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Cancer Research

जीनोम चौड़ा RNAi स्क्रीनिंग मेजबान कारकों है कि Oncolytic वायरस थेरेपी मिलाना की पहचान करने के लिए

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/56913
Automatic Translation
1,2, 1,4, 1, 1, 1,2,3
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Summary

यहां हम उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीनिंग को रोजगार के लिए मेजबान लक्ष्य है कि oncolytic वायरस चिकित्सा, विशेष रूप से rhabodvirus और vaccinia वायरस चिकित्सा बढ़ाने के हेरफेर किया जा सकता है उजागर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, लेकिन यह आसानी से अंय oncolytic के लिए अनुकूलित किया जा सकता है वायरस प्लेटफार्मों या आम तौर पर वायरस प्रतिकृति मिलाना मेजबान जीन की खोज के लिए.

Abstract

उच्च प्रवाह जीनोम-वाइड RNAi (आरएनए हस्तक्षेप) स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकी व्यापक रूप से होस्ट कारकों है कि प्रभाव वायरस प्रतिकृति की खोज के लिए इस्तेमाल किया गया है । यहां हम मेजबान लक्ष्य है कि विशेष रूप से Maraba वायरस, एक oncolytic rhabdovirus, और चिकित्सा बढ़ाने के लक्ष्य के साथ vaccinia वायरस की प्रतिकृति मिलाना उजागर करने के लिए इस प्रौद्योगिकी के आवेदन प्रस्तुत करते हैं । जबकि प्रोटोकॉल oncolytic Maraba वायरस और oncolytic vaccinia वायरस के साथ प्रयोग के लिए परीक्षण किया गया है, इस दृष्टिकोण अन्य oncolytic वायरस के लिए लागू है और भी मेजबान लक्ष्य है कि में स्तनधारी कोशिकाओं में वायरस प्रतिकृति मॉडुलन की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता है सामान्य. इस प्रोटोकॉल स्तनधारी कोशिकाओं में उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीनिंग के लिए एक परख के विकास और सत्यापन का वर्णन करता है, प्रमुख विचार और तैयारी एक प्राथमिक उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीन के संचालन के लिए महत्वपूर्ण कदम है, और के लिए एक कदम दर कदम गाइड एक प्राथमिक उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीन का आयोजन; इसके अलावा, यह मोटे तौर पर माध्यमिक स्क्रीन सत्यापन और तृतीयक सत्यापन अध्ययन के संचालन के लिए तरीकों की रूपरेखा । उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीनिंग का लाभ यह है कि यह एक कैटलॉग करने के लिए अनुमति देता है, एक व्यापक और निष्पक्ष फैशन में, मेजबान कारकों है कि वायरस प्रतिकृति के किसी भी पहलू है जो एक के लिए एक विकसित कर सकते है मॉडुलन के रूप में ऐसे infectivity के रूप में इन विट्रो परख, आकार फट, और cytotoxicity । यह वर्तमान ज्ञान के आधार पर अप्रत्याशित चिकित्सकीय लक्ष्यों को उजागर करने की शक्ति है ।

Introduction

उच्च प्रवाह जीनोम-वाइड RNAi स्क्रीनिंग वायरस जीव विज्ञान सहित अध्ययन के विविध क्षेत्रों में जैविक अंतर्दृष्टि खुलासा करने के लिए एक अमूल्य उपकरण साबित हो गया है । पिछले एक दशक से अधिक या तो, कई समूहों सेल आधारित बड़े पैमाने पर RNAi स्क्रीनिंग के लिए बड़े पैमाने पर मेजबान जीन है कि वायरस प्रतिकृति मॉडुलन की पहचान (1,2,3,4 में समीक्षा की गई , 5 , ६ , 7). दिलचस्प है, इन स्क्रीन की एक बड़ी संख्या में कैंसर की कोशिकाओं में आयोजित किया गया है और वायरस है कि वर्तमान oncolytic वायरस के साथ कई vaccinia वायरस8,9,10 सहित उंमीदवारों , Myxoma वायरस11, दाद सिंप्लेक्स वायरस12, vesicular stomatitis वायरस13,14, और Maraba वायरस15. हालांकि इन अध्ययनों के बहुमत का ध्यान मेजबान कारकों की पहचान है कि वायरस प्रतिकृति के कुछ पहलू को प्रभावित करने और oncolytic वायरस थेरेपी को बढ़ाने के लिए, मूल्यवान डेटा इन डेटा सेट से खनन किया जा सकता है पर नहीं है पर था इस संबंध में । यह स्पष्ट है कि शक्तिशाली क्षमता मेजबान लक्ष्य है कि oncolytic वायरस चिकित्सा को बढ़ाने के लिए हेरफेर किया जा सकता है की पहचान करने के लिए पूरी तरह से शोषण नहीं किया गया है ।

oncolytic वायरस प्लेटफार्मों की बहुतायत वर्तमान में दाद सिंप्लेक्स वायरस, reovirus और vaccinia वायरस है, जो देर चरण नैदानिक परीक्षणों में प्रत्यक्ष सफलता मिली है सहित पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययन में परीक्षण किया जा रहा है । इन प्लेटफार्मों के बहुमत के लिए, प्रयास करने के लिए चिकित्सा बढ़ाने के वायरस जीनोम फेरबदल की ओर निर्देशित किया गया है । उदाहरण के लिए, ट्यूमर विशिष्टता बढ़ाने के लिए, विशिष्ट वायरस जीन हटा दिया गया है या काफी सामान्य कोशिकाओं में वायरल प्रतिकृति प्रतिबंधित करने के लिए रूपांतरित, लेकिन ट्यूमर कोशिकाओं में नहीं. कुछ मामलों में, transgenes को प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या NIS (सोडियम आयोडाइड symporter) शक्ति प्रदान करने के लिए जीएम-सीएसएफ (granulocyte मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर) की तरह जोड़ा गया है vivo इमेजिंग और सेलुलर radioiodide में सक्षम करने के लिए उपचारात्मक प्रयोजनों. हालांकि, वहां बहुत कम मेजबान/ट्यूमर जीन जोड़ तोड़ और oncolytic वायरस प्रतिकृति पर मेजबान/ट्यूमर जीन के प्रभाव की खोज पर ध्यान केंद्रित काम किया गया है । उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकी के आगमन के साथ, यह अब एक जीनोम पैमाने पर जांच मेजबान वायरस बातचीत करने के लिए संभव है और करने के लिए मेजबान जीनोम में हेरफेर करने के लिए oncolytic वायरस थेरेपी (16में समीक्षित में सुधार के अवसरों को समझने के लिए, 17,18).

हम पहले के सबूत का प्रदर्शन अध्ययन की रिपोर्ट उच्च प्रवाह आनुवंशिक स्क्रीनिंग का उपयोग करने के लिए मेजबान लक्ष्य है कि oncolytic वायरस चिकित्सा बढ़ाने के हेरफेर किया जा सकता है की पहचान के लिए अवधारणा । मेजबान जीन है कि Maraba वायरस oncolysis, एक oncolytic वर्तमान में चरण मैं और द्वितीय परीक्षण में परीक्षण किया जा रहा है, हम तीन अलग ट्यूमर सेल लाइनों भर में एक RNAi (लघु सेना आरएनए) के साथ डुप्लिकेट में जीनोम चौड़ा सिरना स्क्रीन आयोजित की खोज पुस्तकालय लक्ष्यीकरण १८,१२० जीन15। स्क्रीन में पहचान की हिट के मार्ग विश्लेषण एर (endoplasmic जालिका) तनाव प्रतिक्रिया रास्ते के सदस्यों के संवर्धन का पता चला । हम प्राथमिक स्क्रीन के उन लोगों से अलग लक्ष्यीकरण दृश्यों के साथ सिरना का उपयोग कर माध्यमिक सत्यापन के लिए इन रास्ते के भीतर 10 हिट का चयन किया. तृतीयक मांयता के भाग के रूप में, हम IRE1α के साथ एक बचाव प्रयोग (inositol-एंजाइम 1 अल्फा की आवश्यकता) की पुष्टि करने के लिए कि हिट लक्ष्य पर किया गया था आयोजित की । इन विट्रो में और vivo में IRE1α का एक छोटा सा अणु अवरोधक का उपयोग कर परीक्षण नाटकीय रूप से बढ़ाया oncolytic प्रभावकारिता के परिणामस्वरूप ।

Workenhe एट अल. 12 भी एक जीनोम-वाइड RNAi स्क्रीन का उपयोग कर एक परित lentiviral shRNA (लघु hairpin आरएनए) पुस्तकालय लक्ष्यीकरण १६,०५६ जीन मानव दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रकार 1 (एचएसवी-1) उत्परिवर्ती KM100-मध्यस्थता oncolysis के सीमित कारकों की पहचान करने के लिए स्तन कैंसर की कोशिकाओं । प्राथमिक स्क्रीन में, वे 343 जीन की पहचान की पछाड़ना जो नकली संक्रमित कोशिकाओं पर KM100-संक्रमित कोशिकाओं के बढ़ाया cytotoxicity के लिए सीसा; वे माध्यमिक सत्यापन के लिए इन जीन के 24 का चयन किया । 24 जीनों में से, 8 जीन माध्यमिक स्क्रीन में उनमें से एक के साथ पुष्टि की गई SRSF2 जा रहा है (serine/arginine-अमीर ब्याह फैक्टर 2) जो बाद में तृतीयक सत्यापन के दौरान एक आनुवंशिक बचाव प्रयोग का उपयोग कर पुष्टि की थी । समूह के लिए एक डीएनए चतुर्थ तोपोइसोमेरसे अवरोध करनेवाला कीमोथेरेपी है कि SRSF2 के फास्फारिलीकरण कम की पहचान पर चला गया और पता चला कि इस अवरोधक के साथ एचएसवी-1 KM100 के संयोजन उपचार TUBO ट्यूमर असर चूहों के अस्तित्व को विस्तारित करने के लिए नेतृत्व.

aforementioned अध्ययन में, एक समान कार्यप्रवाह का पालन किया गया । प्रत्येक प्राथमिक जीनोम-वाइड RNAi स्क्रीन के साथ शुरू हुआ एक माध्यमिक स्क्रीन के द्वारा पीछा किया है की पहचान की हिट की संख्या का चयन करें प्राइमरी स्क्रीन में पहचाना । यह तृतीयक सत्यापन अध्ययन है, जो पुष्टि शामिल है कि हिट पर था परम मांयता के साथ इन विट्रो में आनुवंशिक बचाव प्रयोग प्रदर्शन से लक्ष्य vivo मेंलक्ष्य जीन उत्पाद जोड़ तोड़ द्वारा प्रदर्शन के बाद किया गया । इस अनुच्छेद में, हम पहले के विकास और सत्यापन के लिए एक सामांय प्रोटोकॉल प्रदान एक उच्च प्रवाह सिरना जांच परख है, जो इष्टतम अभिकर्मक शर्तों का निर्धारण शामिल है, वायरस की मात्रा, और संक्रमण की लंबाई । हम भी एक प्राथमिक एक उच्च प्रवाह सिरना स्क्रीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से माध्यमिक स्क्रीन मांयता और तृतीयक मांयता प्रदर्शन के लिए विधि का एक समग्र विवरण के संचालन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।

