Summary
כאן נתאר פרוטוקול להעסקת תפוקה גבוהה ההקרנה RNAi לחשוף את מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic, במיוחד rhabodvirus וטיפול וירוס vaccinia, אבל ניתן בקלות להתאים oncolytic אחרים וירוס פלטפורמות או לגילוי גנים המארח לווסת את שכפול וירוס בדרך כלל.
Abstract
תפוקה גבוהה ברמת הגנום RNAi (התערבות ב RNA) הקרנה הטכנולוגיה כבר בשימוש נרחב עבור גילוי מארח גורמים שמשפיעים על שכפול הוירוס. כאן אנו מציגים את היישום של טכנולוגיה זו חשיפת מטרות מארח זה במיוחד לווסת את השכפול של וירוס Maraba, oncolytic כמו כלבת ו וירוס vaccinia עם המטרה של שיפור הטיפול. בעוד הפרוטוקול נבדק לשימוש עם oncolytic Maraba וירוס, oncolytic וירוס vaccinia, גישה זו ישימה על וירוסים אחרים, oncolytic, גם יכול להיות מנוצל לזיהוי מטרות מארח לווסת את שכפול הוירוס בתאים בתרבית של כללי. פרוטוקול זה מתאר את התפתחות של אימות של assay להקרנה RNAi תפוקה גבוהה בתרבית של תאים, שיקולים מרכזיים, צעדים הכנה חשוב עבור ניצוח מסך ראשי RNAi תפוקה גבוהה, מדריך צעד אחר צעד ניצוח מסך ראשי RNAi תפוקה גבוהה; בנוסף, זה בהרחבה מתאר את השיטות לביצוע אימות המסך המשני של לימודי אימות שלישוני. היתרון של תפוקה גבוהה RNAi ההקרנה הוא שזה מאפשר אחד לקטלג, באופן נרחב, לא משוחד, גורמים מארח לווסת את כל היבט של שכפול הוירוס אשר אחד יכול לפתח של assay במבחנה כגון infectivity, פרץ גודל, cytotoxicity. יש את הכוח כדי לחשוף לא צפוי biotherapeutic מטרות בהתבסס על הידע הנוכחי.
Introduction
תפוקה גבוהה ברמת הגנום RNAi ההקרנה הוכיחה להיות כלי רב ערך לחשוף תובנות ביולוגי במגוון תחומים של המחקר כולל וירוסים ביולוגיה. במהלך העשור האחרון או משהו כזה, קבוצות רבות ובהבנתנו מבוססת תא בקנה מידה גדול RNAi הקרנת בהרחבה לזהות גנים המארח לווסת את וירוס שכפול (אירוע של יום שלם1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). מעניין, מספר גדול של המסכים הבאים נערכו ב תאים סרטניים וכמה עם וירוסים כי הם מועמדים וירוס oncolytic הנוכחי, ובהם vaccinia וירוס8,9,10 , Myxoma וירוס11, וירוס הרפס סימפלקס12,13,וירוס vesicular stomatitis14ו- Maraba וירוס15. המוקד של הרוב המכריע של מחקרים אלו היה על זיהוי המארח גורמים המשפיעים על יחס מסוים של וירוס שכפול ולא על זיהוי מטרות biotherapeutic לשיפור oncolytic וירוס טיפול, נתונים יקרי ערך יכול להיות הנכרה ערכות נתונים אלה ב- בעניין זה. ברור כי הפוטנציאל רב עוצמה לזיהוי מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic לא לגמרי נוצלה.
שפע של oncolytic וירוס פלטפורמות נבדקות כעת בקליניים וקליניים כולל הרפס סימפלקס וירוס, reovirus, vaccinia וירוס, אשר היו הניתנת הצלחה בניסויים קליניים בשלב מאוחר. עבור רוב פלטפורמות אלה, המאמצים מכוונת כלפי שינוי הגנום וירוס כדי לשפר את הטיפול. למשל, כדי להגביר את הגידול ירידה לפרטים, נגיף מסוים גנים נמחקו או מוטציה להגביל באופן משמעותי את שכפול ויראלי תאים נורמליים, אך לא תאים סרטניים. במקרים מסוימים, transgenes נוספו כמו GM-CSF (גרנולוציט מקרופאג המושבה-מגרה פקטור) פלאטין התגובה החיסונית או ש ח (סודיום יודיד symporter) כדי לאפשר הדמיה vivo בתוך ספיגת radioiodide הסלולר עבור טיפולית מטרות. עם זאת, היו מעט מאוד עבודה ממוקדת על גנים המארח/גידול מניפולציה לחקור את ההשפעה של גנים המארח/גידול על שכפול הוירוס oncolytic. עם כניסתו של טכנולוגיית הקרנה תפוקה גבוהה, עכשיו זה אפשרי כדי לחקור מארח-וירוס אינטראקציות בקנה מידה הגנום וכדי לפענח הזדמנויות כדי לתפעל את הגנום המארח כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic (שבתוך16, 17,18).
דווח המחקר המפגינים ההוכחה-של-הרעיון הראשון לשימוש תפוקה גבוהה גנטי ההקרנה כדי לזהות מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic. לגלות גנים המארח לווסת את Maraba וירוס oncolysis, כמו כלבת oncolytic כרגע נבדק בשלב II ניסויים, ואני ערכנו ברמת הגנום RNAi המסכים על פני שלוש שורות תאים גידול שונים בכפילות עם siRNA (התערבות RNA קצר) ספריית מיקוד גנים 18,12015. ניתוח מסלול בנפילות שאותרו במסכים חשף העשרה של חברי המסלולים תגובת הלחץ בחדר המיון (רשתית תוך-פלזמית). בחרנו 10 כדורי בתוך המסלולים הללו עבור אימות משני באמצעות siRNA עם רצפי מיקוד שונות מאלה של המסך הראשי. כחלק מאימות שלישוני, ערכנו ניסוי הצלה עם IRE1α (אינוזיטול הדורשים אלפא אנזים 1) המאשרת החיסול בוצע על המטרה. במבחנה ויוו ובדיקה של שימוש מעכב מולקולה קטנה של IRE1α הביאה יעילות משופרת באופן משמעותי oncolytic.
. Workenhe et al. 12 ניצח גם ברמת הגנום RNAi מסך באמצעות shRNA lentiviral במאגר של (קצר סיכת ראש ה-RNA) ספריית מיקוד גנים 16,056 כדי לזהות גורמים מארח הגבלת נגיף הרפס סימפלקס האדם סוג 1 (HSV-1) מוטציה בתיווך KM100 oncolysis של השד תאים סרטניים. במסך הראשי, הם זיהו את הגנים 343 את נוקאאוט של איזה להוביל cytotoxicity משופרת של תאים הנגועים KM100 על פני תאים הנגועים ואימץ; הם נבחרים 24 הגנים האלה עבור אימות משנית. מתוך 24 גנים, גנים 8 אומתו המסך המשני עם אחד מהם להיות SRSF2 (סרין/ארגינין-עשיר שחבור פקטור 2), אשר לאחר מכן אושרה באמצעות ניסוי גנטי הצלה במהלך אימות שלישוני. הקבוצה המשיך לזיהוי DNA טופואיזומראז מעכב כימותרפיות מופחתת זירחון של SRSF2, הראה כי הטיפול בשילוב של HSV-1 KM100 עם הפניה זו מעכב להישרדות מורחבת של עכברים נושאות TUBO.
במחקרים שהוזכרו לעיל, עקבו אחרי זרימת עבודה דומה. זה החל עם מסך ראשי ברמת הגנום RNAi ואחריו מסך משני על מספר נבחר של בנפילות שאותרו במסך הראשי. זאת בעקבות לימודי אימות שלישוני, שכללה המאשר כי הלהיט היה על המטרה על ידי ביצוע גנטי להציל ניסויים חוץ גופית בתוך עם אימות האולטימטיבי שבוצעה על-ידי מניפולציה את המוצר ג'ין היעד בתוך vivo. במאמר זה, אנו קודם מספקים פרוטוקול כללי עבור פיתוח, אימות של assay siRNA-הקרנה תפוקה גבוהה, אשר כרוכה בקביעת התנאים אופטימליים תרביות תאים, כמות של וירוס, ואורך של זיהום. אנו מציעים גם פרוטוקול מפורט לביצוע עיקרי מסך siRNA תפוקה גבוהה, כמו גם תיאור של הכללית של השיטה לביצוע במסך משני אימות ובדיקת שלישוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פיתוח וואלידציה של siRNA תפוקה גבוהה הקרנת assay
הערה: עבור כל הניסויים, השתמש צמיחה באגירה Hepes המדיה המתאימה עבור כל קו תא. לקבלת סקירה כללית של זרימת העבודה של אופטימיזציה assay אימות שלישוני, ראה איור 1 .
