slutet av diket. Vi anser denna metod som en befordran över tidigare Ljus microscopy-baserade encelliga analysmetoder, såsom cell immobilisering på agaros trampdynor. B. subtilis används som modell här, metoden är också tillämpliga på andra bakteriearter (Escherichia coli är en annan gemensam modell, vissa arter med olika cell storlekar eller morfologier kan kräva tillverkning av nya enheter med olika dimensioner). Fluorescerande reportrar att markera celler och att visualisera förändringar i genuttryck förutsätter att användningen av genetiskt eftertraktansvärda arter; analyser av celltillväxt och morfologi är dock möjlig även utan fluorescerande markörer.
Protokolls exkluderar processen att fabricera kisel befälhavaren använder photolithography, som har beskrivits utförligt någon annanstans5; Masters kan också enkelt utlagda från mikrofabrikation faciliteter. Den innehåller gjutning av en PDMS enhet från en förstärkt silicon mästare; bonding enheten till en bit av omslaget glas; montering i ultrakalla inlopp och utlopp VVS, ventiler inklusive nypa för att tillåta medium byta; passivering enheten, förbereda bakterieceller och laddar enheten med bakterieceller; koppla VVS till enheten och equilibrating celler; och laddar enheten på fluorescens Mikroskop för avbildning. Eftersom många olika bild förvärv och bearbetning programvara verktyg kan användas för att visualisera och analysera olika data av intresse4,5, exempel bilder visas, men Bildinsamling metoder ingår inte i detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PDMS enhet gjutning
- I en dammfri miljö, blanda PDMS polymer och härdare i förhållandet 10:1 och degas under vakuum i minst 10 min.
- Placera en silicon mästare (eller en epoxi eller polyuretan replik därav) på en bit av obruten aluminiumfolie i en polystyren Petri tallrik. Häll avgasade PDMS blandningen över befälhavaren till ett djup av cirka 5 mm. Degas Petri plattan i minst 10 min. Använd en svag luftström att bryta ytan bubblor.
Obs: Måtten på två nivåer enheten används finns i de medföljande CAD fil5 (se kompletterande fil 1). En plast replika mästare kan delvis flyta under avgasning; om detta inträffar, tryck ned repliken med en ren plast applikator. - Bota PDMS för minst 1 h i en ugn vid 60 ° C och svalna till rumstemperatur. Ta bort aluminiumfolie innehållande den master och botade PDMS från Petri plattan. Dra försiktigt av aluminiumfolie från baksidan av befälhavaren och sedan dra försiktigt PDMS från master.
Obs: Alternativt PDMS kan botas över natten i rumstemperatur. Relativa bräckligheten i samlingsdokument kisel-wafer kan övervinnas genom att använda epoxy lim att permanent bond rånet till en 1/16-tums-tjock aluminium skiva av samma storlek som rånet. - Som en wafer innehåller vanligtvis flera mikroflödessystem enheter med något olika dimensioner (se kompletterande fil 1), skär en enda enhet att storlek med en ren, skarp skalpell.
Obs: För rutin B. subtilis arbete, använda enheter med 1,0 µm-hela cellen diken, som markeras med en C eller F i den tillhörande CAD-filen.
2. enheten stansning och limning
- Plats en bit genomskinlig office tejpa (se Tabell för material) över mönstrad sida av enheten för att öka synligheten för de mönstrade funktionerna. De in- och utsugningskanaler identifieras som cirkulära områden på motsatta sidor av de synligt fluidic kanalerna (figur 1). För att förbättra sin synlighet när stansning hål i enheten för inlopp och utlopp stiften, markera vikar och outlets med prickar med en spetsig markör.
Obs: För att säkerställa att in- och utlopp stiften inte trångt, varje annan kanal är stansade, börjar med kanalen precis under den alfabetisk beteckningen för enheten. - Vänd PDMS enheten så att den mönstrade sidan är nere, och stansa igenom enheten till markerade prickar med 0,75 mm biopsi punch; Kassera punchings.