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Protocol

1. विकास और एक उच्च प्रवाह सिरना जांच परख के सत्यापन

नोट: सभी प्रयोगों के लिए, प्रत्येक कक्ष पंक्ति के लिए उपयुक्त Hepes-बफ़र्ड वृद्धि मीडिया का उपयोग करें । तृतीयक मांयता के लिए परख अनुकूलन से वर्कफ़्लो के ओवरव्यू के लिए चित्र 1 देखें ।

  1. इष्टतम अभिकर्मक शर्तों का निर्धारण
    1. एक ट्यूमर सेल लाइन या आदर्श कई ट्यूमर कोशिकाओं लाइनों का चयन करें जिसके साथ अभिकर्मक स्थितियों का अनुकूलन करने के लिए (उदा 786-O, NCI-H226, SF268, U373, OVCAR-8, U20S; सेल लाइंस के चयन पर और अधिक के लिए चर्चा देखें) ।
    2. एक अभिकर्मक एजेंट या परीक्षण के लिए कई का चयन करें । यह कई अभिकर्मक एजेंट का परीक्षण करने के लिए आवश्यक हो सकता है, के रूप में कुछ अधिक विषाक्त या किसी दिए गए सेल लाइन में दूसरों की तुलना में कुशल हो सकता है । इसके अलावा, ध्यान रखें कि कुछ वायरस के संक्रमण पर प्रभाव हो सकता है या इमेजिंग पर उच्च पृष्ठभूमि संकेत उत्पंन कर सकते हैं ।
    3. सकारात्मक पर फैसला [ई. जी. सिरना लक्ष्यीकरण PLK-1 (पोलो जैसे कळेनासे 1) mRNA, जो कोशिका मृत्यु लाती है] और नकारात्मक अभिकर्मक नियंत्रण (उदा गैर लक्ष्यीकरण सिरना) ।
    4. विशेष अभिकर्मक रिएजेंट के लिए रिवर्स अभिकर्मक प्रोटोकॉल का पालन करें, लेकिन अभिकर्मक रिएजेंट (जैसे 0.05, 0.1, 0.15 और 0.2 μL/well) और सेल सीडिंग घनत्व ( जैसे 625, 1250, 2500 कोशिकाओं/well) की मात्रा बदलती है । निम्न स्थितियों की प्रतिकृति शामिल करें: अनुपचारित कोशिकाओं, नकली transfected कोशिकाओं (यानी कोशिकाओं प्लस अभिकर्मक एजेंट), और कोशिकाओं सकारात्मक और नकारात्मक अभिकर्मक नियंत्रण सिरना के साथ transfected (एक नमूना प्लेट के लिए चित्रा 2a देखें लेआउट) ।
      1. सामांय में, 10 एनएम के अच्छी तरह से में एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक सिरना के 80 एनएम कमजोरियां तैयार (पुस्तकालय पर निर्भर करता है, सिरना की एक उच्च एकाग्रता की आवश्यकता हो सकती है) । जब तक अंयथा निर्दिष्ट, सिरना अभिकर्मक एजेंट मंदक के साथ पतला । अभिकर्मक एजेंट के कमजोर पड़ने तैयार करते हैं ।
      2. प्लास्टिक 5 μL के सिरना प्रति अच्छी तरह से पतला अभिकर्मक रिएजेंट के 5 μL द्वारा पीछा किया । इस कदम की सुविधा के लिए, एक U-नीचे 96-अच्छी तरह से थाली के एक कॉलम के साथ वितरित, सिरना घोला जा सकता है और अकेले सिरना मंदक (अनुपचारित और नकली transfected कोशिकाओं के लिए) । एक दूसरे कॉलम के साथ वितरित, पतला अभिकर्मक एजेंट और अभिकर्मक एजेंट मंदक अकेले (अनुपचारित कोशिकाओं के लिए) ।
        1. एक इलेक्ट्रॉनिक प्लास्टिक का उपयोग करना, प्लास्टिक 5 μL/अच्छी तरह से सिरना या सिरना मंदक वाले पहले स्तंभ की सामग्री के इसी कुएँ में 384-खैर प्लेट के बाद 5 μL/अच्छी तरह से पतला अभिकर्मक रिएजेंट या अभिकर्मक रिएजेंट मंदक से दूसरा कॉलम ।
      3. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए १०२६ x g पर प्लेटें केंद्रापसारक, और समय के लिए अभिकर्मक एजेंट के लिए निर्धारित मशीन (उदा 5-20 मिनट) ।
      4. जबकि प्लेटें मशीनिंग हैं, विभिन्न घनत्व के सेल सस्पेंशन तैयार करते हैं । प्लास्टिक के 30 μL के अनुसार सेल सस्पेंशन । मशीन में प्लेटें रखने से पहले, प्लेटें 45-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने के लिए अनुमति देने के लिए कक्षों की वर्दी बसने के लिए19।
        नोट: अगर सिरना के साथ अभिकर्मक रिएजेंट के लिए निर्धारित मशीन अवधि कम है, तो मशीन से पहले सेल सस्पेंशन तैयार करें ।
      5. पछाड़ना की वांछित लंबाई के आधार पर 48 से 72 एच के लिए मशीन स्क्रीन के लिए चुना ।
    5. एक फिक्सिंग और धुंधला formaldehyde, Hoechst ३३३४२ और पंजाबियों से मिलकर समाधान तैयार (फास्फेट-बफर खारा) के लिए एक अच्छी तरह से 4% formaldehyde और 5 यूजी/Hoechst ३३३४२ की मिलीलीटर में एक अंतिम एकाग्रता के लिए । आवश्यकतानुसार, एक उच्च (जैसे 7.5 यूजी/एमएल) या कम एकाग्रता (जैसे Hoechst के 2 यूजी/एमएल) का प्रयास करें यदि संकेत बहुत कमजोर है या बहुत मजबूत है, क्रमशः ।
    6. फिक्सिंग और दाग समाधान के 30 μL सभी कुओं में सीधे वितरण । 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्लेटें । 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों की दुकान । एक गैर-फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं, तो एक प्लेट वॉशर का उपयोग कर पंजाबियों के साथ प्लेट धोने; ज्यादातर मामलों में, धोने अनावश्यक है जब एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ।
    7. प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या यों तो एक स्क्रिप्ट विकसित करना ।
      नोट: कई सॉफ्टवेयर suites इस प्रयोजन के लिए उपलब्ध है और कर रहे हैं, जबकि प्रत्येक लिपियों सृजन के विभिंन तरीके हो सकते हैं, वे सब आम तौर पर नाभिक, कोशिकाओं और ब्याज के क्षेत्रों की पहचान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तीव्रता की गणना का एक साधन है और रूपात्मक गुण आहेत. जब एक स्क्रीनिंग स्क्रिप्ट के विकास, यह करने के लिए थाली प्रति स्क्रिप्ट चलाने के लिए और शायद केवल आवश्यक माप को कम करने के लिए प्रसंस्करण समय शामिल करने के लिए आवश्यक समय पर विचार महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, कोशिका संख्या यों तो, एक एक निर्दिष्ट तीव्रता से ऊपर अच्छी तरह से प्रति Hoechst क्षेत्र की गणना हो सकता है; और वायरस फैल यों तो, एक एक निर्दिष्ट तीव्रता से ऊपर अच्छी तरह से प्रति GFP (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) क्षेत्र की गणना हो सकती है । "नीचे pared" स्क्रिप्ट के लिए और अधिक विस्तृत स्क्रिप्ट की तुलना में कोई आवश्यक जानकारी सुनिश्चित करने की आवश्यकता होगी खो दिया है ।
    8. परिणामों का विश्लेषण करने के लिए इष्टतम अभिकर्मक स्थितियों का निर्धारण, कि अभिकर्मक एजेंट राशि और कोशिका बोने घनत्व है कि महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु (0-30% सेल अस्तित्व) में परिणाम है और न्यूनतम कोशिकाओं को विषाक्त है (उदा. 90-100% सेल अस्तित्व) । नोट: यह लंबे समय दोहरीकरण के साथ सेल लाइनों में सेल मौत phenotype निरीक्षण करने के लिए अधिक समय लग सकता है । प्रतिनिधि परिणामों के लिए चित्र 2 बी और 2c देखें. इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि गैर लक्ष्यीकरण सिरना के साथ transfected कोशिकाओं लगभग 90-100% निर्धारण के समय में धाराप्रवाह है के रूप में एक पर बाद में एक कोशिकाओं है कि इस प्रवाह के संक्रमित करना चाहते है जाएगा ।
  2. वायरस और संक्रमण की लंबाई की इष्टतम राशि का निर्धारण
    1. ऊपर बताए गए अनुसार समान रिवर्स अभिकर्मक चरणों को निष्पादित करें (देखें 1.1.4.1 to 1.1.4.4); हालांकि, केवल इष्टतम अभिकर्मक स्थितियों का उपयोग करें (1.1.8 देखें) (उदा. 786-O कोशिकाओं के लिए: 1500 कोशिकाओं/अच्छी तरह से और 0.05 μL/RNAiMAX की अच्छी तरह से) और, इसके अलावा, अतिरिक्त कुओं वायरस से संक्रमित होने के लिए [जैसे अनुपचारित कोशिकाओं के साथ कुओं, नकली शामिल transfected कोशिकाओं, गैर-लक्ष्यीकरण सिरना के साथ transfected कोशिकाओं, और कोशिकाओं को सकारात्मक वायरस नियंत्रण के साथ transfected अगर लोग (यानी सिरना लक्ष्यीकरण मेजबान जीन है कि या रोकना होगा प्रतिकृति को बढ़ावा देने के) जाना जाता है] ।
      1. एक नमूना प्लेट लेआउट के लिए चित्र 3 ए देखें । 48-72 एच के लिए मशीन ।
    2. एक oncolytic एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन (जैसे कि GFP) (MOIs) संक्रमण की बहुलता की एक सीमा के साथ व्यक्त वायरस के साथ अतिरिक्त वायरस कुओं को संक्रमित (०.००१ 10 केउदा ; चुना सीमा प्रतिरोध या सेल लाइन की संवेदनशीलता के स्तर पर निर्भर करेगा.) । साथ ही संक्रमित कुओं को भी शामिल करें । प्लास्टिक के 40 μL प्रत्येक वायरस कमजोर पड़ने के प्रति अच्छी तरह से 80 μL के एक अंतिम मात्रा के लिए । 400 x जी में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रत्येक थाली केंद्रापसारक ।