- קביעת תנאי האופטימלית תרביות תאים
- בחר קו תא הגידול או אידיאלי הגידול במספר תאי שורות עם אשר למטב את התנאים תרביות תאים (למשל 786-O, NCI-H226, SF268, U373, OVCAR-8, U20S; ראה דיון יותר על הבחירה של שורות תאים).
- בחר ריאגנט תרביות תאים או כמה כדי לבדוק. יתכן צורך לבדוק מספר תקנים ריאגנטים, כפי חלקם עשויים להיות רעילים יותר או יעיל יותר מאחרים ב קו תא נתון. כמו כן, זכור כי כמה עשוי להשפיע על זיהום בנגיף או עשוי ליצור רקע אות על הדמיה.
- להחליט על חיובי [e. ג siRNA מיקוד mRNA PLK-1(Polo Like Kinase 1), אשר גורם מוות תאי] ושלילי תרביות תאים פקדים (למשל ללא פילוח siRNA).
- לפי התקנון תקנים הפוכה הכימית תרביות תאים מסוים, אך משתנים הכמות של תרביות תאים ריאגנט (למשל 0.05, 0.1, 0.15 ו- 0.2 μL/טוב) ותא זריעה צפיפויות (למשל 625, 1250, 2500 תאים/טוב). כוללים/בית בתנאים הבאים: לא מטופל תאים, מיצגי transfected תאים (כלומר תאים בתוספת תקנים ריאגנט) ותאים transfected עם תרביות תאים חיוביים ושליליים שליטה siRNA (ראה איור 2A צלחת מדגם פריסה).
- באופן כללי, להתכונן דילולים 80 nM של siRNA בכל ריכוז סופי בבאר של 10 ננומטר (בהתאם הספרייה, ריכוז גבוה יותר של siRNA העשויים להידרש). אלא אם צוין אחרת, לדלל את siRNA עם תרביות תאים הכימית diluent. להכין דילולים מהתרכובת תרביות תאים.
- Pipet 5 μL של siRNA לכל טוב ואחריו μL 5 של ריאגנט תקנים מדולל. כדי להקל על שלב זה, להפיץ לאורך טור של צלחת U-התחתון 96-ובכן, mixes siRNA את diluent siRNA לבד (עבור לא מטופל מעושה transfected תאים). להפיץ לאורך עמודה שנייה, ריאגנט מדולל תרביות תאים, תרביות תאים ריאגנט diluent לבד (עבור תאים ללא טיפול).
- שימוש pipet אלקטרוניים, pipet 5 μL/טוב של תכולת העמודה הראשונה המכילה siRNA או siRNA diluent לתוך הבארות המקביל של צלחת 384-ובכן ואחריו 5 μL טוב של ריאגנט תקנים מדולל או תרביות תאים ריאגנט diluent מ העמודה השניה.
- Centrifuge את הצלחות ב- g 1026 x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר תקופת דגירה של במועד שנקבע הכימית תרביות תאים (למשל 5-20 דקות).
- ואילו הלוחות הם המקננת, להכין תא השעיות של צפיפויות שונות. Pipet 30 μL של התא השעיה לכל טוב. לפני הצבת הלוחות בחממה, תן את הצלחות לשבת למשך 45-60 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר ליישוב אחיד של תאים19.
הערה: אם תקופת הדגירה רשם הכימית תרביות תאים עם siRNA קצרה, להכין את המתלים תא לפני הדגירה. - תקופת דגירה של 48 עד 72 שעות בהתאם לאורך הרצוי של נוקאאוט שבחרת עבור המסך.
- להכין מתקן של צביעת פתרון בהיקף של פורמלדהיד, Hoechst 33342 ו- PBS (באגירה פוספט תמיסת מלח) עבור ריכוז סופי כל היטב של פורמלדהיד 4% ו- 5 ug/mL של Hoechst 33342. לפי הצורך, לנסות גבוה יותר (למשל 7.5 ug/mL) או ריכוז נמוך (למשל 2 ug/mL) של Hoechst אם האות הוא חלש מדי או חזקים מדי, בהתאמה.
- לוותר על 30 μL של הפתרון תיקון, צביעת ישירות לתוך כל בארות. דגירה הלוחות למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. חנות את הלוחיות ב 4 º C. אם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי-שאינם, לשטוף את הצלחות עם PBS בעזרת דסקית צלחת; ברוב המקרים, כביסה אינה נחוצה כאשר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
- לפתח תסריט לכמת את מספר התאים לכל טוב.
הערה: קיימות מספר חבילות התוכנה למטרה זו, בעוד אחד אולי יש דרכים שונות ליצירת סקריפטים, יש להם בדרך כלל כל אמצעי זיהוי גרעינים, תאים ואזורים מעניינים, כמו גם חישוב עוצמות, מאפיינים מורפולוגיים. בעת פיתוח תסריט ההקרנה, חשוב לקחת בחשבון את הזמן הנדרש כדי להריץ את הסקריפט לכל צלחת וכדי אולי לכלול מדידות רק חיוני כדי למזער את זמן העיבוד. לדוגמה, כדי לכמת את מספר הטלפון הנייד, אחד יכול לחשב את השטח Hoechst לכל מעל עוצמת שצוין; לכמת התפשטות וירוס, אחד יכול לחשב את השטח (חלבון פלואורסצנטי ירוק) GFP לכל מעל עוצמת שצוין. קובץ ה-script "pared למטה" יהיה צורך להשוות את התסריט משוכלל יותר כדי להבטיח שהמידע חיוני לא אובד. - לנתח את התוצאות כדי לקבוע את התנאים אופטימליים תרביות תאים, הסכום ריאגנט תרביות תאים, תא זריעה צפיפות תוצאות במוות בתא משמעותיים (0-30% הישרדות cell) והיא מינימלית רעילה לתאים (למשל 90-100% הישרדות cell). הערה: זה עלול לקחת יותר זמן להתבונן על פנוטיפ מוות תא בשורות תאים עם פעמים זמן ההכפלה. ראה איור 2B ו- 2 C לתוצאות נציג. בנוסף, עליך לוודא כי התאים transfected עם siRNA ללא פילוח הם כ- % 90-100 confluent בזמנו של קיבעון כפי בהמשך אחד לא רוצה להדביק תאים של confluency הזה.
- קביעת כמות אופטימלית וירוס ואורך של זיהום
- בצע את השלבים תקנים הפוך אותו כפי שתואר לעיל (ראה 1.1.4.1 כדי 1.1.4.4); עם זאת, להשתמש רק בתנאי תקנים אופטימלית (ראה 1.1.8) (למשל עבור תאים 786-O: 1500 תאים/טוב, 0.05 μL/טוב של RNAiMAX), בנוסף, לכלול בארות נוספות כדי להיות נגוע בווירוס [למשל וולס עם תאים ללא טיפול, מעושה transfected תאים, התאים transfected עם לא פילוח siRNA ותאים transfected עם פקדים וירוס חיובי אם אלה ידועים (קרי siRNA מיקוד גנים המארח לעכב או לשפר את שכפול)].
- ראה איור 3A מדגם פלייט פריסה. תקופת דגירה של 48-72 שעות.
- להדביק את הבארות וירוס נוסף בווירוס oncolytic ביטוי חלבון כתב פלורסנט (למשל GFP) עם מגוון של multiplicities של זיהום (MOIs) (למשל 0.001 עד 10; הטווח שנבחר להיות תלויות את רמת ההתנגדות או הרגישות של הקו הסלולרי.). כוללים גם נגוע בארות. Pipet 40 μL של כל דילול וירוס לכל טוב עבור אמצעי אחסון הסופי של 80 μL. Centrifuge כל צלחת ב g x 400 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- זיהום הבאים, התאים לחיות עם גבוהה-תוכן, תמונה אוטומטי מיקרוסקופ במרווחי זמן קבועים (למשל כל h 4-8). ראה איור 3B ו- 3 C.
- לפתח תסריט לכמת התפשטות וירוס (למשל אזור GFP לכל טוב) (ראה 1.1.7). לנתח את התמונות, בחר נקודת הזמן של משרד הפנים לאפשר איתור בעליות ובירידות ההתפשטות. ודא את הזמן ו- MOI ליפול בתוך טווח ליניארית כדי להקל על זיהוי של שינויים קטנים ההתפשטות. מעריכים את Z-הגורם (או Z') כדי להפוך את נקודת זמן נתון MOI.