Obs: Enheterna stansas med den mönstrade sidan ner eftersom hålet genereras av biopsi punsch är vanligtvis något blossat där punsch in polymeren. Stansning enheten i en omvänd riktning säkerställer att hålet på den mönstrade sidan har en skarp kant. - Använder ett stereomikroskop, säkerställa att stanshålen överlappar områdena inlopp och utlopp av enheten. Ta bort ovidkommande fragment av PDMS från stanshålen med hjälp av en spetsig pincett.
- Använd tejp för att ta bort damm från båda sidor om enhet och plats till en ren polystyren Petri platta. Förbereda en 22 x 40 mm skyddsglaset genom fuktning med 100% isopropylalkohol och gnugga med en renrum torka; torr med en ström av dammfri luft eller kväve.
- Placera den stansade PDMS enhet funktionen Sidan upp tillsammans med rengjorda täckglaset till ett syre plasma renare.
- Plasma-behandla enheten med följande inställningar: vakuum, 70 mTorr; O2 tryck, 200 mTorr; varaktighet, 15 s; makt, 30 W. omedelbart efter behandlingsperioden på plasma är klar, ta bort enheten och skyddsglaset från plasma renare.
- Vänd PDMS och placera den i mitten på täckglaset så att den mönstrade sidan kontakter glaset; Se till att de matande kanaler (som kör mellan områdena inlopp och utlopp) är i linje med den långa axeln av täckglaset. Tryck ner mycket försiktigt för att säkerställa att PDMS sälarna mot glaset.
- Baka den monterade enheten i en ugn för minst 1 h vid 60 ° C. Efter bakning, manuellt verifiera att PDMS är bunden till glaset genom att trycka försiktigt på ena hörnet av enheten.
Obs: När enheten är bundna, det bör användas inom 24 h, som polymeren blir alltmer hydrofoba med ökande tid efter plasmabehandling.
3. mikroflödessystem VVS förberedelse
- Skär längder av polymer slangar (innerdiameter (ID) 0,02 tum, ytterdiameter (OD) 0,06 tum) till lämpliga längder att nå från sprutpumpen till kopplingsutrustning (om sådan används) och enheten när den är monterad på mikroskopet. Skär så många längder som det finns mikroflödessystem körfält.
- Montera Y korsningar för slangventiler (om du använder) genom skärning och fästa 2-cm längder av flexibel silikon slangar (0,03 tum ID, 0,065 tums OD) till övre hullingar den 'y' och 1 cm längder av silikon slangar till den nedre barb den 'y'.
- Skär 10-cm (eller lämpliga) längder av polymer slangar; Anslut dem i ena änden till switch korsningen genom att infoga dem i 1 cm silikon slangar segmenten på den nedre barb den 'y'. Anslut dem i den andra ändan till 21G nålar som har tagits bort från sin Plastspruta adaptrar och bent cirka 90 ° cirka 9 mm från nålen slutet.
- Anslut 21G trubbiga nålar till ena änden av slangen segmenten som löper från sprutor till att byta apparater genom att sätta nålar i slangen. Infoga andra ändarna av varje längd på slang i segmenten silikon slangar på inlopp hullingar av de Y-korsningarna.
Obs: Använd någon slags apparater för att hålla slangventiler och korsningar på plats; Detta kan lätt göras från en mikropipett tip låda (figur 2D). - Skär längder polymer slangar att bära avfall från utloppet av enheten i en bägare som avfall. Anslut dem i ena änden till böjda 21G nålar bereds enligt anvisningarna ovan. Tejpa den andra änden av rören till en avfall bägare.
- Förbereda lämpliga volymer av media som innehåller 0,1 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) och fyll i önskad storlek och antalet sprutor. Anslut de BSA-laddade sprutorna till beredda 21G nålar kopplade till inlopp slangar och belastning sprutorna i sprutpumpar.