    3. निंनलिखित संक्रमण, छवि कोशिकाओं को एक उच्च सामग्री के साथ रहते हैं, नियमित अंतराल पर स्वचालित माइक्रोस्कोप (उदा हर 4-8 ज) । चित्र और 3सी देखें ।
    4. एक स्क्रिप्ट विकसित करने के लिए वायरस फैल (जैसे GFP क्षेत्र के प्रति अच्छी तरह से) (1.1.7 देखें) । छवियों का विश्लेषण और एक समय-बिंदु और एक MOI है कि वृद्धि और प्रसार में कमी का पता लगाने के लिए अनुमति का चयन करें । एक रैखिक सीमा के भीतर समय बिंदु और MOI गिरावट सुनिश्चित करने के लिए प्रसार में छोटे परिवर्तन का पता लगाने की सुविधा । दिए गए समय-बिंदु और MOI के लिए z-कारक (या z ') का अनुमान लगाएं ।
      नोट: अनुमानित Z-फैक्टर = 1-3 (σp + σn)/| μp-μn|, जहां σपी सकारात्मक वायरस नियंत्रण का नमूना मानक विचलन है और σएन नकारात्मक वायरस का नमूना मानक विचलन है नियंत्रण; और μp धनात्मक वायरस नियंत्रणों का नमूना माध्य है औरn ऋणात्मक नियंत्रणों का नमूना माध्य है । एक अनुमानित Z-0.5-1.0 के कारक एक उत्कृष्ट परख और स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त20,21माना जाता है ।
    5. नकारात्मक वायरस नियंत्रण सिरना यह नकली transfected और अनुपचारित कुओं के लिए तुलना करके वायरस प्रतिकृति पर कोई प्रभाव नहीं है कि की पुष्टि करें । यह अक्सर कुछ नकारात्मक सिरना नियंत्रण वायरस प्रतिकृति पर प्रभाव कर सकते हैं के रूप में एक से अधिक नकारात्मक नियंत्रण परीक्षण करने के लिए आवश्यक है ।
  3. उच्च प्रवाह जांच परख के अंतिम मांयता
    1. दोहराएं चरण 1.2.1 और ऊपर 1.2.2, लेकिन केवल इस समय इष्टतम MOI के साथ कोशिकाओं को संक्रमित । लाइव इमेजिंग के बजाय, फिक्स और प्लेट दाग (के रूप में 1.1.5 और 1.1.6 में वर्णित) इष्टतम समय बिंदु पर (1.2.4 देखें) ।
    2. छवि थाली । एक ही स्क्रिप्ट है कि स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा का उपयोग कर परिणामों का विश्लेषण (1.1.7 और 1.2.4 देखें) । अभिकर्मक स्थितियों की पुष्टि करें (अर्थात कुओं में गुड पछाड़ना transfected सकारात्मक अभिकर्मक नियंत्रण के साथ और transfected में न्यूनतम विषाक्तता नकारात्मक अभिकर्मक नियंत्रण के साथ). परख की मजबूती निर्धारित करने के लिए Z-कारक का अनुमान (1.2.4 देखें) ।
  4. इसके अलावा परीक्षण और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के संचालन के लिए विचार
    1. परीक्षण microtiter प्लेटों के स्थायित्व के रूप में कुछ प्लेटें केंद्रापसारक के दौरान दरार हो सकती है, खासकर जब पलकों पर रखा जाता है और कई प्लेटें एक बार में केंद्रापसारक हैं । खुर को कम करने के लिए, पलकों के बिना केंद्रापसारक (प्रदान की प्लेटों जवानों है), या प्लेटों की संख्या कम बाल्टी प्रति केंद्रापसारक ।
    2. समय के साथ अभिकर्मक रिएजेंट मिश्रण की स्थिरता का परीक्षण । एक बार अभिकर्मक एजेंट प्लेटों में जोड़ा जाता है, वहां कोशिकाओं के अलावा पहले एक महत्वपूर्ण देरी हो सकती है; इसलिए समय की अवधि को जानना जरूरी है, जिसके लिए अभिकर्मक रिएजेंट मिश्रण कारगर रहेगा । स्क्रीन के लिए, यह प्लेटों के लिए अभिकर्मक एजेंट मिश्रण जोड़ने के अग्रिम में कोशिकाओं को तैयार करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
    3. तरल मशीन का उपयोग करने के लिए तैयार । निर्धारित करने के लिए अभिकर्मक एजेंट, कोशिकाओं, वायरस, और खाते में मात्रा कि टयूबिंग रखती है, मात्रा पूर्व के लिए खो वितरण (यदि इकाई इस सुविधा है), और अवशिष्ट मात्रा के लिए इस्तेमाल की बोतलों में आवश्यक लेने के वितरण के लिए आवश्यक मात्रा का निर्धारण औषधालय.
      1. सेट और प्रोग्राम है कि अभिकर्मक एजेंट, कोशिकाओं, और वायरस के वितरण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा परीक्षण । अभिकर्मक रिएजेंट की हानि को कम करने के लिए, सीमा, यदि संभव हो तो, पूर्व औषधालयों की संख्या । तरल मशीन जांच और इसकी सटीकता और परिशुद्धता परीक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना ।
    4. अभिकर्मक रिएजेंट, कोशिकाओं और वायरस के थोक वितरण के लिए तैयार
      1. पहले प्लेटों की संख्या का निर्धारण एक बैच में संसाधित किया जा करने के लिए कोशिकाओं है कि एक बार में trypsinized किया जा सकता है की प्लेटों की संख्या पर विचार feasibly, microtiter प्लेटों की संख्या है कि एक बार में किया जा सकता है, समय की लंबाई एक बैच की प्रक्रिया की आवश्यकता तरल मशीन के साथ प्लेटें, और भी इमेजिंग के लिए आवश्यक समय । नोट: आम तौर पर, एक समय में लगभग 30 प्लेट प्रसंस्करण काफी संभव है और प्रसंस्करण प्लेटों के 3 बैचों एक दिन में प्रबंधनीय है ।
      2. Empirically प्लेट्स के एक बैच को संसाधित करने के लिए आवश्यक अभिकर्मक रिएजेंट की मात्रा सत्यापित करें । परीक्षण कि इस मात्रा आसुत पानी की 5 μL एक प्लेट भर में कई बार एक बैच प्रक्रिया करने के लिए आवश्यक हो जाएगा कि समय के बराबर संख्या के वितरण के द्वारा पर्याप्त है ।
      3. कोशिकाओं का भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए, प्लेटों के एक बैच में कोशिकाओं को वितरित करने के लिए आवश्यक समय का अनुमान । एक बैच के लिए आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा युक्त एक बोतल तैयार है, और एक समय में एक थाली के कई स्तंभों में कोशिकाओं को बांटना, समय के एक ही पाठ्यक्रम पर नियमित अंतराल पर यह प्लेटों के एक बैच भर में वितरण करने के लिए ले जाएगा । परीक्षण कितनी बार यह कोशिकाओं का मिश्रण करने के लिए आवश्यक हो जाएगा कोशिकाओं का एक भी वितरण बनाए रखने के लिए.
      4. वायरस के भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए, ऊपर के रूप में एक ही प्रक्रिया को दोहराने (1.4.4.3 देखें), लेकिन इस बार धाराप्रवाह कुओं पर वायरस वितरण । यदि वायरस समान रूप से वितरित नहीं है, शंकु ट्यूबों में वायरस की तैयारी पर विचार और वितरण करने से पहले प्रत्येक ट्यूब भंवर ।
    5. स्क्रीन के लिए पर्याप्त कक्षों को बढ़ाने के लिए समयरेखा को निर्धारित करने के लिए कक्षों की वृद्धि को ट्रैक करें । इसके अलावा, कोशिकाओं है कि लॉग चरण में बढ़ रही कोशिकाओं की थाली प्रति काटा जा सकता है क्रम में स्क्रीन के लिए आवश्यक संख्या का अनुमान लगाने में सक्षम होने की औसत संख्या का निर्धारण ।
  5. उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए अंतिम तैयारी कदम
    1. स्क्रीनिंग शुरू करने के लिए एक महीने पहले तक, स्क्रीन के लिए आवश्यक सामग्री के सभी निर्धारित करते हैं । किसी भी आवश्यक एजेंट आदेश (सामग्री देखें) । सुनिश्चित करें कि वायरस के लिए आवश्यक राशि हाथ पर है (अधिमानतः, एक ही शेयर है कि अनुकूलन के दौरान इस्तेमाल किया गया था का उपयोग करें.) ।
    2. शुरू करने के लिए दो सप्ताह पहले स्क्रीनिंग, गल और स्क्रीन के लिए आवश्यक कोशिकाओं को बड़े हो जाओ । केंद्रापसारक और वर्ग केंद्रापसारक बाल्टी की उपलब्धता सुनिश्चित करें ।
    3. पहले सप्ताह के दौरान स्क्रीनिंग शुरू करने के लिए, रिवर्स अभिकर्मक और संक्रमण, 70% इथेनॉल, 2x अभिकर्मक रिएजेंट मंदक (2x Opti-मेम), यदि आवश्यक हो (उदा के लिए मीडिया की बोतलें तैयार अगर सिरना पुस्तकालय में पतला है जैसे RNase-मुफ्त पानी, एक transfect कोशिकाओं के लिए 2x का उपयोग करना चाहते हैं), और वायरस के aliquots (प्लेटों के बैच प्रति एक) होगा । कक्षों की स्थिति की जांच करें ।
      1. Hoechst ३३३४२ दाग (जैसे 5 मिलीग्राम/एमएल) के शेयर समाधान तैयार करें । एक संतुलन प्लेट तैयार अगर एक केंद्रापसारक के लिए आवश्यक हो जाएगा ।
      2. सुनिश्चित करें कि प्लेट वॉशर अच्छा काम कर क्रम में है अगर यह प्रयोग किया जाएगा । सुनिश्चित करें कि तरल मशीन ठीक से तुले और सही और ठीक तिरस्कृत है । इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि कार्यक्रम ठीक से तरल मशीन पर सेट कर रहे हैं ।