הערה: הערכת גורם Z = 1-3 (σp + σn) / | μp- μn| איפה σp סטיית התקן במדגם של הפקדים וירוס חיובי, σn הוא סטיית התקן במדגם של הנגיף שלילי פקדים; μp הוא ממוצע המדגם של וירוס חיובי הפקדים ועל μn המדגם של הפקדים שלילי. Z-גורם המשוערת של 0.5 - 1.0 הוא נחשב להיות assay מעולה ומתאים הקרנה20,21. - לאשר כי siRNA פקד וירוס שלילי שאין לה השפעה על שכפול הוירוס על ידי השוואתו הבארות transfected ולא טופלו מעושה. לעיתים קרובות יש צורך לבחון מספר פקדים שליליים כמו כמה siRNA שלילי פקדים יכולים להשפיע על שכפול הוירוס.
- בצע את השלבים תקנים הפוך אותו כפי שתואר לעיל (ראה 1.1.4.1 כדי 1.1.4.4); עם זאת, להשתמש רק בתנאי תקנים אופטימלית (ראה 1.1.8) (למשל עבור תאים 786-O: 1500 תאים/טוב, 0.05 μL/טוב של RNAiMAX), בנוסף, לכלול בארות נוספות כדי להיות נגוע בווירוס [למשל וולס עם תאים ללא טיפול, מעושה transfected תאים, התאים transfected עם לא פילוח siRNA ותאים transfected עם פקדים וירוס חיובי אם אלה ידועים (קרי siRNA מיקוד גנים המארח לעכב או לשפר את שכפול)].
- האימות הסופי של וזמינותו ההקרנה תפוקה גבוהה
- חזור על שלבים 1.2.1 ו- 1.2.2 לעיל, אבל זה הזמן להדביק תאים עם MOI האופטימלית. במקום הדמיה בשידור חי, לתקן, מכתים את הצלחת (כפי שמתואר 1.1.5 ו 1.1.6)-האופטימלית נקודת זמן (ראה 1.2.4).
- תמונה את הצלחת. לנתח את התוצאות תוך שימוש מאותו תסריט אשר ישמשו עבור המסך (ראה 1.1.7 ו 1.2.4). לאשר את תנאי תרביות תאים (כלומר טוב נוקאאוט בבארות transfected עם רעילות מינימלית בבארות transfected עם תרביות תאים שלילי שליטה ובקרה של תרביות תאים חיוביים). להעריך את הגורם-Z כדי לקבוע את היציבות של וזמינותו (ראה 1.2.4).
- בדיקה נוספת ושיקולים לביצוע ההקרנה תפוקה גבוהה
- מבחן העמידות של הלוחות microtiter כמו צלחות יכול לפצח במהלך צנטריפוגה, בייחוד כאשר עפעפיו נשמרים לוחות מרובים הם centrifuged בעת ובעונה אחת. כדי להפחית מהצורך, צנטריפוגה ללא עפעפיו (סיפקה לוחיות הרישוי יש כלבי ים), או להקטין את מספר הצלחות centrifuged לכל דלי.
- לבדוק את יציבות המיקס ריאגנט תרביות תאים לאורך זמן. ברגע הכימית תרביות תאים מתווסף הלוחות, ייתכן עיכוב משמעותי לפני התוספת של תאים; לכן, חשוב לדעת את תקופת הזמן אשר המיקס ריאגנט תרביות תאים יישאר אפקטיבי. על המסך, יתכן צורך להכין תאים לפני הוספת המיקס ריאגנט תרביות תאים הלוחות.
- להתכונן באמצעות מנפק נוזלי. לקבוע את אמצעי האחסון הדרושים כדי לשלול ריאגנט תרביות תאים, התאים, וירוס, ולתקן לוקח בחשבון את עוצמת הקול כי המטען אבובים, אמצעי האחסון איבדה dispensing מראש (אם יחידת תכונה זו), ונפח שיורית נדרש לבקבוקים משמש מחלק.
- הגדר ובדוק את התוכניות ישמש עבור dispensing ריאגנט תרביות תאים, התאים ו וירוס. כדי למזער האובדן של ריאגנט תרביות תאים, גבול, במידת האפשר, המספר של טרום dispenses. ליצור פרוטוקול כיול מנפק נוזלי ולבדיקה דיוק ואמינות שלה.
- להתכונן dispensing בצובר של ריאגנט תרביות תאים, התאים ווירוסים
- ראשית קבע את מספר הצלחות לעיבוד באצווה אחת שוקלת את מספר הצלחות של תאים, כי יתכן כבניין להיות trypsinized בעת ובעונה אחת, מספר הצלחות microtiter שניתן centrifuged בעת ובעונה אחת, את משך הזמן הדרוש לעיבוד אצווה אחת של צלחות עם מנפק נוזלי, וגם את הזמן הנדרש עבור הדמיה. הערה: בדרך כלל, עיבוד כ 30 צלחות בכל פעם הוא די ריאלי והוא עיבוד אצוות 3 של צלחות לניהול ביום אחד.
- לאמת מדעית את עוצמת הקול של תרביות תאים ריאגנט נדרש לעיבוד אצווה אחת של צלחות. בדוק כי אמצעי אחסון זה היא נאותה על ידי שחולק 5 μL של מים מזוקקים מספר פעמים על פני לוח אחד שווה ערך מספר פעמים כי יידרשו לעיבוד אצווה אחת.
- כדי להבטיח אפילו חלוקת תאים, להעריך את הזמן הדרוש כדי לוותר על התאים על פני אצווה אחת של צלחות. להכין בקבוק המכיל כמות התאים הדרושים עבור אצווה, לוותר על התאים לתוך עמודות מרובות של צלחת במועד, במרווחי זמן קבועים במהלך אותו הזמן שייקח לוותר על פני אצווה של צלחות. מבחן התדירות יהיה צורך לערבב את התאים כדי לשמור על ריפודי כתופיים של תאים.
- כדי להבטיח הפצת וירוס אפילו, חזור על שתוארו לעיל (ראו 1.4.4.3), אבל הפעם dispensing וירוס לתוך בארות confluent. אם הווירוס לא מופץ באופן שווה, שקול מכין הנגיף צינורות חרוט, vortexing כל שפופרת לפני dispensing.
- מסלול הצמיחה של התאים כדי לקבוע את ציר הזמן לגידול מספיק תאים עבור המסך. בנוסף, לקבוע את המספר הממוצע של תאים אותם ניתן לקצור לכל צלחת של תאי גידול בשלב יומן כדי להיות מסוגל להעריך את מספר הדרושים עבור המסך.
- שלבי ההכנה האחרון להקרנה תפוקה גבוהה
- למעלה כדי חודש לפני תחילת ההקרנה, לקבוע כל החומרים הדרושים עבור המסך. להזמין כל ריאגנטים הנדרש (ראה חומרים). להבטיח הכמות הנדרשת של וירוס זה על יד (רצוי, להשתמש באותה המניה ששימש במהלך המיטוב.).
- עד כדי שבועיים לפני תחילת ההקרנה, להפשיר, לגדל את התאים הדרושים עבור המסך. להבטיח את הזמינות של צנטריפוגה, דליים צנטריפוגה מרובע.
- במהלך השבוע לפני תחילת ההקרנה, להכין בקבוקים מדיה הפוכה תרביות תאים, זיהום, מלאי של 70% אתנול, 2 X תרביות תאים ריאגנט diluent (למשל 2 X Opti-מ), אם יש צורך (למשל אם הספרייה siRNA הוא מדולל ב RNase-free מים, אחד לא רוצה להשתמש 2 X transfect תאים), ואת aliquots של וירוס (אחת בכל אצווה של לוחות). ודא את התנאי של התאים.
- להכין פתרון מניות של צביעת הכסט 33342 (למשל 5 מ"ג/מ"ל). להכין צלחת שיווי המשקל, אם יהיה צורך צריך שתוציאו.
- ודא שדסקית צלחת נמצא במצב פעולה תקין אם ייעשה בה שימוש. ודא שהוא מנפק נוזלי מכוילת כראוי, שחולק בצורה מדויקת, בדיוק. בנוסף, עליך לוודא שהתוכניות מוגדרות כהלכה על מנפק נוזלי.