Obs: för typiska experiment 5 kanaler av enheten används, alla med en 20 mL-spruta. Ett experiment där mediet är påslagen kommer att kräva 2 banker i 5 sprutor varje. Här pumpen som innehåller första bank kallas fas-1 pumpen, och pumpen som innehåller andra banken, med efter switch medium, benämns fas-2 pumpen. - Rensa luften från inlopp VVS genom att köra sprutpumpar med en hög flödeshastighet (> 500 µL/min), början av orientera sprutpumpar vertikalt och trycka på sprutorna för att få luftbubblor till toppen. När luften har rensats från sprutorna, placera sprutpumpen horisontellt och successivt tryck eller flick polymer rader från sprutorna upp genom växeln apparaten att rubba och rensa luftbubblor. Upprepa proceduren för den andra banken av sprutor (om byter media).
- Efter luftbubblor rensas, ställa in fas-2 sprutpumpen (dvs, med det medium som används för andra, efter växeln) till 1,5 µL/min, sedan Pausa flödet. Placera små bindemedel klipp på segmenten på flexibel slang på grenen av Y korsningar motsvarar den andra medelstora fasen. Fortsätta att köra fas-1 sprutpumpen med en blygsam flödeshastighet (t.ex., 10 µL/min) i minst 30 min att rensa det andra mediet från inlopp slangen nedströms i Y-korsningen.
4. cell kultur förberedelse
- Väx en preculture stam av intresse i önskat medium över natten, till stationär fas. Bakteriestam bör innehålla en mutation som återger cellerna orörlig, så att cellerna inte bada ur kanalerna för enheten.
Obs: I detta protokoll, bakteriestam är B. subtilis 3610 innehållande en haggaA233V substitution (denna mutation orsakar de flagellen vara rakt snarare än spiralformade, förebygga cell motilitet), en PrsbV- mNeonGreen reporter för cell stress, och en konstitutiv Phyperspank- mNeptune (röd) reporter för att markera celler. LB Lennox medium används i exempel protokollet. Typiska stammar för mikrofluidik experiment innehålla en eller flera fluorescerande transkriptionell reportrar och ett konstitutivt produceras, cytoplasmiska fluorescerande protein för att underlätta automatisk upptäckt av celler. Tillväxt brister observerades inte när LB Lennox rikt medium användes, men B. subtilis tillväxt i minimal media kan hämmas mikroflödessystem villkor eftersom utsöndras sideroforer tvättas bort av medelstora flödet. Under sådana omständigheter kan tillväxt återställas genom tillsats av natriumcitrat och järnklorid till medium, som rapporterats för S750 medium11. - På morgonen av experimentet, späd B. subtilis cellerna 1:50 i en förbryllad 250 mL-mätkolv som innehåller 25 mL odlingsmedium. Odla cellerna för 5-6 h i skakar kultur vid 37 ° C till en optisk densitet större än 1.
Obs: En tät cellkultur är att föredra eftersom den stationära-fasen B. subtilis celler är mindre och mindre ofta finns i cell kedjor, underlätta enhet lastning. Olika bakteriearter kan kräva andra medium eller tillväxt villkor för optimal lastning. - Med hjälp av en spruta försedd med 5 µm porstorlek filter, filtrera cirka 15 mL cellodling in i en 15 mL koniska rör ta bort B. subtilis cell kedjor (det är onödigt för E. coli och kanske inte är nödvändigt med andra arter).
Obs: Relativt få celler bör tas bort; filtratet skall vara grumligt. - Centrifugera filtrerade kulturen i 10 min vid 4000 x g vid rumstemperatur. Häll av supernatanten och återsuspendera cellpelleten i resterande supernatanta vätskan kvar i röret, lägga ca 500 µL av färskt medium om nödvändigt att underlätta pipettering cellsuspension.
5. enheten lastning
- Placera försiktigt tom tunn gel-lastning mikropipett tips (se Tabell för material) in i uttaget hål i ultrakalla enheten.
- Med tunn gel-lastning tips med en P200 mikropipett, passiverande enheten genom att injicera medium innehållande 1 mg/mL BSA in i inloppet hål, observerar tipsen i outlet hålen att övervaka fyllningen mikroflödessystem kanaler (figur 2A). Inkubera enheten vid rumstemperatur under ca 5 minuter.