2. प्राथमिक उच्च प्रवाह स्क्रीन का आयोजन

नोट: RNAi स्क्रीन शुरू करने से पहले, microtiter प्लेट्स (उदा 384-वेल प्लेट्स) को सिरना लाइब्रेरी और स्क्रीनिंग कंट्रोल्स के साथ array करने की जरूरत है । निंनलिखित कदम सबसे अच्छा एक व्यक्ति के साथ दो व्यक्तियों द्वारा आयोजित (यानी एक व्यक्ति है) मुख्य रूप से प्लेटों में अभिकर्मक रिएजेंट और कोशिकाओं के वितरण के लिए जिंमेदार जा रहा है, और दूसरा व्यक्ति (यानी व्यक्ति बी) के लिए जिंमेदार जा रहा है अभिकर्मक करने के लिए और कोशिकाओं को तैयार करने के लिए तुरंत पहले प्लेटों केंद्रापसारक । कोष्ठकों में शामिल 33 प्लेटों के एक बैच के प्रसंस्करण के लिए कुछ विशेष हैं (यानी लाइब्रेरी के आधे) 786-O सेल लाइन के साथ.

  1. रिवर्स अभिकर्मक के लिए तैयारी
    1. व्यक्ति एक: प्लेस पर्याप्त मीडिया, trypsin और पंजाबियों के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में प्लेटों के एक बैच प्रक्रिया आवश्यक है । वैकल्पिक: कोशिकाओं की एक प्लेट Trypsinize, और प्रति थाली कोशिकाओं की संख्या गिनती क्रम में बैच प्रति आवश्यक प्लेटों की संख्या का एक वास्तविक समय का अनुमान प्रदान करने के लिए ।
    2. प्लेटों (जैसे 33 प्लेट्स) के फ्रीजर से एक बैच प्राप्त करें और प्लेटों को ठंढ की अनुमति देने के लिए 20-30 मिनट प्रतीक्षा करें । जबकि प्लेटें, निंनलिखित चरणों के साथ जारी रखें ।
      1. व्यक्ति एक: 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में प्लास्टिक प्लेटों के एक बैच (जैसे 2 x ३७.१२५ एमएल) प्रसंस्करण के लिए आवश्यक अभिकर्मक रिएजेंट मंदक की राशि और उन्हें एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह है । 70% इथेनॉल (जैसे 250-500 मिलीलीटर की बोतलें) के साथ दो बोतलें भरें । पंजाब के साथ २ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों भरें और आसुत जल के साथ एक ।
      2. एक व्यक्ति: 70% इथेनॉल की एक बोतल में तरल मशीन टयूबिंग विसर्जित कर दिया । अगर सुझावों के सभी अभिकर्मक एजेंट वितरण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाएगा (उदा अगर प्लेट के बाहरी कुओं का इस्तेमाल नहीं किया जा रहा है), अनावश्यक टयूबिंग पहले अलग । टयूबिंग के आसपास टेप मास्किंग का एक टुकड़ा प्लेस के नीचे बिंदु जो टयूबिंग बाँझ माना जा सकता है निशान । लगभग 25 मिलीलीटर के साथ प्रधानमंत्री । बोतल में अतिरिक्त इथेनॉल डालो खो मात्रा की जगह है । टयूबिंग 5 मिनट की एक ंयूनतम के लिए इथेनॉल में बैठते हैं ।
      3. Person B: कोशिकाओं को trypsinize करने के लिए तैयार. स्प्रे ऊतक संस्कृति (टीसी) हूड 70% इथेनॉल के साथ । स्प्रे और डाकू में कोशिकाओं को तैयार करने के लिए आवश्यक pipets, सुझावों, बोतलों और microfuge ट्यूबों जगह (2.2.1.1 और 2.2.1.2 देखें) । कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए १०२६ x g पर सेट में सील प्लेटें केंद्रापसारक । एक टीसी हुड में प्लेटों से ढक्कन हटा दें, अगर पहले से निर्धारित है कि प्लेटें केंद्रापसारक के दौरान दरार हो सकती है जब पलकों पर रखा जाता है (देखें 1.4.1) ।
    3. Person A: जवानों को प्लेट्स से हटा दें । इससे पहले, के दौरान या बाद में जवानों को हटा दिया गया है (आवश्यक गर्मी की लंबाई पर निर्भर करता है), प्लास्टिक अभिकर्मक रिएजेंट के लिए आवश्यक राशि (जैसे 375 μL/शंकु ट्यूबों में 0.05 μL की RNAiMAX के अंतिम एकाग्रता के लिए ट्यूब/ पूर्व गर्म अभिकर्मक एजेंट मंदक युक्त (जैसे ३७.१२५ एमएल/ट्यूब) ।
    4. ऊपर और नीचे 10 बार pipetting द्वारा मिश्रण । अभिकर्मक एजेंट के लिए निर्धारित समय के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी (उदा. 0-10 मिनट) इस्तेमाल किया जा रहा है ।
  2. रिवर्स अभिकर्मक
    1. क्या व्यक्ति बी निंनलिखित कार्यों को पूरा करें ।
      1. कक्षों को trypsinizing शुरू करें (उदा . 786-O कक्षों की 3 प्लेटें) । प्रत्येक थाली से मीडिया को महाप्राण । पंजाब के 9 मिलीलीटर के साथ कुल्ला । प्लास्टिक थाली प्रति trypsin की 3 मिलीलीटर । लगभग 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन मीडिया के 22 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को फिर से स्थगित । प्लास्टिक ऊपर और नीचे 10 बार ।
      2. प्रत्येक ऊतक संस्कृति की थाली से सेल निलंबन एक बाँझ बोतल में गठबंधन । सेल सस्पेंशन को पलटने से मिलाएं । प्लास्टिक 1 मिलीलीटर aliquots सेल निलंबन के दो अलग microfuge ट्यूबों में । प्रत्येक microfuge ट्यूब से एक नमूना निकालें और कोशिकाओं की गणना । सेल निलंबन की आवश्यकता घनत्व के लिए आवश्यक मात्रा की गणना (जैसे 1500 कोशिकाओं/), और पर्याप्त पतला सेल निलंबन (उदा 500 एमएल) तैयार करने के लिए प्लेटों के एक बैच में बांटना ।
    2. व्यक्ति बी के समानांतर में एक पूर्ण निंनलिखित कार्य करें
      1. खाली इथेनॉल के तरल मशीन टयूबिंग । प्रधानमंत्री पंजाब के लगभग 25 मिलीलीटर के साथ टयूबिंग, और फिर टयूबिंग खाली । सावधान रहना जब टयूबिंग हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए कि मास्किंग टेप है कि अभिकर्मक एजेंट और बाद में सेल निलंबन में डूब जाएगा नीचे टयूबिंग की धारा बाँझ रखा जाता है । प्लेटों है कि सुरक्षित रूप से एक अभिकर्मक रिएजेंट समाधान के शंकु ट्यूब के साथ किया जा सकता है के अलावा सेट करें ।
      2. प्लास्टिक अभिकर्मक एजेंट समाधान ऊपर और नीचे 10 बार । प्रधानमंत्री अभिकर्मक एजेंट समाधान के साथ टयूबिंग । करने के लिए बस पर्याप्त समाधान के साथ अभिकर्मक एजेंट, प्रधानमंत्री के नुकसान को कम करने के लिए बमुश्किल सुझाव स्पष्ट है । तरल मशीन पर सही कार्यक्रम का चयन करें और अच्छी तरह से प्रति अभिकर्मक एजेंट के 5 μl वितरण ।
        चेतावनी: बारीकी से अभिकर्मक एजेंट के स्तर की निगरानी इतना है कि यह इससे पहले कि यह बाहर चलाता मंगाया जाता है । प्लेटों कि अलग सेट कर रहे हैं के पूरा होने के लिए और अधिक अभिकर्मक एजेंट समाधान जोड़ने के लिए एक क्यू प्रदान करना चाहिए ।
      3. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए १०२६ x g पर प्लेटें केंद्रापसारक । इस बार पलकों पर हो जाएगा, तो यह एक समय में कम प्लेटों के लिए खुर को रोकने के लिए आवश्यक हो सकता है (बाल्टी प्रति 2 प्लेट्सउदा ) । अभिकर्मक एजेंट के लिए निर्धारित समय के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटें का इस्तेमाल किया जा रहा है (उदा 10-20 मिनट) ।
      4. इस मशीन के दौरान, खाली अभिकर्मक रिएजेंट समाधान की टयूबिंग, और यह एक पूर्ण 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब वाले पंजाब में जगह है । भड़काने और खाली करके पंजाब के लगभग 25 मिलीलीटर के साथ टयूबिंग कुल्ला ।
        1. यदि युक्तियों की अधिक से कोशिकाओं के वितरण के लिए इस्तेमाल किया जा रहे है अभिकर्मक एजेंट वितरण के लिए उपयोग किया गया, फिर से अप्रयुक्त टयूबिंग देते हैं, और फिर से 70% इथेनॉल के साथ पंजाबियों के साथ ट्यूबिंग धोने से पहले सभी टयूबिंग निष्फल (2.1.2.2 देखें) ।
      5. एक बार तैयार किया गया है सेल सस्पेंशन युक्त बोतल मिक्स । सेल निलंबन में टयूबिंग प्लेस, और पर्याप्त प्रधानमंत्री देखना है कि प्रत्येक टिप ठीक से तिरस्कृत है । सभी प्लेटों में सेल सस्पेंशन के प्रति अच्छी तरह से 30 μL को बांटें । यदि आवश्यक हो, तो नियमित अंतराल पर सेल सस्पेंशन को व्यवस्थित से बचने के लिए मिलाएं ।
        चेतावनी: कई बार मीडिया वाले निलंबन की बूंदें सुझावों के पक्ष से चिपक सकती हैं । जब यह मनाया जाता है, के रूप में संभव के रूप में जल्दी महाप्राण या 70% इथेनॉल में एक प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतक doused के साथ पोंछ ।
      6. सेल निलंबन की टयूबिंग खाली । पंजाबियों के लगभग 25 मिलीलीटर के साथ टयूबिंग कुल्ला, आसुत जल के लगभग 50 मिलीलीटर द्वारा पीछा किया ।
    3. प्लेटें मशीन के लिए प्लेटें लौटने से पहले कमरे के तापमान पर बोने की सेल के समय से 45-60 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें । जीन मुंह बंद करने की वांछित लंबाई के लिए एक परेशान मशीन में प्लेटें मशीन (48 एच उदा) (1.1.4.5 देखें) ।
  3. संक्रमण
    1. समय बचाने के लिए, दिन से पहले कोशिकाओं को संक्रमित, बाँझ बोतलों में प्लास्टिक मीडिया के प्रत्येक बैच संक्रमित कुओं के लिए मीडिया सहित प्लेटों के संक्रमित करने के लिए आवश्यक की सटीक राशि (उदा 2 x 350 मिलीलीटर और 2 x 50 एमएल के लिए 33 प्लेट्स) । इसके अलावा, सटीक और सटीकता के लिए तरल मशीन का परीक्षण, और यदि आवश्यक हो तो फिर से जांचना ।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया गर्म । 70% इथेनॉल, पंजाब के साथ २ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों और आसुत जल के साथ एक साथ दो बोतलें भरें । सत्यापित करें कि केंद्रापसारक कमरे के तापमान पर है ।
    3. 70% इथेनॉल के साथ टयूबिंग निष्फल, और पहले से वर्णित के रूप में पंजाबियों के साथ कुल्ला (2.1.2.2 और 2.2.2.1 देखें) । जबकि टयूबिंग इथेनॉल में बैठा हुआ है, प्लास्टिक वायरस पहले संक्रमण के लिए तैयार मीडिया युक्त बोतल में आवश्यक की सटीक मात्रा में (2.3.1 देखें) । 25 मिलीलीटर के साथ भड़काने और फिर खाली करने से पंजाबियों के साथ ट्यूबिंग कुल्ला ।
    4. मशीन से प्लेटें निकालें और उंहें टीसी हूड में जगह है । प्रधानमंत्री मीडिया के साथ टयूबिंग । संक्रमित नियंत्रण कुओं में मीडिया के 40 μL का वितरण । मीडिया की टयूबिंग खाली और 25 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ कुल्ला । (सावधानी के लिए 2.2.2.5 देखें)
    5. वायरस के मिश्रण के बाद, वायरस युक्त बोतल में टयूबिंग जगह है । प्लेटों में वायरस के 40 μl वितरण । कमरे के तापमान पर 400 x जी में 30 मिनट के लिए प्लेटें केंद्रापसारक । मशीन के लिए प्लेटें लौटें । समय की पहले से निर्धारित लंबाई के लिए प्लेटें (24 एचजैसे ) (1.2.4 देखें) के लिए मशीन ।
  4. फिक्सिंग और धुंधला कोशिकाओं
    1. समय बचाने के लिए, फिक्सिंग के लिए पहले दिन, फिक्सिंग और formaldehyde और पंजाबियों से युक्त समाधान की एक बोतल तैयार (4% formaldehyde की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 37% formaldehyde और पंजाब के 270 एमएल के 179 मिलीलीटर) प्लेटों के प्रत्येक बैच के लिए, लेकिन छोड़ Hoechst दाग. लाइट से दूर ज्वलनशील कैबिनेट में स्टोर ।
    2. 70% इथेनॉल और पंजाबियों के साथ टयूबिंग कुल्ला के रूप में पहले से वर्णित (2.1.2.2 और 2.2.2.1 देखें) । फिक्सिंग और दाग समाधान और मिश्रण करने के लिए Hoechst की आवश्यक मात्रा में जोड़ें (एक 5 मिलीग्राम/Hoechst के 7.5 μg के कुआं में एक अंतिम एकाग्रता के लिए/एमएल के 2.5 मिलीलीटर ।
    3. सभी प्लेटों में फिक्सिंग और धुंधला समाधान के 30 μL को बांटें । 30 मिनट के लिए मशीन में प्लेटें रखें । मशीन के बाद, जवानों को प्लेटों में लागू करें, और लाइट से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट्स को स्टोर करें । यदि आवश्यक हो तो प्लेटें धोएं (1.1.6 देखें) ।
  5. इमेजिंग और छवि विश्लेषण
    1. एक स्वचालित, उच्च सामग्री माइक्रोस्कोप के साथ प्लेटों छवि । पहले से निर्धारित सेटिंग्स का उपयोग करें, लेकिन पहले सेटिंग्स का परीक्षण सुनिश्चित करने के लिए कोई समायोजन करने की आवश्यकता है ।
    2. GFP (या अंय फ्लोरोसेंट रिपोर्टर) क्षेत्र और Hoechst क्षेत्र प्रति अच्छी तरह से पहले से विकसित लिपि का उपयोग (1.3.2 देखें) । पहले प्लेटों की एक मुट्ठी भर के साथ स्क्रिप्ट का परीक्षण करने के लिए अगर किसी भी मामूली संशोधनों के लिए बैच प्लेटों के सभी विश्लेषण से पहले किया जाना चाहिए निर्धारित करते हैं ।
    3. हिट्स की पहचान करें । नोट: मजबूत Z-स्कोर/MAD (माध्य निरपेक्ष विचलन) विधि अक्सर इस अंत की ओर उपयोग किया जाता है एक विधि है । आमतौर पर, > 2 या <-2 का स्कोर कट-नापसंद के रूप में सेट होता है । इस विधि का सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है जब सिरना नमूने यादृच्छिक रूप से प्लेटों में वितरित किए जाते हैं और नहीं, उदाहरण के लिए, फ़ंक्शन द्वारा समूहीकृत होते हैं क्योंकि नमूने वास्तविक नकारात्मक नियंत्रणों के रूप में उपयोग किए जाते हैं । साइटोटोक्सिक siRNAS बाहर फ़िल्टर के रूप में इन गैर करने की उंमीद होगी विशेष रूप से वायरस फैल कम (साइटोटोक्सिक हिट बाहर फ़िल्टरिंग पर अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें) ।