2. קיום המסך הראשי תפוקה גבוהה
הערה: לפני התחלת המסך RNAi, צלחות microtiter (למשל צלחות. ובכן 384) צריך להיות מופנים עם ספריית siRNA ופקדים ההקרנה. השלבים הבאים הטוב בניצוחו של שני אנשים עם אדם אחד (כלומר אדם א) להיות אחראי בעיקר על מחלק את ריאגנט תרביות תאים ותאים על פני הלוחות, ולהיות את המשתמש השני (כלומר אדם B) אחראי צריך שתוציאו את הצלחות מייד לפני תרביות תאים, להכנת התאים. בסוגריים כלולים קצת פרטים עבור עיבוד אצווה אחת של צלחות 33 (כלומר חצי של הספריה) עם הקו תא 786-O.
- הכנה תקנים הפוכה
- אדם ת מקום מספיק מדיה, טריפסין, PBS הדרושים לעיבוד אצווה אחת של צלחות באמבט מים 37 º C. אופציונלי: Trypsinize צלחת של תאים, לספור את מספר התאים לכל צלחת על מנת לספק הערכה בזמן אמת של מספר לוחות הדרושים לכל אצווה.
- להשיג אוסף של לוחות (למשל 33 צלחות) מהמקפיא והמתן 20-30 דקות כדי לאפשר את הצלחות להפשיר. ואילו הלוחות הם מפשירה, להמשיך לשלבים הבאים.
- אדם ת Pipet לתוך חרוט 50 מל צינורות הכמות של תרביות תאים ריאגנט diluent הדרושים לעיבוד אצווה אחת של צלחות (למשל 2 x 37.125 מ ל) ומניחים אותם בתוך אמבט מים 37 º C. למלא שני בקבוקים עם 70% אתנול (למשל בקבוקים 250-500 מ ל). למלא שני צינורות חרוט 50 מ עם PBS ואחד עם מים מזוקקים.
- אדם ת לטבול מנפק נוזל צינורות לתוך בקבוק של 70% אתנול. אם את הטיפים לא ישמש עבור dispensing תרביות תאים הכימית (למשל אם הבארות החיצוני של הצלחת שאינם בשימוש), נתק תחילה את צינורות מיותרים. מניחים חתיכת המסיכה קלטת סביב הצנרת כדי לסמן את הנקודה למטה אשר לאורך צינור יכול להיחשב סטרילי. פריים כ 25 מ. שופכים אתנול נוספים לתוך הבקבוק כדי להחליף את אובדן הנפח. תנו הצנרת לשבת אתנול למשך תקופה מינימלית של 5 דקות.
- אדם ב': התכונן trypsinize תאים. תרסיס למכסה תרביות רקמה (TC) עם 70% אתנול. תרסיס ולמקם את הצורך pipets, טיפים, בקבוקים, צינורות microfuge להכנת תאים בשכונה (ראה 2.2.1.1 ו 2.2.1.2). Centrifuge הלוחות אטום ערכות ב g 1026 x למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את המכסים הצלחות בשכונה TC, אם בעבר נקבע כי הלוחות לק במהלך צנטריפוגה כאשר עפעפיו נשמרים (ראה 1.4.1).
- אדם א': הסר החותמות הצלחות. לפני, במהלך או אחרי החותמות הוסרו (בהתאם לתקופת הדגירה הנדרש), pipet הכמות הנדרשת של תרביות תאים ריאגנט (למשל 375 μL/צינור עבור ריכוז סופי של 0.05 μl RNAiMAX/הבאר) לתוך הצינורות חרוט המכילה את diluent ריאגנט של תרביות תאים טרום ומחוממת (למשל 37.125 mL/צינור).
- מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים. תקופת דגירה בטמפרטורת החדר של במועד שנקבע הכימית תקנים בשימוש (למשל 0-10 דקות).
- תרביות תאים הפוכה
- יש אדם B להשלים את המשימות הבאות.
- מתחילים trypsinizing התאים (למשל 3 צלחות של תאים 786-O). האחות התקשורת של כל צלחת. לשטוף עם 9 מ של PBS. Pipet 3 מ"ל של טריפסין לכל צלחת. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ- 5 דק Resuspend התאים 22 מ של מדיה. Pipet לאורך 10 פעמים.
- לשלב התליה תא של כל צלחת תרביות רקמה לתוך בקבוק סטרילי. מערבבים התליה תא על-ידי היפוך. Pipet aliquots 1 מ"ל של התליה תא לתוך שני צינורות microfuge נפרדים. להסיר כל שפופרת microfuge מדגם ולספור את התאים. לחשב את הנפח של תא ההשעיה הדרושים עבור צפיפות הדרושים (למשל 1500 תאים/טוב), ולהכין מספיק התליה תא מדולל (למשל 500 מ"ל) לוותר על פני אצווה אחת של צלחות.
- יש אדם לבצע את המשימות הבאות במקביל אדם ב'
- ריק מנפק נוזל צינורות של אתנול. פריים את הצנרור עם 25 מ של PBS ולאחר מכן לרוקן את הצנרור. היה זהיר בעת טיפול הצנרת כדי להבטיח את המקטע של אבובים מתחת המסיכה קלטת תהיה שקוע ריאגנט תרביות תאים, בהמשך התליה תא נשמרת סטרילי. להגדיר לגזרים צלחות שניתן להיעשות בבטחה עם שפופרת חרוט אחת של תרביות תאים ריאגנט פתרון.
- Pipet פתרונות ריאגנט של תרביות תאים למעלה ולמטה 10 פעמים. פריים את הצנרור עם הפתרון ריאגנט תרביות תאים. כדי למזער האובדן של ריאגנט תרביות תאים, פריים עם פתרון מספיק לנקות בקושי את הטיפים. בחר את התוכנית הנכונה על מנפק נוזלי, לוותר על 5 μl של תרביות תאים מגיב לכל טוב.
התראה: לעקוב מקרוב אחר רמת הכימית תקנים כך זה מתחדש לפני שנגמר. השלמת הלוחיות כי הם קבוצה בנפרד לתת רמז כדי להוסיף עוד תקנים ריאגנט פתרון. - Centrifuge את הצלחות ב- g x 1026 עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. הפעם עפעפיו יהיה, ולכן יהיה צורך centrifuge פחות צלחות בכל פעם כדי למנוע סדיקה (למשל 2 צלחות לכל דלי). תקופת דגירה הלוחות בטמפרטורת החדר של במועד שנקבע הכימית תקנים בשימוש (למשל 10-20 דקות).
- במהלך הדגירה, לרוקן את הצנרור של הפתרון ריאגנט תרביות תאים, ולמקם אותו לתוך צינור חרוטי 50 מ ל מלא המכיל PBS. יש לשטוף את הצנרור עם 25 מ של PBS מאת לקרקע וריקון.
- אם יותר טיפים עומדים לשמש מחלק תאים מאשר שימשו dispensing ריאגנט תרביות תאים, לצרף מחדש את הצנרור שאינם בשימוש, לעקר מחדש את כל הצנרת עם אתנול 70% לפני השטיפה את הצנרור עם PBS (ראו 2.1.2.2).
- מערבבים את הבקבוק המכיל התליה תא ברגע שהוא מוכן. מקם את הצנרור ההשעיה תא, ולאחר פריים מספיק כדי לראות כל עצה dispensing כראוי. לוותר על 30 μL לכל טוב של התליה תא על-פני כל הלוחות. במידת הצורך, מערבבים התליה תא במרווחי זמן קבועים כדי למנוע שיקוע.
התראה: לפעמים טיפות השעיה המכיל התקשורת עלול לדבוק הצדדים טיפים. כאשר זה הוא ציין, תשאף בהקדם האפשרי או לנגב עם רקמת נטולת התיז על 70% אתנול. - רוקן את הצנרור של התליה תא. יש לשטוף את הצנרור עם 25 מ ל- PBS, ואחריו כ 50 מ ל מים מזוקקים.
- לאפשר את הצלחות לשבת למשך 45-60 דקות מעת של תא זריעה בטמפרטורת החדר לפני שחזר את הצלחות החממה. דגירה הלוחות באינקובטור באין מפריע לאורך הרצוי של ג'ין שתיקה (למשל 48 שעות) (ראו 1.1.4.5).
- יש אדם B להשלים את המשימות הבאות.
- זיהום
- כדי לחסוך זמן, ביום שלפני מדביק את התאים, pipet לתוך סטרילי בקבוקים הסכום המדויק של המדיה הנדרש כדי להדביק את כל אצווה של צלחות כולל מדיה נגוע-וולס (למשל 2 x 350 mL ו- 2 x 50 mL עבור לוחות 33). בנוסף, מבחן מנפק נוזלי עבור דיוק ודיוק, לכייל מחדש במידת הצורך.