Obs: BSA används ofta som en blockering eller passivering agent som kommer att binda till hydrofoba ytan av PDMS polymeren, öka dess hydrophilicitet och minska bindningen av andra proteiner eller celler (via cell surface molekyler). - Med hjälp av tunn gel-lastning tips, Fyll varje kanal med återsuspenderade celler (från avsnitt 4), med hjälp av tips i kanalen utlopp för att övervaka framstegen i cellerna genom enheten (figur 2B).
Obs: Lastning underlättas genom att ange den P200 mikropipett till dess maximala 200-µL volym och sedan aspirera en luftkudde innan aspirera en liten volym (cirka halva volymen av den tunna delen av pipettspetsen) celler. Volymen av återsuspenderade celler behöver inte vara exakt, som volymen av PDMS enheten är liten i förhållande till mikropipett. Vi känner ingen övre gräns till tätheten av återsuspenderade cellerna, så länge cellsuspensionen kan vara pipetteras i enheten. Cell klumpar kan täppa till enheten och bör undvikas av grundlig pipettering eller vortex blandning. - Ta försiktigt bort de gel-lastning-tips från outlet hålen, arbetar en i taget för att förhindra skador på enheten.
- Centrifugera enheten i en bänk mikrocentrifug i en lämplig rotor adapter på cirka 6 000 x g i 10 minuter (figur 2 c).
Obs: En anpassad-frästa aluminium rotor adapter som var utformad för att passa in i en mikrocentrifug rotor (figur 2 c) användes; olika centrifug modeller kan användas med lämpliga rotor adaptrar. Den viktiga inslaget i adaptern är att det ger lateral kraft i riktning mot cell skyttegravarna, därigenom tvinga celler i de side kanalerna slutna ändar. - Verifiera lyckad lastning under mikroskopet (figur 3) men utan anbringande enheten till bild innehavaren/scenen infoga.
Observera: I detta protokoll, en 60 X, 1,4 NA Ph3 Oljeimmer mål används för både kontroll i detta skede och efterföljande imaging.
6. enheten Assembly, Jämviktstiden och montering
- Noggrant montera laddade enheten på en scen infoga genom att tejpa skyddsglaset på vardera sidan av PDMS längst ned på scenen skäret (dvs.Invertera scenen skäret innan du monterar enheten). Invertera församlingens scenen infoga-enheten så att PDMS är vänd uppåt och placera på en mjuk yta, till exempel en dammfri torka (figur 2D).
- Justera flödet klassar av fas-1 sprutpumpen till 35 µL/min. arbetar med ett körfält i taget, sätt inloppsnålen och sedan outlet nålen (dvskör till avfall bägaren; Figur 2E).
- Torka bort eventuella överskott medium med en ren dammfri torka och inspektera enheten för läckor. Undersöka outlet slangen för uppkomsten av överskjutande celler (vanligtvis visas som en grumlig Rand) och medelstora menisken, som kommer att långsamt gå mot avfall bägaren.
- Tillåta enheten att köra 35 µL/min för cirka 15-30 min, tills alla de anslutna köer avrinning till avfall bägaren.
- Ställ sprutpumpen fas-1-1,5 µL/min och pausa flödet. Ta hela pumpen och enheten apparaten till mikroskopet (denna process underlättas genom att placera den på en rullande vagn) och starta om fas-1 medium flöde vid 1,5 µL/min. Montera försiktigt scenen skäret med enheten på en inverterad fluorescens Mikroskop, använder tejp som behövs för att dirigera den inlopp och utlopp slang.
- Leta upp önskade positioner på enheten för avbildning och påbörja imaging som önskas. Observera att cellerna kräver normalt några timmar (ca 10 generationer) att nå steady state exponentiell fas tillväxt och uppkomsten av bild förvärv kan fördröjas som önskas så att imaging börjar efter perioden Jämviktstiden.
Obs: Steady state tillväxten av celler i exponentiell fas bör kontrolleras under efterföljande bildanalys av spårning celldelning gånger och säkerställa att de har nått ett konstant minsta värde.
7. medelstora växling
- Mellan på varandra följande rundorna av imaging, pausa flödet av fas-1 sprutpumpen. Försiktigt lossa de bindemedel klipp från fas-2 silikon slangar, flytta varje att silikon slangar på fas-1 gren av Y korsningen. FN-paus flödet av fas-2 spruta pump (som var satt till 1,5 µL/min i steg 3.8) och fortsätta imaging.