3. टीआरसी (RNAi कंसोर्टियम) shRNA पुस्तकालय के साथ हिट की माध्यमिक स्क्रीन सत्यापन

नोट: माध्यमिक मांयता और संभव स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकियों के लिए हिट का चयन करने पर विवरण के लिए चर्चा देखें । यदि सिरना प्रौद्योगिकी माध्यमिक सत्यापन के लिए चयनित है, एक ही परख विकास और मांयता प्रोटोकॉल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है प्राथमिक स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया गया (1 देखें) ।

  1. ग्लिसरॉल स्टॉक्स के रूप में रुचि के उंमीदवार जीन लक्ष्यीकरण एक कस्टम टीआरसी shRNA पुस्तकालय प्राप्त करें ।
  2. ग्लिसरॉल स्टॉक्स से अभिकर्मक क्वालिटी प्लाज्मिड डीएनए तैयार करें । नोट: एक विस्तृत प्रोटोकॉल (यानी "shRNA/sgRNA/ओआरएफ ग्लिसरॉल और प्लाज्मिड डीएनए तैयारी") यहां पाया जा सकता है: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols ।
  3. डीएनए plasmids के साथ ब्याज की जीन लक्ष्यीकरण shRNA व्यक्त lentiviruses उत्पादन । नोट: 96 में lentivirus उत्पादन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल-अच्छी तरह से प्लेटें [अर्थात "shRNA/sgRNA/ओआरएफ उच्च प्रवाह वायरल उत्पादन (96 अच्छी तरह से)"] यहां पाया जा सकता है: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols ।
  4. lentiviruses के साथ कोशिकाओं को संक्रमित । नोट: एक विस्तृत प्रोटोकॉल 96 में lentiviral संक्रमण के लिए-well प्लेट्स (यानी "lentiviral संक्रमण") http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral पर ऑनलाइन उपलब्ध है % 2 0 संक्रमण% 2 0 200909. pdf ।
  5. oncolytic वायरस के साथ संक्रमित कोशिकाओं को या तो निम्नलिखित puromycin चयन (चयन प्रोटोकॉल के लिए 3.4 देखें) सफलतापूर्वक transduced कोशिकाओं या transduction (puromycin चयन के बिना) के तुरंत बाद. वायरस के इष्टतम राशि और वायरस के साथ मशीन की लंबाई निर्धारित करने के लिए, प्राथमिक स्क्रीन के लिए इस्तेमाल एक ही विधि का उपयोग करें ।

4. तृतीयक मान्यता

नोट: तृतीयक मान्यता का उद्देश्य मुख्य रूप से हिट लक्ष्य पर है कि पुष्टि करने के लिए है, ट्यूमर विशिष्ट, और vivo में प्रभावकारिता को बढ़ाता है. एक भी परीक्षण कर सकते हैं कि क्या यह ट्यूमर सेल लाइनों की एक स्पेक्ट्रम भर में फैले संग्राहक

  1. पुष्टि है कि उम्मीदवार जीन के पछाड़ना-निशाने पर है
    1. पहले की पुष्टि करें कि वहां phenotype और जीन मुंह बंद करने के बीच एक संबंध है । एक ही परख है कि स्क्रीन के लिए विकसित किया गया था या यह एक 6-अच्छी तरह से एक बड़े प्रारूप में प्रसार की वृद्धि या निषेध का आकलन करने के लिए प्रारूप के लिए संशोधित करें । सिरना के साथ transfected कोशिकाओं के साथ एक समय पाठ्यक्रम आचरण जीन (एस) ब्याज प्लस और शूंय से वायरस को लक्षित ।
    2. वायरस से संक्रमित कोशिकाओं युक्त कुओं छवि, और नियमित समय अंतराल पर संक्रमित कुओं से सेल lysates इकट्ठा । निर्धारित करें कि क्या जीन मुंह बंद करने और वृद्धि या प्रसार के निषेध के बीच एक संबंध है । मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) और/या पश्चिमी सोख्ता द्वारा जीन मुंह बंद करने का आकलन करें ।
    3. हिट की पुष्टि करने के लिए एक आनुवंशिक बचाव प्रयोग प्रदर्शन पर लक्ष्य है । नोट: एक ठेठ बचाव प्रयोग में, उंमीदवार जीन खटखटाया है नीचे RNAi के साथ, जबकि एक ही समय में कोशिकाओं RNAi प्रतिरोधी सीडीएनए के साथ क्षणिक transfected रहे है (जीन के orthologजैसे ) उंमीदवार जीन व्यक्त करने के लिए निर्धारित है कि क्या phenotype जीन के बहाल या "बचाया है." स्थिर कोशिका रेखाओं का RNAi प्रतिरोधी सीडीएनए के परीक्षार्थी जीन ऑफ इंटरेस्ट भी कार्यरत हो सकते हैं.
    4. वैकल्पिक रूप से, बजाय एक आनुवंशिक बचाव प्रयोग के, कई ओर्थोगोनल परख का उपयोग करने की पुष्टि है कि हिट पर लक्ष्य है [उदा निर्धारित करें कि क्या एक ही phenotype लक्ष्य जीन के पछाड़ना पर कई siRNAs के साथ प्राप्त की है, पर पछाड़ना कई स्थिर सेल लक्ष्य जीन के खिलाफ shRNA व्यक्त लाइनों में लक्ष्य जीन है, और CRISPR के साथ पीटकर पर (नियमित रूप से अंतराल कम palindromic दोहराने संकुल)-Cas9 प्रौद्योगिकी एकाधिक कक्ष लाइनों में.] ।
  2. पुष्टि है कि हिट ट्यूमर विशिष्ट है और ट्यूमर सेल लाइनों की एक सीमा के पार फैले संग्राहक
    1. शुू में के रूप में एक समान परख आचरण, लेकिन सामांय कोशिकाओं के साथ ही अंय ट्यूमर सेल लाइनों के साथ ।
  3. पुष्टि है कि उंमीदवार जीन में हेरफेर vivo में प्रभावकारिता बढ़ाता है
    नोट: नीचे वर्णित तीन vivo मेंजीन लक्ष्य से छेड़छाड़ के लिए संभव तरीके हैं ।
    1. जीन टारगेट में हेरफेर करने के लिए दवा लगाएं । अगर वहां एक ऐसी दवा एक छोटे अणु अवरोध करनेवाला है कि एक ही जीन लक्ष्य के रूप में है, यह oncolytic वायरस के साथ vivo मेंप्रशासन । यह दवा प्रशासन के लिए इष्टतम समय निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    2. इंजीनियर को रोकना या जीन लक्ष्य पर निर्भर करता है कि क्या एक इच्छाओं को रोकना या जीन लक्ष्य बढ़ाने के लिए वायरस अभियंता । जीन को बाधित करने के लिए, oncolytic वायरस इंजीनियर जीन का एक प्रमुख नकारात्मक व्यक्त करने के लिए या जीन लक्ष्यीकरण shRNA व्यक्त करने के लिए । जीन लक्ष्य की अभिव्यक्ति बढ़ाने के लिए, एक जीन व्यक्त transgene के साथ oncolytic वायरस क्लोन ।
    3. इंजीनियर के साथ सेल लाइनों के जीन खटखटाया-नीचे या खटखटाया-बाहर shRNA या CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग कर, क्रमशः । इंजीनियर सेल लाइन और vivo में वंय-प्रकार सेल लाइन प्रत्यारोपण और बाद में oncolytic वायरस के साथ संक्रमित । नोट: इस विधि के एक सबूत के सिद्धांत के रूप में कार्य करता है और यह निर्धारित करने में मदद कर सकते है कि अतिरिक्त समय और संसाधनों के निवेश के लिए एक दवा के लिए vivo मेंजीन हेरफेर विकसित, उदाहरण के लिए, सार्थक होगा ।