- לחמם את המדיה ב- 37 מעלות צלזיוס. למלא שני בקבוקים עם 70% אתנול, שני צינורות חרוט 50 מ עם PBS, אחת עם מים מזוקקים. ודא כי לצנטריפוגה בטמפרטורת החדר.
- לחטא את הצנרור עם 70% אתנול, ולשטוף עם PBS כפי שתואר לעיל (ראה 2.1.2.2, 2.2.2.1). בעוד הצנרת יושב האתנול, pipet הנפח מדויק של וירוס נדרש לתוך הבקבוק המכיל את המדיה בעבר שהוכנו עבור זיהום (ראה 2.3.1). יש לשטוף את הצנרור עם PBS על-ידי הטרמה 25 מ ל וריקון אז.
- הסר את הצלחות של החממה, למקם אותם לתוך המנוע TC. פריים את הצנרור עם המדיה. לוותר על μL 40 של מדיה לתוך הבארות נגוע השליטה. לרוקן את הצנרור של מדיה ולשטוף עם 25 mL PBS. (לקבלת התראה, ראה 2.2.2.5)
- לאחר ערבוב את הווירוס, למקם את הצנרור לתוך הבקבוק המכילים את הנגיף. לוותר על μl 40 של וירוס על פני הלוחות. Centrifuge הלוחות למשך 30 דקות ב 400 g x בטמפרטורת החדר. להחזיר את הצלחות החממה. דגירה של הלוחות עבור משך הזמן (למשל 24 שעות ביממה) נקבע בעבר (ראה 1.2.4).
- תיקון, צביעת תאים
- כדי לחסוך זמן, ביום שלפני תיקון, להכין בקבוק לתקן צביעת פתרון המכילים פורמלדהיד, PBS (למשל mL 179 פורמלין 37% ו- 270 מ של PBS עבור ריכוז סופי של 4% פורמלדהיד) עבור כל אצווה של צלחות, אך השמט צביעת הכסט. אחסן דליק ארון מן האור.
- יש לשטוף את הצנרור עם 70% אתנול וביו -PBS כפי שתואר לעיל (ראה 2.1.2.2, 2.2.2.1). הוסף את הנפח הנדרש של Hoechst (למשל. 2.5 מ ל 5 מ"ג/מ"ל של Hoechst עבור ריכוז סופי בבאר של 7.5 μg/mL) התיקונים, צביעת פתרון ומיקס.
- לוותר על 30 μL של תיקון ושל מכתים פתרון על-פני כל הלוחות. מקם את הצלחות החממה למשך 30 דקות. הדגירה הבאים, להחיל על החותמים על הצלחות, ולאחסן את הצלחות ב 4° C מוגן מפני אור. לשטוף את הצלחות במידת הצורך (ראה 1.1.6).
- הדמיה וניתוח תמונה
- תמונה הצלחות עם מיקרוסקופ אוטומטיות, גבוהה-תוכן. השתמש בהגדרות נקבע בעבר, אבל קודם לבדוק את ההגדרות כדי להבטיח שכל התאמות צריך להתבצע.
- לכמת את GFP (או אחרים כתב פלורסנט) אזור ואזור Hoechst לכל טוב באמצעות קובץ ה-script שפותחו בעבר (ראה 1.3.2). מבחן ה-script עם קומץ של צלחות קודם כדי לקבוע אם יש שינויים קלים צריך להתבצע לפני ניתוח שכל הלוחיות אצווה.
- לזהות להיטים. הערה: השיטה Z-ציון/MAD (סטיית מוחלטת החציוני) חזקה היא שיטה המשמשת בדרך כלל למטרה זאת. בדרך כלל, עשרות > 2 או <-2 מוגדרים כמו חתך-offs. מומלץ להשתמש בשיטה זו כאשר הדגימות siRNA המבוזרים באופן אקראי הצלחות, לא, לדוגמה, כשהם מקובצים לפי הפונקציה הדגימות משמשים כפקדי שלילי דה-פקטו . לסנן siRNAS ציטוטוקסיות כצפוי אלה להפחתת הלא ספציפית וירוס להפיץ (ראה דיון פרטים נוספים על סינון כניסות ציטוטוקסיות).
3. מסך משני אימות של להיטים עם הספרייה shRNA TRC (האיגוד RNAi)
הערה: ראה דיון לקבלת פרטים על בחירת להיטים משני אימות ו האפשר הקרנת טכנולוגיות. אם הטכנולוגיה siRNA נבחרה עבור אימות המשני, באותו assay פיתוח הפרוטוקול יכול לשמש שימש עבור המסך הראשי (ראה 1).
- להשיג ספרייה מותאמת אישית TRC shRNA מיקוד הגנים המועמד של עניין מניות גליצרול.
- להכין את ה-DNA פלסמיד איכות תרביות תאים של המניות גליצרול. הערה: פרוטוקול מפורט (קרי "shRNA/sgRNA/ORF גליצרול, פלסמיד DNA הכנה") ניתן למצוא כאן: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
- לייצר lentiviruses לבטא shRNA מיקוד הגנים של עניין עם פלסמידים ה-DNA. הערה: פרוטוקול מפורט לייצור lentivirus ב 96-ובכן צלחות [קרי "shRNA/sgRNA/ORF תפוקה גבוהה ייצור ויראלי (96 טוב)"] ניתן למצוא כאן: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
- להדביק תאים עם lentiviruses. הערה: פרוטוקול מפורט על זיהום lentiviral ב 96-ובכן צלחות (קרי "זיהום Lentiviral") זמין באינטרנט ב- http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
- להדביק תאים בוירוס oncolytic גם הבחירה puromycin הבאים (ראה 3.4 לפרוטוקול הנבחר) של תאים transduced בהצלחה או התמרה חושית הבאות מיד (ללא בחירה puromycin). כדי לקבוע את כמות אופטימלית וירוס ואת משך הדגירה בווירוס, השתמש באותה שיטה המשמשת עבור המסך הראשי.
4. אימות שלישוני
הערה: המטרה של אימות שלישוני הוא לאשר בעיקר כי המכה על המטרה גידול ספציפי, ומגבירה את היעילות ויוו. אחד יכול גם לבדוק אם זה ממיקרו התפשטה על פני קשת של שורות תאים סרטניים
-
אישור זה תמונות ציפורים על הגן המועמד הוא על המטרה
- קודם לוודא כי קיים מתאם בין פנוטיפ ג'ין להחרשת. השתמש באותו וזמינותו שפותחה עבור המסך או לשנותה עבור תבנית 6-טוב להעריך את שיפור או עיכוב של התפשטות בתבנית גדולה יותר. לנהל את הזמן-קורס עם תאים transfected עם siRNA פילוח של gene (s) עניין פלוס ומינוס וירוס.
- תמונה הבארות המכיל תאים הנגועים בנגיף, ולאסוף את lysates תא מן הבארות נגוע במרווחי זמן קבועים. לקבוע קיים מתאם בין ג'ין להחרשת, שיפור או עיכוב של התפשטות. להעריך ג'ין להחרשת כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) ו/או סופג המערבי.
- לבצע ניסוי גנטי הצלה כדי לאשר שהחיסול הוא על המטרה. הערה: בניסוי החילוץ אופייני, הגן המועמד הוא דפק למטה עם RNAi בעוד באותו הזמן התאים הם transfected transiently עם cDNA RNAi עמידים (למשל ortholog של הגן) לבטא את הגן המועמד כדי לקבוע אם פנוטיפ של הגן שוחזר או "לחלץ". גם יכול להיות מועסק שורות תאים יציב overexpressing עמיד RNAi cDNA של הגן המועמד עניין.
- לחלופין, במקום ניסוי גנטי הצלה, להשתמש מבחני אורתוגונלית מרובים כדי לוודא המכה על המטרה [למשל לקבוע אם פנוטיפ זהה מתקבל על נוקאאוט של הגן היעד עם siRNAs מרובות, על נוקאאוט של הגן יעד מרובות שורות תא יציב לבטא shRNA נגד הגן היעד ובעת נוקאאוט עם CRISPR (עמודות מקובצות באשכולות interspaced בקביעות קצר palindromic חוזר)-טכנולוגיית Cas9 בשורות תאים מרובים.].
-
אישור כי הלהיט הגידול הספציפי, שמחליש המפוזרים על פני טווח של שורות תאים סרטניים
- התנהגות של assay דומה כמו 4.1.1, אבל עם תאים נורמליים, כמו גם עם שורות תאים סרטניים אחרים.