Obs: vid 1,5 µm/min med en 10-cm längd av polymer slangar nedströms av Y korsningar, andra etappen mediet når enheten i ca 50 min. Tid att enheten kan testas empiriskt med media som innehåller fluorescerande spårämne partiklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik initial cell lastning, mätt med faskontrast mikroskopi innan du bifogar mikroflödessystem VVS enheten, skulle anses ha alla eller nästan alla av de mikroflödessystem sida kanaler som innehåller en eller flera bakterieceller ( Figur 3A). Optimal lastning skulle visa flera celler i varje kanal, men kanaler kommer ändå fylla med celler på grund av celltillväxt under perioden Jämviktstiden (figur 3B). Körfält med dålig lastning, där relativt få (< 50%) sida kanaler är laddade med celler, kan användas, men den resulterande data densiteten blir lägre på grund av färre cell härstamningar som avbildas på varje tänkbar position.
När enheten laddas inledningsvis, är det jämviktas genom att bifoga mikroflödessystem VVS och flyter medium genom enheten vid en relativt hög flödeshastighet av 35 µL/min. Jämviktstiden steget serverar bort luftbubblor och överskjutande celler i utfodring kanalen från enheten och att stimulera cellerna i de side kanalerna att börja odla. De celler som tas bort från enheten vid medelflöde kan ofta observeras med blotta ögat som ett ljust band flyttar genom outlet slangen mot avfallsbehållaren; förflyttning av sådana band fungerar som en visuell indikator som vätska flyter normalt genom VVS och enheten. Mikroskopisk undersökning av en skakad enhet bör avslöja några celler begränsas i GÅSMARSCH i de flesta av de side kanalerna (figur 3B, 0 min).
När en skakad enhet placeras på mikroskopet under flöde vid 1,5 µL/min vid 37 ° C, återupptas cellerna enhetliga och ständiga exponentiell fas tillväxt under loppet av cirka 2 h (figur 3B). Konstant exponentiell tillväxt bör kontrolleras direkt efter bildanalys av utseendet på en platå i generationstid celler. Vid denna punkt, är cellerna redo för fluorescens eller brightfield imaging som önskas. En lyckosam lastat och skakad enhet kan normalt avbildas tillförlitligt för perioder om minst 24 tim (figur 4A, C). Att införa en medellång switch (figur 4A–C) vidgar experiment som kan genomföras utan också ökar frekvensen av katastrofala celldöd-händelser (figur 4 d), förmodligen genom införandet av luft bubblor som inte var framgångsrikt rensats från slangen. En annan händelse som kan orsaka katastrofala celldöd är att kluster av celler som ligger vid inloppet kan bli rubbas och passera genom utfodring kanalen, som visas i figur 4 d. Vi förstår i dagsläget inte varför detta orsakar katastrofala celldöd i enheten, och vi har ännu inte utarbetat en metod för att förhindra att sådana händelser inträffar.