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Representative Results

oncolytic वायरस थेरेपी को एंहांस करने के लिए होस् ट लक्ष् यों की पहचान करने के लिए कार्यप्रवाह का ओवरव्यू चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है ।

जैसा कि चित्रा 1में सचित्र, एक उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीन के संचालन के लिए महत्वपूर्ण पहला कदम परख विकास है । चित्र 2a अभिकर्मक ऑप्टिमाइज़ेशन परख के लिए एक नमूना प्लेट लेआउट प्रदान करता है । चित्रा 2 बी अपेक्षित परिणाम के प्रतिनिधि छवियों के होते हैं, और चित्र 2c अपेक्षित परिणाम का एक प्रतिनिधि भूखंड है. PLK के बाद सिरना पछाड़ना-1, एक जीन है कि सेल मौत लाती है और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता सिरना पछाड़ना दक्षता पर नजर रखने के लिए, एक सेल अस्तित्व 0-30% के बीच होने की उंमीद है, जब तक सेल लाइन एक लंबा दोहरीकरण समय है जो मामले में यह ले जाएगा l onger कक्ष ृ phenotype का अवलोकन कया. गैर लक्ष्यीकरण सिरना भी ंयूनतम अनुपचारित कोशिकाओं की है कि एक समान रिश्तेदार अस्तित्व के साथ कोशिकाओं को विषाक्त होना चाहिए ।

परख विकास का एक अंय प्रमुख तत्व MOI जिस पर कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए और संक्रमण के लिए समय की लंबाई निर्धारित है । चित्रा 3 ए वायरस की मात्रा और वायरस के साथ मशीन की लंबाई निर्धारित करने के लिए एक नमूना प्लेट लेआउट प्रदान करता है । चित्र बी -vvDD-eGFP (oncolytic vaccinia वायरस GFP Thymidine और कळेनासे वृद्धि कारक नष्ट जीन के साथ बढ़ाया vaccinia व्यक्त) से संक्रमित 786-ओ कोशिकाओं के एक जीवित समय के पाठ्यक्रम के परिणामों को दर्शाया गया है विभिन्न MOIs पर. 0.05 के एक MOI पर vvDD-eGFP से संक्रमित कक्षों की प्रतिनिधि छवियां आरेख 3सी में दिखाई जाती हैं । चित्र बीमें प्लॉट किए गए परिणामों के आधार पर, एक 0.05 और 21 के संक्रमण की लंबाई के एक MOI का चयन कर सकते है के रूप में इस समय बिंदु के रूप में प्रसार में वृद्धि और घटने का पता लगाने के लिए अनुमति होगी-point एक रैखिक सीमा के भीतर है, और अनुमानित Z-कारक इस तिवारी पर me-point 0.6 के साथियों के लिए है कि वृद्धि और समानता है कि प्रसार में कमी के लिए । इस परख मांय के भाग के रूप में, एक इस MOI और समय बिंदु पर कोशिकाओं को ठीक करना चाहते हैं, और Z-कारक की गणना करेगा ।

प्रोटोकॉल के बाद वर्णित है, हम तीन अलग ट्यूमर सेल लाइनों (जैसे OVCAR-8, U373, NCI-H226) भर में जीनोम चौड़ा RNAi स्क्रीन का आयोजन एक सिरना १८,१२० जीन लक्ष्यीकरण के साथ डुप्लिकेट में15। पागल विधि का उपयोग करते हुए, हम 1008 हिट करने के लिए आम की पहचान की 3 कैंसर सेल लाइनों (चित्रा 4a) से बाहर कम 2 । स्क्रीन में पहचान की हिट के मार्ग विश्लेषण UPR (सामने आया प्रोटीन की प्रतिक्रिया) और ERAD (Endoplasmic-जालिका-संबंधित प्रोटीन क्षरण) रास्ते के सदस्यों के संवर्धन से पता चला (चित्रा 4a) । हमने प्राथमिक स्क्रीन (फिगर 4B) के उन से अलग लक्ष्यीकरण दृश्यों के साथ सिरना का उपयोग करके माध्यमिक सत्यापन के लिए इन रास्ते के भीतर 10 हिट का चयन किया. तृतीयक मांयता के भाग के रूप में, हम IRE1α और ATF6α के साथ एक आनुवंशिक बचाव प्रयोग किया (प्रतिलेखन कारक 6 अल्फा सक्रिय) की पुष्टि करें कि इन हिट लक्ष्य पर थे (चित्र 4c) ।

Figure 1
चित्रा 1: oncolytic वायरस थेरेपी को बढ़ाने के लिए मेजबान लक्ष्यों की पहचान करने के लिए कार्यप्रवाह की योजनाबद्ध । पहला कदम के लिए विकसित करने और उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीनिंग, जो कोशिकाओं में सिरना शुरू करने के लिए अभिकर्मक शर्तों के अनुकूलन भी शामिल है के लिए एक परख मांय है, वायरस (यानी MOI) के इष्टतम राशि का निर्धारण करने के साथ कोशिकाओं को संक्रमित और वायरस के साथ मशीन की लंबाई । दूसरे चरण के लिए एक उच्च प्रवाह जीनोम चौड़ा स्क्रीन का संचालन है । एक सिरना पूरे जीनोम के पार जीन लक्ष्यीकरण पुस्तकालय microtiter प्लेटों पर सरणी है । कोशिकाओं को तो सिरना पुस्तकालय के साथ रिवर्स transfected हैं । एक 48-72 एच मशीन अवधि के बाद जीन मुंह बंद करने के लिए अनुमति देने के लिए, कोशिकाओं वायरस के इष्टतम राशि से संक्रमित हैं । वायरस के साथ गर्मी की इष्टतम लंबाई के बाद, कोशिकाओं को तय कर रहे हैं और दाग, और बाद में एक उच्च सामग्री माइक्रोस्कोप के साथ छवि. बाद में छवि और डेटा विश्लेषण जीन है कि काफी वायरस प्रतिकृति, जो हिट के रूप में संदर्भित कर रहे है मिलाना पहचान करने में मदद मिलेगी । सामान्य रूप से विभिन्न बीज क्षेत्रों के साथ सिरना या shRNA का उपयोग कर प्राथमिक स्क्रीन से चुनिंदा हिट पर एक द्वितीयक मान्यता स्क्रीन किया जाता है । तृतीयक मान्यता प्रयोगों हिट कर रहे हैं कि पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं-लक्ष्य, ट्यूमर विशिष्ट और बढ़ाने vivo मेंप्रभावकारिता. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीनिंग परख के लिए अभिकर्मक शर्तों का अनुकूलन । (क) दो अलग सेल लाइनों के साथ अभिकर्मक शर्तों के अनुकूलन के लिए एक नमूना प्लेट लेआउट । (ख) 786-ओ कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों (1500 कोशिकाओं/अच्छी तरह से) Hoechst ३३३४२ के साथ सना हुआ अभिकर्मक रिएजेंट मंदक अकेले (यानी अनुपचारित), अभिकर्मक रिएजेंट और मंदक (यानी नकली के साथ 72 एच मशीन के बाद। transfected), गैर-लक्ष्यीकरण सिरना के साथ और सिरना लक्ष्यीकरण PLK-1 के साथ. (ग) अभिकर्मक अनुकूलन प्रयोग से प्रतिनिधि परिणाम 22% PLK-1 सिरना (n = 24) के साथ transfected कोशिकाओं की उत्तरजीविता और गैर लक्ष्यीकरण transfected (एन = 8) के साथ सिरना कोशिकाओं के 94% अस्तित्व दिखा । त्रुटि सलाखों = ± एसडी, मानक विचलन; स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: वायरस और उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीनिंग परख के लिए वायरस के साथ मशीन की लंबाई की राशि का निर्धारण । (एक) वायरस और वायरस के साथ मशीन की लंबाई की राशि के अनुकूलन के लिए एक नमूना प्लेट लेआउट । स्तंभ 1 और 24 में अभिकर्मक नियंत्रण होते है और वे संक्रमित छोड़ दिए जाते हैं । कॉलम 2 से 23 अनुपचारित कोशिकाओं, नकली transfected कोशिकाओं और सकारात्मक और नकारात्मक वायरस के साथ transfected कोशिकाओं को नियंत्रित सभी MOIs की एक सीमा के साथ शुरू होने वाले कॉलम 2 और 3 में कोई वायरस के साथ संक्रमित नियंत्रण । (ख) 786-ओ कोशिकाओं को गैर लक्ष्यीकरण सिरना के साथ रिवर्स transfected और 48 एच के लिए मशीन थे । वे बाद में संकेत MOIs पर vvDD-GFP से संक्रमित थे और 8 घंटे के बाद 5 घंटों के बाद संक्रमण (hpi) में शुरू की छवि । मतलब GFP क्षेत्र प्रति अच्छी तरह से (± एसडी) हर समय बिंदु (n = 12) के लिए गणना की थी और ग्राफ पर साजिश रची । z-कारक अंक A और b के बीच परिकलित 0.6 और z-कारक अंक b और C के बीच परिकलित 0.6 है । (ग) प्रतिनिधि की लाइव छवियां एक अच्छी तरह से संक्रमित समय-अंक में 0.05 की एक MOI के साथ संकेत दिया । आवर्धन, 10x; 9 फील्ड्स/ स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: जीनोम चौड़ा स्क्रीन Rhabdovirus की मध्यस्थता Oncolysis के एक शक्तिशाली संवेदीकरण के रूप में एर तनाव प्रतिक्रिया नाकाबंदी की पहचान करता है । (क) वेन आरेख 3 ट्यूमर सेल लाइनों में उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीन के अतिव्यापी हिट की संख्या को रेखांकित, और एक मेज (+, सिंथेटिक घातक;-, कोई बातचीत) और योजनाबद्ध आरेख (लाल रंग में उल्लिखित हिट) UPR और ERAD के भीतर प्रमुख हिट illustrating मार्ग. (ख) चुनाव आयोग50 पारियों (काली पट्टियां, बाएं y अक्ष) U373 कोशिकाओं Maraba वायरस (48 एच) के साथ इलाज के लिए निर्धारित किया गया सिरना (72 एच) के साथ उपचार के बाद स्क्रीन से UPR/ERAD हिट्स की एक श्रृंखला लक्ष्यीकरण । प्रत्येक जीन के लिए सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति निम्न सिरना पछाड़ना (७२ एच) सफेद (दाएँ वाई अक्ष) में दर्शाया गया है. (ग) कोशिका व्यवहार्यता परख 48 Maraba वायरस के संक्रमण के बाद एच आयोजित किए गए थे, U373 कोशिकाओं में ectopically व्यक्त माउस ATF6α (या नियंत्रण GFP) ± सिरना लक्ष्यीकरण मानव ATF6α (या गैर लक्ष्यीकरण [NT] नियंत्रण; बाएँ पैनल) या मानव XBP1 (s) (या नियंत्रण ) ± सिरना लक्ष्यीकरण मानव IRE1α (या नियंत्रण; दायां पैनल) । पश्चिमी दाग प्रदर्शन जीन मुंह बंद करने और अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति दिखाया गया है । चुनाव आयोग50 बदलाव = कोशिकाओं के 50% को मारने के लिए आवश्यक वायरस की खुराक में बदलाव; त्रुटि सलाखों = ± एसडी; XBP1 (s) = X-बॉक्स बाइंडिंग प्रोटीन 1 (ब्याह); (ख) में, एक तरह से ANOVAs के बाद प्रदर्शन किया गया एक Bonferroni एकाधिक तुलना की पोस्ट हॉक पी मूल्यों प्राप्त करने के लिए परीक्षण; (ग) में, छात्र के टी परीक्षण पी मूल्यों को प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया गया; * p < 0.05; < 0.05 #p । (यह आंकड़ा Mahoney एट अल., 201115) से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां हम उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीनिंग को रोजगार के लिए मेजबान लक्ष्य है कि oncolytic वायरस चिकित्सा बढ़ाने के हेरफेर किया जा सकता है की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद हैं । यह सफलतापूर्वक oncolytic Maraba वायरस और oncolytic vaccinia वायरस के साथ परीक्षण किया गया है, लेकिन, के रूप में उल्लेख किया है, यह अन्य oncolytic वायरस या अन्य वायरस के साथ उपयोग के लिए आम तौर पर मेजबान जीन है कि वायरस प्रतिकृति मिलाना पहचान करने के लिए अनुकूलित कर सकते हैं. स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल भी जीन है कि वृद्धि या कम प्रसार की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, लेकिन यह आसानी से अंय readouts के लिए संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, Maraba वायरस के साथ हमारी स्क्रीन, एक साधारण resazurin आधारित महत्वपूर्ण डाई परख का उपयोग oncolysis मॉडुलन करने के लिए सेल व्यवहार्यता स्कोर करने के लिए डिजाइन किए गए थे ( चित्रा 4देखें)15. इन स्क्रीन में, वायरस के साथ गर्मी के बाद, formaldehyde और Hoechst के साथ धुंधला के साथ कोशिकाओं फिक्सिंग के बजाय, हम एक अच्छी तरह से (20 μg के अंतिम एकाग्रता) में resazurin डाई तिरस्कृत और, एक 6 घंटे की मशीन के बाद, हम एक साथ अवशोषित (573 एनएम) मापा प्लेट रीडर । हम भी एक readout के रूप में धुंधला Hoechst के आधार पर सेल नंबर इस्तेमाल किया जा सकता था । एक सरोगेट रिपोर्टर का उपयोग करते हुए वायरस प्रतिकृति मॉनिटर करने के लिए इस स्क्रीन में अनावश्यक था, एक रिपोर्टर प्रोटीन के साथ एक वायरस, विशेष रूप से एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक कर सकते हैं के रूप में स्क्रीन अनुकूलन की सुविधा है, उदाहरण के लिए, निगरानी वायरस प्रतिकृति रहते हैं; इसके अलावा, एक रिपोर्टर प्रोटीन के साथ एक वायरस कम बोझिल और वायरल एंटीजन के लिए दाग एंटीबॉडी का उपयोग करने से महंगा है, लेकिन यह एक के बिना स्क्रीन करने के लिए संभव है । इसके अलावा, एक परख के लिए और भी संशोधन करने के लिए मेजबान कारकों की जांच कर सकता है कि infectivity पर प्रभाव, फट आकार, और भी अधिक विस्तृत उप प्रतिरक्षा सेल मौत की तरह phenotypes । प्रत्येक मामले में, एक समान परख विकास प्रोटोकॉल, स्क्रीनिंग रणनीति और माध्यमिक और तृतीयक सत्यापन विधियों का पालन करेंगे ।