-
אישור כי מניפולציה של הגן המועמד מגביר את היעילות אין ויוו
הערה: המתוארים להלן הם שלוש שיטות אפשריות לטיפול הגן. המטרה בטווח vivo.- למצוא תרופה כדי לתפעל את המטרה ג'ין. אם יש תרופה כגון מעכב מולקולה קטנה שמכוונת אותו גן, לנהל אותו עם וירוס oncolytic vivo בתוך. חשוב לקבוע את התזמון אופטימלית של מתן התרופה.
- מהנדס הווירוס לעכב או overexpress המטרה ג'ין תלוי אם אחד רצונות לעכב או לשפר את המטרה ג'ין. כדי לעכב את הגן, מהנדס הווירוס oncolytic לבטא שלילית דומיננטית של הגן או shRNA האקספרס מיקוד הגן. כדי לשפר את הביטוי של גנים היעד, כפיל הווירוס oncolytic עם transgene overexpressing את הגן.
- מהנדס שורות תאים עם הגן של הפיל-למטה או הפילו-אאוט באמצעות shRNA או טכנולוגיה CRISPR-Cas9, בהתאמה. שתל הקו תאים מהונדסים ובין תא פראי-סוג הקו ויוו , לאחר מכן להדביק בנגיף oncolytic. הערה: שיטה זו משמשת הוכחה-של-עיקרון, יכול לעזור לקבוע אם להשקיע זמן ומשאבים לפתח תרופה כדי לתפעל את ג'ין ויוו, לדוגמה, יהיה משתלם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה כללית של זרימת העבודה לזיהוי מטרות המארח כדי לשפר את הטיפול oncolytic וירוס מוצג באיור1.
כמופיע באיור1, השלב הראשון החיוני להתנהלות מסך RNAi תפוקה גבוהה הוא פיתוח וזמינותו. איור 2A מספק פריסה צלחת מדגם וזמינותו אופטימיזציה תרביות תאים. איור 2B מורכב להחליפן בתמונות של התוצאות הצפויות, איור 2C חלקת נציג התוצאות הצפויות. בעקבות siRNA נוקאאוט של PLK-1, גן כי גורם מוות תאי והוא יכול לשמש כפקד חיובי כדי לנטר את יעילות תמונות ציפורים siRNA, שניתן היה לצפות, הישרדות התא יהיה בין 0-30%, אלא אם כן שורת התאים יש הרבה זמן הכפלת זמן ובמקרה זה ייקח l onger להתבונן פנוטיפ למוות של התא. SiRNA ללא פילוח צריך גם להיות מינימלית רעילה לתאים עם ההישרדות היחסי דומה לזה של תאים שלא טופלו.
אלמנט מרכזי פיתוח וזמינותו היא לקבוע למשרד הפנים בו ברצונך להדביק את התאים ואת אורך הזמן זיהום. איור 3A מספק פריסה צלחת מדגם לקביעת הסכום של וירוס והאורך של דגירה בווירוס. איור 3B מתארת את התוצאות של זמן חיים-קורס של 786-O תאים נגועים vvDD-eGFP (oncolytic וירוס vaccinia לבטא GFP משופרת עם הגנים תימידין קינאז ו פקטורי גדילה Vaccinia שנמחקו) ב MOIs שונים. להחליפן בתמונות של תאים נגועים vvDD-eGFP-MOI 0.05 מוצגים באיור 3C. בהתבסס על תוצאות ההתוויה של איור 3B, אחד עשוי לבחור MOI של 0.05 באורך של זיהום של 21 h כפי זה יאפשר איתור בעליות ובירידות ההתפשטות של כל הזמן-נקודה זו נמצאת בתוך טווח ליניארי, Z-הגורם מוערך ב- ti הזה לי-הנקודה היא 0.6 גדודים המגבירים ועבור גדודים לירידה כפולה. כחלק אימות זה וזמינותו, אחד לא רוצה לתקן את התאים במלון זה MOI, הזמן-נקודה, ולחשב את Z-הגורם.
בעקבות פרוטוקול המתואר, ערכנו ברמת הגנום RNAi מסכי על פני שורות תאים סרטניים שונים שלוש (למשל OVCAR-8, U373, NCI-H226) בכפילות עם ספריה siRNA מיקוד גנים 18,12015. שימוש בשיטת כועס, זיהינו 1008 צפיות משותף לפחות 2 מתוך שורות תאים סרטן 3 (איור 4A). ניתוח מסלול בנפילות שאותרו במסכים חשף העשרה של חברי UPR (חלבון פרש תגובה) מסלולים (חלבון פלזמית-רשת-הקשורים השפלה) עירד (איור 4A). בחרנו 10 כדורי בתוך המסלולים הללו עבור אימות משני באמצעות siRNA עם רצפי מיקוד שונות מאלה של המסך הראשי (איור 4B). כחלק מאימות שלישוני, ערכנו ניסוי גנטי הצלה עם IRE1α ו- ATF6α (הפעלת שעתוק מקדם 6 אלפא) כדי לאשר כי הפיגועים האלה היו למטרה (איור 4C).
איור 1: סכימטי של זרימת עבודה עבור זיהוי מטרות המארח כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic. הצעד הראשון הוא לפתח ולאימות וזמינותו להקרנה RNAi תפוקה גבוהה, כולל אופטימיזציה של תרביות תאים תנאים ידביקו siRNA תאים, לקביעת כמות אופטימלית של וירוס (קרי MOI) להדביק את התאים עם ו משך הדגירה בווירוס. השלב השני הוא לנהל את מסך הגנום כולו תפוקה גבוהה. ספריה siRNA מיקוד גנים ברחבי הגנום כולו יכולה על צלחות microtiter. תאים הם ולאחר מכן הפוך transfected עם הספרייה siRNA. לאחר תקופת דגירה של 48-72 שעות כדי לאפשר ג'ין להחרשת, תאים נגועים עם כמות אופטימלית של וירוס. לאחר האורך האופטימלי של דגירה בווירוס, תאים קבוע, צבעונית, לאחר מכן עם תמונה עם מיקרוסקופ גבוהה-תוכן. לאחר מכן ניתוח תמונה ונתונים יעזור לזיהוי גנים זה לווסת באופן משמעותי את שכפול וירוס, אשר מכונים "להיטים". מסך משני האימות מתבצע על להיטים בחר מהמסך הראשי, בדרך כלל באמצעות siRNA או shRNA עם אזורים שונים זרע. אימות שלישוני ניסויים מבוצעים כדי לאשר הלהיטים הם על המטרה, גידול ספציפי לשפר יעילות ויוו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אופטימיזציה של תרביות תאים תנאים של תפוקה גבוהה RNAi ההקרנה וזמינותו. (א) דגימת צלחת פריסה עבור אופטימיזציה של תרביות תאים תנאים עם שתי שורות תאים שונים. (B) להחליפן בתמונות של תאים 786-O (1500 תאי טוב) מוכתם Hoechst 33342 בעקבות 72 h הדגירה עם תרביות תאים ריאגנט diluent לבד (כלומר לא מטופל), עם ריאגנט תרביות תאים diluent (דהיינו מעושה transfected), ללא פילוח siRNA ועם siRNA מיקוד PLK-1. (ג) נציג נובעת תרביות תאים אופטימיזציה הניסוי מראה 22% הישרדות של תאים transfected עם siRNA PLK-1 (n = 24), 94% הישרדות של תאים transfected עם siRNA ללא פילוח (n = 8). קווי שגיאה = ± SD, סטיית תקן; גודל ברים = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: קביעת הסכום של וירוס ואת משך הדגירה עם וירוס עבור תפוקה גבוהה RNAi ההקרנה assay. (א) דגימת צלחת פריסה עבור מיטוב הכמות של וירוס ואת משך הדגירה בווירוס. עמודים 1 ו- 24 להכיל תרביות תאים פקדים והם נשארו uninfected. עמודות 2 ל-23 מכילות תאים ללא טיפול, מבוים transfected תאים ותאים transfected עם וירוס חיוביים ושליליים שולט כל נגוע של הטווח MOIs החל שום וירוס בעמודות 2 ו- 3. (B) 786-O התאים היו הפוכה transfected עם siRNA ללא פילוח הדגירה במשך 48 שעות. לאחר מכן הם היו נגועים vvDD-GFP-MOIs המצוין, עם תמונה במרווחי 