Figur 1: Schematisk av enhetens mikroflödessystem. En schematisk enhet visas ungefärligt till skala. Den alfabetiska beteckningen är märkt tillsammans med inlopp och utlopp zoner som stansas för att ansluta blunt-slutade nålar. Typiskt, hälften av de mönstrade kanalerna används (skuggade grå). Cell skyttegravarna är inriktade på beteckningen. Den tillhörande CAD-filen visar (se kompletterande fil 1) alla funktioner på enheten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: mikroflödessystem enhet passivering, cell lastning och Jämviktstiden. (A) A bundna enhet efter passivering med BSA-innehållande medium. Gel-lastning tips hålls i outlet hålen att övervaka passagen av medium och celler genom enheten. Den medelstora menisken är synlig i den tunna delen av gel-lastning tips (pil). (B) enheten efter cell lastning. Cellerna är synlig som ett genomskinligt vitt lager i gel-lastning tips (pil). (C), gel-lastning tips tas bort innan centrifugering i en anpassad-fabricerade centrifug adapter. Medicinsk tejp (blå) placeras på aluminium delar att dämpa enheten. (D) efter centrifugering och kontroll av lastning, enheten är tejpade på en Mikroskop scenen infoga och bifogas inlopp och utlopp stiften. I bilden visas, görs medellång växling möjligt genom slangventiler och Y-kopplingar som är ordnade i en apparat som gjort från en mikropipett tip låda. (E) Schematisk vy av en hela monterade enhet, från sprutan pumparna till avfallsbehållaren. Utlopp slangen går till en liten avfall bägare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Cell lastning och tillväxt i enhetens mikroflödessystem. (A) från vänster till höger, faskontrast micrographs av en enhet som innehåller medium bara innan cellen lastning, samma enhet efter celler har lagts till via pipettering men innan centrifugering och samma enhet efter centrifugal lastning. (B) tidsförloppet för cell anpassning och tillväxt i enheten (LB, 37 ° C, flöde 1,5 µL/min). I början av anpassning är stationär-fas cellerna relativt korta och smala. Som cellerna anpassa sig och återgå till exponentiell fas tillväxt (60-120 min), antar de en längre och bredare morfologi. Efter 120 min, alla celler i enheten återupptar enhetliga exponentiell fas tillväxt, och enheten är klar för avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Cell tillväxt och medium växling i enhetens mikroflödessystem. (A) Kymographs visar 550 min tillväxt före och 1 000 min tillväxt efter en medellång switch (grå streckad linje) till 2% etanol som en stressfaktor. Bilder fångades med 10 minuters mellanrum. Den övre panelen visar transkriptionell mNeonGreen reporter (grön kanal) för en stress-inducerade genen. Den nedre panelen visar en konstitutiv mNeptune reporter (röd kanal) som används i det här fallet för automatiserad cell segmentering. (B) Närbild Visa av portionr av kymographs i rutan streckad i panel A, visar en övergående reaktion i den gröna kanalen efter medellång växeln. Observera att tillväxten fortsätter genom växeln, även om förekomsten av etanol orsakar celler att bli kortare och växa i något långsammare takt. Tidsskalan visas av det vågräta fältet och avståndet visas av det lodräta strecket. (C) exempel spår av analyserade fluorescens data av en enda cell härstamning från experiment visas i panelen A. De vertikala streckade visar linjerna växeln medellång till 2% etanol som en stressfaktor. (D) exempel på en misslyckad medium switch. När det andra mediet når cellerna, är cellerna i kanalerna lyserat. Växeln är åtföljs av ett stort antal celler som klarar i huvudkanalen, orsakar en ljusa fluorescerande signal (en åter skalas bilden motsvarar regionen urtvättade visas precis ovanför det). Efter växeln observeras ingen ytterligare celler, trots svagt fluorescerande cellfragment kvar i kanalerna. Tidsskalan visas av det vågräta fältet och avståndet visas av det lodräta strecket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta mikrofluidik protokoll är flexibel i att många av stegen kan ändras för att optimera dess användning med en särskild art eller stam eller för ett specifikt syfte. Vi har faktiskt gjort ändringar av den ursprungliga ”mor maskin” concept4 att optimera dess användning med B. subtilisi detta protokoll. Skyttegravarna där cellerna är begränsade utgör ofta en enlagers funktion, medan i detta protokoll använder vi två-lagers cell diken, med ett grunt kanal som omger cellerna. Två-lagers konstruktion infördes som ett sätt att maximera flödet av näringsämnen till och metaboliter från B. subtilis celler, särskilt i långa (> 75 µm) skyttegravar5; men lager funktioner ofta räcka för optimal celltillväxt och används ofta för E. coli, särskilt när de är kortare (~ 25 µm)4. Vi använder vanligtvis längre diken, som de minska frekvensen med vilken B. subtilis cell kedjor, som uppstår stochastically, dras ur sina skyttegravar av medelstora flödet i den huvudsakliga utfodring kanal5.