प्रोटोकॉल में, हम अभिकर्मक शर्तों के अनुकूलन का सुझाव आदर्श रूप में कई ट्यूमर सेल लाइनों के साथ । एकाधिक कक्ष रेखाओं के साथ ऑप्टिमाइज़ करने के कम से दो कारण हैं । एक कारण यह है कि नहीं हर सेल लाइन उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदाई है के रूप में कुछ transfect मुश्किल हो सकता है या अच्छी तरह से पालन नहीं कर सकते हैं, लेकिन एक प्रमुख कारण के लिए कई सेल लाइनों के साथ स्क्रीनिंग सक्षम है क्रम में सेल आंतरिक पूर्वाग्रह से बचने के लिए । सेल लाइनों के चुनाव मुख्यतः एक के उद्देश्यों पर निर्भर है । एक के लिए एक विशेष रूप से कैंसर के प्रकार या चयन अलग कैंसर प्रकार पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक व्यापक स्पेक्ट्रम कवर चुनाव हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, एक ट्यूमर सेल लाइनों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए कि मेजबान कारकों है कि ट्यूमर सेल लाइनों कम oncolytic वायरस संक्रमण के लिए प्रतिरोधी बनाने के हेरफेर किया जा सकता है की पहचान करने के लिए प्रतिरोधी रहे है इच्छा हो सकती है ।

कोशिकाओं लाइनों के चयन के अलावा, सकारात्मक और नकारात्मक वायरस नियंत्रण का चयन किसी भी स्क्रीन के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है । कुछ उदाहरणों में, वायरस जीन के लिए आवश्यक हैं या प्रतिकृति को प्रतिबंधित नहीं जाना जा सकता है या, यदि वे ज्ञात हैं, वे कक्ष-विशिष्ट हो सकता है । नतीजतन, एक अभी भी अनुमानित मजबूती और परख के गतिशील रेंज सरोगेट नियंत्रण का उपयोग करके निर्धारित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, एक संक्रमित कोशिकाओं या कोशिकाओं जीन की पहचान करने के लिए एक किराए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक कम MOI से संक्रमित उपयोग कर सकते है कि पछाड़ना पर फैल कमी । जीन की पहचान है कि पछाड़ना पर फैल बढ़ाने के लिए, एक वायरस की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला के साथ कोशिकाओं को संक्रमित सकता है, और एक किराए की सकारात्मक नियंत्रण के रूप में अधिकतम संकेत के साथ कुओं का उपयोग करें ।

माध्यमिक स्क्रीन सत्यापन और रोजगार के लिए प्रौद्योगिकी के प्रकार के लिए हिट्स का चयन एक और बात है कि सावधान विवेचना की आवश्यकता है । उंमीदवारों आमतौर पर है कि वे काफी एकाधिक कैंसर सेल लाइनों में फैले (यदि प्राथमिक स्क्रीन एकाधिक सेल लाइनों में आयोजित किया गया) और जैविक ब्याज पर हिट की भयावहता के आधार पर माध्यमिक स्क्रीन सत्यापन के लिए चयनित हैं । डेविड22,23, पैंथर24, स्ट्रिंग25 और PINdb26 के रूप में Bioinformatics उपकरण रास्ते और जैविक ब्याज की हिट को अलग करने में मदद कर सकते हैं । Mercer एट अल. 8 खुला स्रोत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के उपयोग का वर्णन है और यह भी एक एल्गोरिथ्म उपलब्ध कराया है कि वे दृश्य और हिट के विश्लेषण के लिए विकसित की है । एक कारक खाते में लेने के लिए जब परिणाम की व्याख्या है कि जीन मुंह बंद करने वायरस जीवन चक्र है कि जांच की जा रही है में मंच पर निर्भर करता है विभिंन प्रभावों हो सकता है । उदाहरण के लिए, यह संभव है कि एक जीन के जीवन चक्र में जल्दी पछाड़ना वायरस प्रतिकृति को बाधित कर सकते हैं, जबकि बाद में पछाड़ना स्तर पर प्रतिकृति वृद्धि हो सकती है । अक्सर, माध्यमिक स्क्रीन जीन प्रति एकाधिक siRNAs के साथ विभिंन बीज क्षेत्रों के साथ एक अलग विक्रेता से सिरना के साथ आयोजित की जाती हैं । बहरहाल, पूरक प्रौद्योगिकियों लक्ष्यीकरण उंमीदवार जीन ऐसे CRISPR-Cas9 या lentivirus shRNA व्यक्त वैक्टर के रूप में कार्यरत किया जा सकता है ।

विश्लेषण की पद्धति भी एक विचारणीय विचार है. हम यहां मजबूत Z-स्कोर या पागल20,27 का उपयोग सुझाया कट-नापसंद के साथ > 2 या <-2 के हिट कॉलिंग के लिए सुझाव देते हैं । कट-नापसंद या बढ़ाया जा सकता है कि क्या ध्यान अधिक झूठी सकारात्मक या अधिक झूठी नकारात्मक पर कब्जा नष्ट करने पर निर्भर करता है के आधार पर कमी आई है । उदाहरण के लिए, एक हाल ही में उच्च vaccinia वायरस9के साथ प्रवाह स्क्रीन में, कम कटौती बंद-1.5 पर सेट (कोई ऊपरी काट-नापसंद ध्यान के रूप में वर्णित किया गया जीन है कि पछाड़ना पर कम फैल की पहचान पर था) । वहां भी अंय तरीकों कि z-स्कोर, SSMD (कड़ाई से मानकीकृत मतलब अंतर) सहित कार्यरत किया जा सकता है, और बी स्कोर20,28,29,30। Barrows एट अल.31 योग रैंक, पागल, जेड स्कोर और SSMD द्वारा उत्पंन की हिट सूचियों की तुलना में और विश्लेषण के प्रत्येक विधि पाया अलग हिट सूचियों में हुई । टोटो में, कोई सही विधि या कट-ऑफ नहीं है । अंततः, माध्यमिक स्क्रीन मांयता और तृतीयक मांयता अध्ययन सच हिट की पुष्टि करेगा ।