8 שעות החל מ- 5 שעות לאחר הפגיעה (מדד מחירי הבתים. של). אזור ה-GFP מתכוון לכל טוב (± SD) מחושב עבור כל הזמן-נקודה (n = 12), המותווית על הגרף. הגורם-Z מחושב בין הנקודות A ו- B הוא 0.6 והוא הגורם-Z מחושב בין נקודות B ו- C 0.6. (C) ציין נציג תמונות בשידור חי של באר נגוע MOI של 0.05 הזמן-נקודות. הגדלה, 10 x; 9 שדות/טוב; גודל ברים = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: הגנום כולו המסך מזהה ER סטרס התגובה המצור כמו Sensitizer חזק של בתיווך כמו כלבת Oncolysis. (א) דיאגרמת ון חלוקה לרמות את מספר פעולות האחזור חופפים של תפוקה גבוהה RNAi מסכי 3 שורות תאים סרטניים, ו לטבלה (+, סינתטיים קטלני;-, כל התערבות), תרשים סכימתי (הופך לאדום מחולקת לרמות ב) הממחישות להיטים מפתח בתוך UPR, עירד מסלולים. (B) EC50 משמרות (פסים שחורים, עזב את ציר y) היו נחושים עבור תאים U373 שטופלו Maraba וירוס (48 שעות) לאחר הטיפול עם siRNA (72 h) מיקוד שורה של להיטים UPR/עירד מהמסך. ביטוי mRNA היחסי עבור כל הגן בעקבות siRNA נוקאאוט (72 h) מתואר בלבן (ציר y נכון). (ג) תא הכדאיות מבחני נערכו 48 שעות לאחר הידבקות בווירוסים Maraba, ב U373 תאים ectopically לבטא העכבר ATF6α (או שליטה GFP) ± siRNA מיקוד α ATF6האנושית (או ללא פילוח [NT] פאנל שמאלי; בקרה) או XBP1(s) האנושית (או שליטה ) ± siRNA מיקוד α IRE1האנושית (או לשלוט; נכון החלונית). שהכלים המערב להפגין ג'ין להחרשת, ביטוי גנים חוץ רחמי מוצגים. משמרות EC50 = המשמרת בהמינון של וירוס. דרשו ממני להרוג 50% של התאים; קווי שגיאה = ±SD; XBP1(s) = X-box מחייב חלבון 1 (משולבים); ב (B), בוצעו ANOVAs בכיוון אחד ואחריו Bonferroni במבחן מרובים השוואה לאחר הוק להפיק ערכים p; (C), בוצעו בדיקות t של סטודנט להפיק ערכים p; * p < 0.05; #p < 0.05. (איור זה שונה ממהוני ואח., 201115). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול להעסקת תפוקה גבוהה ההקרנה RNAi לזהות מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic. זה נבדק בהצלחה עם oncolytic Maraba וירוס, וירוס vaccinia oncolytic, אבל, כאמור, זה ניתן להתאים לשימוש עם וירוסים אחרים, oncolytic או וירוסים אחרים בדרך כלל לזהות גנים המארח לווסת את וירוס שכפול. פרוטוקול הקרנה נועד גם כדי לזהות גנים להגדיל או להקטין את התפשטות, אך שניתן יהיה לשנותה בקלות עבור קריאות אחרות. המסכים שלנו עם וירוס Maraba, למשל, תוכננו לזיהוי גנים להתכוונן oncolysis ניצול של assay צבע חיוני מבוססי resazurin פשוט כדי להבקיע תא הכדאיות (ראה איור 4)15. המסכים הללו, לאחר דגירה עם וירוס, במקום לתקן תאים עם פורמלין, מכתים עם Hoechst, וויתרנו resazurin לצבוע כל טוב (ריכוז סופי של 20 μg/mL) ו, לאחר דגירה 6 שעות, מדדנו ספיגת (573 ננומטר) עם צלחת הקורא. יכולנו גם להשתמש הנייד מבוסס על Hoechst מכתים כמו הבדיקה. בזמן באמצעות כתב הפונדקאית כדי לפקח על שכפול הוירוס היה מיותר במסך זה, וירוס עם כתב חלבון, מסויים חלבון פלואורסצנטי להקל על אופטימיזציה מסך כל אחד יכול, למשל, לפקח על שכפול הוירוס לחיות; יתר על כן, וירוס עם חלבון הכתב הוא פחות מסורבל ויקר יותר באמצעות נוגדנים כתם על אנטיגנים ויראלי, אבל זה אפשרי למסך בלי אחד. בנוסף, אפשר היה להפוך עוד יותר תוצאה של שינויים וזמינותו לחקור גורמים מארח להשפיע על infectivity, גודל פרץ מפורט אפילו יותר משנה פנוטיפים כמו מוות של תאים אימונולוגי. בכל מקרה, אחד יבואו פרוטוקול פיתוח assay דומה, הקרנת האסטרטגיה ושיטות משניות ושלישוניות אימות.
בפרוטוקול, אנו מציעים אופטימיזציה של תרביות תאים התנאים אידיאלי עם שורות מרובות של תאי הגידול. ישנן לפחות שתי סיבות למיטוב עם שורות תאים מרובים. סיבה אחת היא כי לא כל שורת התאים הוא נוטה ההקרנה תפוקה גבוהה כמו חלק עלול להיות קשה transfect או לא מקפידים היטב, אבל אחת הסיבות העיקריות היא לאפשר הקרנה עם שורות תאים מרובים כדי למנוע הטיה מהותי התא. הבחירה של שורות תאים תלויה ברובה המטרות של. אחד יכול לבחור להתמקד סוג סרטן מסוים או בחר סוגי סרטן שונים לכיסוי ספקטרום רחב יותר. לחלופין, אחד ייתכן שתרצה להתמקד שורות תאים סרטניים עמידים כדי לזהות גורמים המארח יכול להיות מניפולציות כדי להפוך את הקווים תא הגידול פחות עמידים בפני הידבקות בווירוסים oncolytic...
בנוסף מבחר של שורות תאים, הבחירה של פקדים וירוס חיוביות ושליליות היא שיקול חשוב עבור כל מסך. במקרים מסוימים, לא יכול להיות ידוע גנים וירוס נדרשים עבור או להגביל את שכפול או, אם הם ידועים, ייתכן שהם תאים ספציפיים. כתוצאה מכך, אחת עדיין יכולים לקבוע את החוסן המשוער ואת הטווח הדינמי של וזמינותו באמצעות פונדקאית פקדים. לדוגמה, אחד יכול להשתמש תאים נגוע או תאים נגועים MOI נמוך כפקד חיובי הפונדקאית לזיהוי גנים לירידה כפולה על נוקאאוט. לזיהוי גנים המשפרים את התפשטות על נוקאאוט, אחד יכול להדביק תאים עם סדרה דילול של וירוס והשתמש וולס עם האות המרבי כפקד חיובי הפונדקאית.
מבחר להיטים עבור אימות המסך המשני ואת הסוג של טכנולוגיה להעסיק היא עניין אחר הדורש בדיקה. מועמדים נבחרו בדרך כלל עבור אימות במסך משני המבוסס על היקף, מכה, האם הם באופן משמעותי לווסת פריסה של שורות מרובות של תאי סרטן (אם מסכי העיקרי נערכו מספר שורות תאים) על עניין ביולוגי. ושפור כמו דוד22,23, פנתר24, מחרוזת25 ו- PINdb26 יכול לעזור כדי לבודד מסלולים וכניסות עניין ביולוגי. מרסר. et al. 8 לתאר את השימוש בתוכנה ניתוח פתוח התמונה, עשו גם זמין אלגוריתם אשר הם פיתחו הדמיה וניתוח של להיטים. גורם אחד לקחת בחשבון כאשר לפרש תוצאות את ג'ין להחרשת עשויה להיות השפעות שונות בהתאם השלב במחזור החיים של וירוס זה נחקר. לדוגמה, זה אפשרי זה נוקאאוט של גנים בתחילת מחזור החיים עלול לעכב שכפול הוירוס, בעוד נוקאאוט בשלב מאוחר יותר עשוי להגדיל את השכפול. לעתים קרובות, מסכי משני מתנהלים עם siRNA מיצרן שונה עם זרעים שונים אזורים עם siRNAs מרובים לכל הגנים. עם זאת, טכנולוגיות משלימות מיקוד גנים המועמד יכול להיות מועסק כגון CRISPR-Cas9 או lentivirus וקטורים לבטא shRNA.