Ytterligare kan ändringar, såsom användning av enheter med olika funktion dimensioner (t.ex., kanalbredder) eller egenskaper (t.ex., form, antal öppna ändar) ersättas vid behov. Exempelvis har användning av cell diken som är öppna i båda ändarna (snarare än bara ett slutet, som i detta protokoll) använts i andra studier1,20,21. Diken som är öppna i båda ändarna undvika cellen åldrande eftersom de är ständigt fylls med nyfödda celler (i motsats till mor maskiner, där den äldsta cellen spåras och nyare celler trycks ur kanal), även om det faktum att äldre celler skjuts ut båda ändar normalt begränsar deras observationella fönster till färre än 10 generationer1,21. Vi söker vanligtvis längre observationella Fönstren (hundratals generationer) erbjuds av en mor maskin, som gör det möjligt att åtgärden även minneslösa processer som väntetider är tiotals eller hundratals generationer längre5. Vi har också använt mor maskinkonstruktionen för att observera celler som inte växer exponentiellt, som i våra analyser av sporulering22. I sådana fall analyseras ytterligare celler i hela tillväxten diken kan vara meaningfully22.
Många av stegen i protokollet relativt förlåtande att de kan ändras utan att väsentligen påverka protokoll resultatet. Exempelvis en tidigare version av protokollet kallas för rengöring skyddsglaset genom sekventiell 10-min bad ultraljudsbehandling steg i 10 M KOH och sedan rent vatten, men vi hittade att bra enhet limning och drift uppnås med hjälp av den enklare isopropanol-baserade rengöring steg som beskrivs här. Om en bindning fråga uppstod att misstänkliggöra städningen av skyddsglaset, rekommenderas återgå till ett mer-stränga rengöring protokoll. På samma sätt, medan vi använder en centrifugeringssteget för att maximera cell laddar in i cellen diken, rimligen full lastning kan uppnås även utan detta steg, förutsatt att mycket koncentrerad celler används för lastning steg. Detta alternativ strategi kan vara särskilt användbar för forskare som inte har en lättillgänglig centrifug adapter att snurra enheten. Igen, olika koncentrationer av passivering/smörjning agent (BSA i detta protokoll) får användas. Vi använder rutinmässigt koncentrationer så hög som 1 mg/mL. I fall där en stam kan vara känsliga för BSA, kan godtagbart resultat uppnås även i avsaknad av ett passivt agent. Faktiskt, när vi använde en mikroflödessystem enhet för att undersöka sporulering, som kräver cell svält, vi var oroliga att BSA kan agera som en potentiell näringskälla för cellerna, och så vi utelämnas det från medelstora flödet utan att iaktta någon betydande biverkningar22.
Framför allt kan ett kontinuerligt flöde av medium genom enheten framkalla något olika fenotyper jämfört med celltillväxt i ett slutet system, till exempel en kolv. Till exempel näringsämnen eller sammansatta utarmning kan vara en utmaning då celler kan ofta rensa spår föreningar från medelstora flödet. Faktiskt har vi observerat att förmå cell sporulering via svält kräver längre tid i en mikroflödessystem enhet än i en kolv. Likaså har vi observerat att induktion av energi stress använder den oxidative phosphorylation decoupler karbonyl cyanid m-klorfenyl Hydrazon (CCCP) kräver several-fold högre koncentrationer i ultrakalla enheten än vad som rapporterats i kolven kultur 23. därför vissa optimering kan krävas för att uppnå tillfredsställande resultat med olika medium tillsatser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt har finansierats av National Institutes of Health under GM018568. Detta protokoll utfördes delvis på Center för nanoskala system (CNS), en medlem av den nationella nanoteknik samordnad infrastruktur Network (NNCI), som stöds av National Science Foundation under NSF award nr 1541959. CNS är en del av Harvard University. Många tack är på grund av Thomas Norman och Nathan Herre för deras arbete med att utforma och tillverka huvudmallen används för de enheter som visas här och bygga den ursprungliga versionen av apparaten. Vi tackar Johan Paulsson för hans värdefulla collaborative råd och tacka medlemmarna i hans labb för deras råd och fortsatta förbättringar av bakteriell mikroflödessystem apparaturar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
References
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), Basel. 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps". MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