बाहर साइटोटोक्सिक हिट को छानने की विधि भी विचार किया जाना चाहिए । एक तरह से समानांतर प्लस या माइनस वायरस में प्राथमिक स्क्रीन का संचालन करने के लिए है । यह siRNAs है कि अपने दम पर साइटोटोक्सिक है का पता लगाने परमिट । यह हमारे Maraba वायरस स्क्रीन15में हमारे दृष्टिकोण था; हालांकि, यह अक्सर व्यावहारिक नहीं है । शायद एक और अधिक व्यावहारिक विधि, मजबूत होने के अलावा में, हिट है कि माध्यमिक स्क्रीन सत्यापन के भाग के रूप में साइटोटोक्सिक है पता लगाने के लिए है, खासकर अगर है एक ध्यान हिट की पहचान करने के लिए है कि पछाड़ना पर प्रतिकृति कमी । उदाहरण के लिए, Myxoma वायरस के साथ एक पूरे जीनोम प्राथमिक स्क्रीन में, Teferi एट अल। 11 की पहचान १,५८८ siRNAs कि पछाड़ना पर वायरस प्रतिकृति कमी हुई । साइटोटोक्सिक siRNAs बाहर फ़िल्टर करने के लिए, वे इन siRNAs के साथ एक माध्यमिक cytotoxicity स्क्रीन का आयोजन किया; वे सेल व्यवहार्यता 72 एच के बाद मापा एक resazurin-आधारित सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग अभिकर्मक । ≤-१.९६ के Z-स्कोर के आधार पर साइटोटोक्सिक siRNAs की पहचान की गई । एक अंय दृष्टिकोण के लिए बस एक निश्चित प्रतिशत से सेल संख्या की कमी के आधार पर प्राथमिक स्क्रीनिंग डेटा से साइटोटोक्सिक siRNAs बाहर फिल्टर है, उदाहरण के लिए, एक कमी से > 50% शिवन एट अल में के रूप में । 9, या ली एट अल के रूप में एक विशेष स्कोर पर आधारित है । 14; मेजबान vesicular stomatitis वायरस प्रतिकृति के लिए आवश्यक कारकों के अपने अध्ययन में, वे सिरना हिट है कि द्वारा कम सेल व्यवहार्यता को छोड़ दिया > 3.0 माध्य से मानक विचलन । कोशिकाओं की मतलब संख्या सेल नाभिक के Hoechst धुंधला के आधार पर निर्धारित किया गया था और, हालांकि स्पष्ट रूप से नहीं कहा गया, मतलब प्रतीत होता है एक प्रति प्लेट के आधार पर गणना के रूप में यह स्पष्ट है कि मतलब GFP संकेत प्रति प्लेट आधार पर गणना की गई थी ।

किसी भी उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीन की एक सीमा झूठी सकारात्मक और नकारात्मक है, जो परख डिजाइन का एक परिणाम के रूप में आ सकता है की लगातार उच्च संख्या है, प्रौद्योगिकी का इस्तेमाल किया या व्यवस्थित त्रुटियों के माध्यम से । उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन काफी वायरस की पुनरावृत्ति को प्रभावित कर सकते हैं, लेकिन समय जीन मुंह बंद करने के लिए चुना भी है प्रोटीन आधा जीवन दिया जा सकता है उसके प्रभाव परख डिजाइन के आधार पर एक झूठी नकारात्मक के लिए अग्रणी का पता लगाने । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि अधूरा पछाड़ना और ऑफ सिरना प्रौद्योगिकी के लक्ष्य प्रभाव भी झूठी सकारात्मक और नकारात्मक परिचय कर सकते हैं । व्यवस्थित त्रुटियों, जैसे बढ़त प्रभाव32, भ्रामक परिणाम के रूप में अच्छी तरह से उत्पन्न कर सकते हैं । यहाँ प्लेट के बाहरी कुओं में सिग्नल वाष्पीकरण के कारण थाली के बाकी हिस्सों से व्यवस्थित रूप से अधिक या कम हो सकता है. उदाहरण के लिए, सहित इन मुद्दों में से कुछ को संबोधित करने के लिए रणनीतियों रहे हैं: बंद-लक्ष्य प्रभाव को कम करने के लिए सिरना की एकाग्रता कम33, प्लेट लेआउट पुनः कॉंफ़िगर करने के लिए मीडिया के साथ बाहरी कुओं को भरने के लिए बढ़त प्रभाव, या रोजगार अभिकलनी तरीकों कि बढ़त प्रभाव32,34,35के रूप में व्यवस्थित त्रुटियों का पता लगाने और जवाब देने के लिए विकसित किया गया है । झूठी सकारात्मकता से निपटने के लिए एक सामान्य विधि प्राथमिक स्क्रीन के बाद एक माध्यमिक स्क्रीन का संचालन करने के लिए है । के रूप में झूठी नकारात्मक से निपटने का एक तरीका है, एक कट आराम कर सकते है हिट कॉलिंग के लिए बंद है, और माध्यमिक स्क्रीनिंग के लिए संभावित झूठी नकारात्मक शामिल हैं । यह, ज़ाहिर है, गलत नकारात्मक है कि अच्छी तरह से कटौती से नीचे है पर कब्जा नहीं होगा । प्राथमिक स्क्रीन भी नकली परिणामों को सीमित करने के लिए डुप्लिकेट या तपसिल में आयोजित किया जाना चाहिए । अंत में, कोई बात नहीं क्या रणनीति नियोजित कर रहे हैं, कोई उच्च प्रवाह स्क्रीन exhaustively सभी सच हिट की पहचान करेगा, लेकिन यह डेटा का खजाना निधि प्रदान कर सकते है जो एक से कुछ मूल्यवान हिट कि पर कैपिटल जा सकता है मेरा होने की संभावना है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम सरणी सिरना और shRNA प्रौद्योगिकी के उपयोग का वर्णन किया है, हालांकि एक अंय विकल्प परित shRNA और CRISPR-Cas9 पुस्तकालयों का उपयोग है । Workenhe एट अल में एक परित shRNA पुस्तकालय कार्यरत था । परिचय में उल्लिखित 12 अध्ययन । परित CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी के लिए जीनोम के पैमाने पर स्क्रीन के संचालन के लिए इस्तेमाल किया गया है मेजबान कारकों की पहचान करने के लिए आवश्यक वायरस की पुनरावृत्ति जैसे Zika वायरस36, पश्चिम नील नदी वायरस37,38, डेंगू वायरस39 और हेपेटाइटिस सी वायरस39. परित पुस्तकालयों का उपयोग करने का लाभ यह है कि वे कम खरीद महंगा है, विशेष बुनियादी सुविधाओं की आवश्यकता नहीं है (उदा तरल हैंडलिंग उपकरणों, उच्च सामग्री सूक्ष्मदर्शी, और रोबोट उपकरण), और न ही वे ऑपरेटिंग के उच्च लागत है और इस बुनियादी ढांचे को बनाए रखने, और वे कम उपभोग्य सामग्रियों की आवश्यकता । नुकसान यह है कि readouts के प्रकार अधिक सीमित हैं । अधिकांश में नहीं तो सभी pooled पुस्तकालय मेजबान-वायरस बातचीत की तारीख को स्क्रीन, readout सेल व्यवहार्यता या उसके अभाव है; एक अधिक जटिल phenotypes के लिए आसानी से जांच नहीं कर सकते । प्रारूप का चुनाव जैविक प्रश्न पर निर्भर करता है पूछा जा रहा है ।

आनुवंशिक स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में पिछले कई दशकों में प्रगति है कि पहले बैक्टीरिया और खमीर में अब मौजूद दिन जीनोम-मानव कोशिकाओं में स्क्रीन के लिए सक्षम स्क्रीन के अध्ययन के विविध क्षेत्रों में खोज के लिए दरवाजा चौड़ा खोल दिया है । इन आनुवंशिक स्क्रीन न केवल हमें मौलिक जीवविज्ञान के सवालों के जवाब देने की अनुमति दी है, लेकिन विकासशील और जैव चिकित्सीय सुधार में अंतर्दृष्टि ताला खोलने के लिए हमें चाबियां दे दिया है । हालांकि अभी भी सबक सीखा है और चुनौतियों को इस तकनीक के साथ दूर किया जा करने के लिए, तारीख करने के लिए परिणाम रोमांचक रहा है । खोजों की संभावना भी CRISPR-Cas9 पुस्तकालयों सहित उपंयास स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकी के रूप में अधिक से अधिक हो जाएगा, microfluidics और vivo स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकियों में परिपक्व करने के लिए जारी है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के कैंसर अनुसंधान के लिए ओंटारियो संस्थान, नवाचार के लिए कनाडा फाउंडेशन, ओटावा क्षेत्रीय कैंसर फाउंडेशन, और टेरी फॉक्स अनुसंधान संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । K.J.A. एक वाणी कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति, स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए एक कनाडाई संस्थान-मास्टर पुरस्कार, और एक ओंटारियो स्नातक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
siRNA library GE Dharmacon G-005005-02
Corning 384-well plate Corning 3985
Falcon 384-well plate Becton Dickinson 353962
Water Sigma W4502
siGenome SMARTpool PLK1 GE Dharmacon M-003290-01
AllStars Negative Control siRNA Qiagen SI03650318
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 GE Dharmacon D-001206-14-20
DMEM/HIGH Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30022.01
Fetal Bovine Serum Sigma F15051-500ML
HEPES solution (1M) Sigma H3535-100ML
Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 2500056
DPBS/Modified GE Healthcare Life Sciences SH30028.02
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778100
Oligofectamine Thermo Fisher Scientific 1225011
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 22600-050
Resazurin sodium salt Sigma R7017-5G
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H21492
Formaldehyde (37% by weight) Fisher Scientific F79-4
500 ml bottles Corning 430282
Adhesive Sealing Film For Microplates Excel Scientific 361006007
Peelable Heat Sealing Foil Thermo Fisher Scientific AB-3720
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette Fisher Scientific 11-120-625
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MicroFlo Select (liquid dispenser) Fisher Scientific 11120621
BioTek Synergy HT plate reader Biotek N/A
Opera Imaging and Analysis Instrument PerkinElmer HH10000115
KiNEDx Robotic Arm Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) KX-300-660
Cytomat 24C Series Automated Incubator Thermo Fisher Scientific 50080227
JANUS Automated Workstation PerkinElmer AJI4M01
Plate Carousel Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) N/A
Alps 3000 plate sealer Thermo Fisher Scientific AB-3000

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कैंसर अनुसंधान अंक 134 Oncolytic वायरस RNAi स्क्रीन उच्च प्रवाह कैंसर vaccinia rhabdovirus सेल मेजबान कार्यात्मक जीनोमिक्स
जीनोम चौड़ा RNAi स्क्रीनिंग मेजबान कारकों है कि Oncolytic वायरस थेरेपी मिलाना की पहचान करने के लिए
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Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, … More

Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, S. D., Lefebvre, C. A., Stojdl, D. F. Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy. J. Vis. Exp. (134), e56913, doi:10.3791/56913 (2018).

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