השיטה של ניתוח היא גם שיקול מכריע. אנו מציעים כאן באמצעות הניקוד-Z חזקים או כועס20,27 עם הציע גזור-offs שהתקשרת כניסות של > 2 או <-2. גזור-offs יכול להיות גדל או קטן בהתאם אם הדגש הוא על חיסול תוצאות חיוביות שגויות יותר או לכידת שליליות יותר שקר. למשל, במסך תפוקה גבוהה האחרונות עם וירוס vaccinia9, שרשם התחתון היה להגדיר ב--1.5 (החלק העליון אין-offs תוארו כמו הפוקוס היה על זיהוי גנים זה ירד כפולה על נוקאאוט). יש גם שיטות אחרות זה יכול להיות מועסק כולל את z-הציון, SSMD (ההבדל רשע סטנדרטית לחלוטין) ו- B ציון20,28,29,30. תלים ואח31 לעומת רשימות חיסול שנוצר על ידי סכום הדרגה, MAD, ניקוד-z ו- SSMD ומצא שבכל שיטת הניתוח גרמו רשימות חיסול שונות. בוססואין שום שיטה מושלמת או ניתוק. בסופו של דבר, לימודי אימות אימות של השלישון במסך משני יאשר כניסות אמיתי.
בנוסף יש לקחת בחשבון את שיטת סינון כניסות ציטוטוקסיות. דרך אחת היא לנהל את מסכי הראשי מקביל פלוס או מינוס וירוס. זה מאפשר הגילוי של siRNAs כי הם ציטוטוקסיות בכוחות עצמם. זו הייתה הגישה שלנו שלנו Maraba וירוס מסכי15; עם זאת, זה לא לעיתים קרובות מעשי. אולי שיטה מעשית יותר, בנוסף להיות חזקים, הוא לוודא כניסות הם ציטוטוקסיות כמו חלק משני מסך ואלידציה-תיקוף, במיוחד אם המוקד של אחד הוא לזהות את הלהיטים שהשכפול ירידה על נוקאאוט. למשל, במסך הראשי הגנום כולו עם וירוס Myxoma, Teferi et al. 11 מזוהה 1,588 siRNAs זה ירד שכפול הוירוס לאחר נוקאאוט. כדי לסנן החוצה siRNAs ציטוטוקסיות, הם נערכו מסך משני cytotoxicity עם siRNAs האלה; הם מדדו תא הכדאיות 72 h תקנים שלאחר שימוש assay הכדאיות של התא מבוסס resazurin. SiRNAs ציטוטוקסיות אותרו בהתבסס על Z-ציון ≤-1.96. גישה אחרת היא פשוט לסנן את siRNAs ציטוטוקסיות מנתוני הקרנת ראשי בהתבסס על הפחתה של מספר הטלפון הנייד אחוז מסוים, לדוגמה, על ידי הפחתת > 50% כמו סיון. et al. 9, או על סמך ציון מסוים כמו לי. et al. 14; במחקר שלהם גורמים מארח הנדרש לצורך שכפול הוירוס vesicular stomatitis, הם אינם נכללים כניסות siRNA מופחת תא הכדאיות על ידי > 3.0 סטיות תקן מן הממוצע. המספר הממוצע של תאים נקבע בהתבסס על ההכתמה Hoechst של גרעין התא, ו, למרות שלא נאמר במפורש, הממוצע לכאורה מחושב על בסיס לכל צלחת כמו זה ברור כי האות GFP הממוצע מחושב על בסיס לכל צלחת.
מגבלה של מכל מסך RNAi תפוקה גבוהה הוא המספר הגבוה בתדירות גבוהה של תוצאות false חיוביות, שליליות, אשר עשוי לבוא בעקבות העיצוב assay, הטכנולוגיה בשימוש או דרך שיטתית שגיאות. למשל, חלבון עלולה להשפיע משמעותית השכפול של הנגיף, אך הפעם נבחרה עבור ג'ין להחרשת עשוי להיות קצר מדי בהתחשב מחצית חיים של החלבון כדי לזהות את השפעתו שמוביל. תשובה שלילית בשל העיצוב וזמינותו. היא מבוססת היטב כי נוקאאוט לא שלם ואת ההשפעות את המטרה של siRNA הטכנולוגיה יכול גם להציג תוצאות חיוביות שגויות. ותשלילים. שגיאות שיטתית, כגון אפקט קצה32, ניתן להפיק תוצאות מטעות כמו גם. כאן האות ב הבארות החיצוני של הצלחת ייתכן באופן שיטתי גבוה או נמוך מזה של שאר הלוח בשל התאיידות. ישנן אסטרטגיות לכתובת חלק מהם בעיות כולל, למשל: להקטין את הריכוז של siRNA להפחתת חופש-יעד אפקטים33, הגדרה מחדש צלחת פריסות למלא הבארות החיצוני עם התקשורת כדי להמתיק את אפקט קצה או העסקת שיטות אשר פותחו לשם זיהוי של מונה שגיאות שיטתית כגון שפת אפקט32,34,35. שיטה כללית להתמודד עם תוצאות חיוביות שגויות היא לערוך במסך משני בעקבות המסך הראשי. כדרך התמודדות עם התשלילים שווא, אחד יכול להירגע שרשם שהתקשרת פגע וכלול פוטנציאליים שווא שליליות להקרנה משני. זה, כמובן, לא ללכוד התשלילים שווא כי הם הרבה מתחת שרשם. מסכי הראשי צריך להתבצע גם כפול או משולש כדי להגביל את תוצאות כדין. בסופו של דבר, לא משנה מה אסטרטגיות הם מועסקים, לא מסך תפוקה גבוהה ומגובה יזהה את כל הלהיטים אמיתי, אבל זה יכול לספק אוצר בלום של הנתונים שממנו אחת סביר להניח שלי כמה כניסות יקר יכול להופיע באותיות רישיות בעת.
ב פרוטוקול זה, אנחנו תיאר את השימוש siRNA ערוכים וטכנולוגיה shRNA, למרות אפשרות נוספת היא השימוש במאגר shRNA וספריות CRISPR-Cas9. ספריה shRNA במאגר הועסק על. Workenhe, et al. לימוד 12 שתואר במבוא. טכנולוגיית CRISPR-Cas9 במאגר שימש לנהל מסכי הגנום בקנה מידה לזיהוי גורמים מארח הנדרש לצורך שכפול של וירוסים כגון Zika וירוס36, הנילוס המערבי וירוס37,38, וירוס דנגה39 הפטיטיס C וירוס39. היתרון של שימוש בספריות במאגר הוא כי הם פחות יקר כדי לרכוש, אינם דורשים תשתית מיוחדות (למשל נוזלי טיפול התקנים, גבוהה-תוכן מיקרוסקופים וציוד רובוטית), וגם אין להן את העלויות הגבוהות של הפועלים ושמירה על תשתית זו, והן דורשות מתכלים פחות. החיסרון הוא סוגי הקריאות הבאות הן מוגבלת יותר. רוב אם לא כל במאגר הספריה מארח-וירוס מסכי אינטראקציה לתאריך, המדידה הוא תא הכדאיות או העדר; אחד לא יכול לחקור בקלות פנוטיפים מורכבים יותר. הבחירה של פורמט תלויה השאלה ביולוגי הנשאלת.
החידושים הטכנולוגיים בדיקה גנטית במהלך העשורים האחרונים מספר כי מסכי זמין הראשון וחיידקים למסכים הגנום בקנה מידה של ימינו עכשיו בתאי אדם יש פתחה את הדלת לרווחה על גילוי בתחומים מגוונים של המחקר. המסכים גנטי הבאים לא רק אפשרו לנו לענות על שאלות יסוד בביולוגיה, אבל נתנו לנו מפתחות כדי קאי תובנות לפתח ולשכלל את חברת. בעוד עדיין יש שיעורים שיש ללמוד ואתגרים להתגבר באמצעות טכנולוגיה זו, והתוצאות עד כה היו מרגש. התגליות צפוי להיות גדול עוד יותר, כמו הרומן הקרנת הטכנולוגיה, כולל ספריות CRISPR-Cas9 מיקרופלואידיקה ויוו הקרנת טכנולוגיות ממשיכים להבשיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממכון אונטריו למחקר סרטן, קרן קנדה חדשנות, קרן סרטן אוטווה האזורי של מכון המחקר של שועל טרי. K.J.A. נתמך על ידי וניהר קנדה במלגה ללימודי תואר שני, מוסד קנדי לפרס של הבריאות מחקר-מאסטר, מלגות לתואר שני של אונטריו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
| Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
| Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
| Water | Sigma | W4502 | |
| siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
| AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
| siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
| HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
| Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
| DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
| Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
| 500 ml bottles | Corning | 430282 | |
| Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
| Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
| BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
| BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
| Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
| KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
| Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
| JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
| Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
| Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |
References
- Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
- Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
- Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
- Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
- Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
- Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
- Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
- Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
- Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
- Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).
- Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
- Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
- Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
- Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
- Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
- Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
- Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
- Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
- Luc, P. -V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
- Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
- Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
- Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
- Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
- Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
- Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
- Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
- Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
- Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
- Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
