Summary
Vivo에서 시스템의 복잡성 트랜스-와 cis에 의해 활성화 노치 수용 체의 억제 사이 구별 하 게 어려운 게-ligands, 각각. 여기, 우리가 시험관에서 셀 집계 분석 실험의 트랜스를 초파리 노치의 바인딩 질적 및 반 정량적 평가 위한 기반 프로토콜 제시-ligands 대 cis-ligands.
Abstract
노치 신호 동물 개발 및 성인 유지 관리에 광범위 하 게 사용 되는 진화론 보존된 셀 통신 시스템입니다. 신호 통로의 활성화를 유도 하는 이웃 세포에서 ligands와 노치 수용 체의 상호 작용 (트랜스-활성화) 신호를 억제 하는 ligands는 동일한 세포에서와 상호 작용 하는 동안, (cis-억제). 트랜스사이의 적절 한 균형-활성화 및 cis-억제 노치 동물 개발 하는 동안 일부 컨텍스트에서 신호의 최적 수준을 확립 도움이 됩니다. 노치와 많은 세포 유형에의 ligands의 겹치는 식 도메인 및 피드백 메커니즘의 존재, 트랜스- cis대에 주어진된 포스트 번역 상 수정의 효과 공부-노치의 상호 작용 및 그것의 ligands에서 비보에 어렵습니다. 여기, 우리 노치의 트랜스 와 cis각 ligand 바인딩에 노치 통로 한정자 노크의 효과 평가 하기 위해 셀 집계 분석 실험에서 초파리 S2 세포를 사용 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. S2 셀 안정적으로 또는 정도 페 노치 표현 벡터와 각 노치 ligand (S2-델타 또는 S2 Serrate)를 표현 하는 세포와 혼합 됩니다. 트랜스-수용 체와 ligands 간의 바인딩을 heterotypic 셀의 형성 귀착되 고 mL의 구성 당 집계 수 측정 된다 > 6 셀. Cis의 억제 효과 검토-ligands, S2 셀 공동 노치와 각 ligand를 표현 S2 델타 또는 S2 Serrate 세포 혼합 및 위에서 설명한 대로 집계의 수 정량은. Cis의 존재로 인해 집계 수의 상대적 감소- cis의 측정을 제공 하는 ligands-ligand- 트랜스의 저해를 중재-바인딩. 이러한 간단 분석 실험 유전 또는 약리학 바인딩에 노치의에 조작의 ligands의 효과에 반 양적 데이터를 제공할 수 있습니다 그리고 vivo에서 효과의 기본 분자 메커니즘을 파악 하는 것을 도울 수 있다 노치 신호에 같은 조작.
Introduction
정식 노치 신호 노치 수용 체와 그들의 ligands1간의 상호 작용을 촉진 하기 위하여 세포를 이웃의 육체적 인 접촉을 필요로 하는 단거리에 셀 통신 메커니즘입니다. Ligands와 노치 수용 체 (신호 수신 세포의 표면에 존재 하는)의 상호 작용 (신호 전송의 표면에 세포) 노치 신호를 시작 하 고 트랜스로 알려져 있다-활성화2. 다른 한편으로, 노치와 동일한 셀에 있는 그것의 ligands 사이 상호 작용 노치 통로의 억제를 지도 하 고 cis로 알려져 있다-금지3. 트랜스-와 cis사이의 균형-상호 작용 최적의 ligand 의존 노치4신호를 확인 하는 데 필요한. 초파리 는 포유류, 4 개의 노치 수용 체 있고 5 개의 ligands에 반대 한 노치 수용 체 및 두 ligands (델타와 Serrate) [가변 1 (JAG1), JAG2, 델타 같은 1 (DLL1), DLL3 및 DLL4]5. 이 단순 데, 초파리 모델 부드럽게 해 부 연구 노치 ligand 상호 작용 및 이후에 노치 신호 통로 한정자의 효과를 제공 합니다. ( 초파리날개 개발 포함), 동물 개발 하는 동안 특정 상황에서 cis-및 트랜스-상호 적절 한 노치 신호를 달성 하기 위해 운명1,6 셀 관련 . 시스- 트랜스대에 이러한 상황에서 노치 통로 한정자의 효과 구별 하는 것이 중요 하다-그것의 ligands와 노치의 상호 작용.
우리의 그룹은 이전 부정적인 초파리 노치를 xylose 라는 탄수화물 잔류물의 날개 개발7을 포함 한 특정 컨텍스트에서 노치 신호 조절 보고. Shams 의 손실 (효소는 xylosylates 노치) "날개 정 맥의 손실" 형7리드. 최근에, 유전자 복용량 실험 및 클론 분석 shams 의 손실 델타 중재 노치 내 서 향상을 보여 사용 되었다. Shams 돌연변이에 향상 된 노치 신호는 감소 cis의 결과 여부를 구별 하는 것-금지 또는 증가 트랜스-활성화, 애벌레 윙 imaginal 디스크에 노치 ligands의 소성 overexpression 학문 민 진 당-GAL4 드라이버를 사용 하 여 수행 했다. Shams 트랜스규제를 제안 하는 증거를 제공 하는이 실험-노치 cis를 영향을 주지 않고 델타에 의해 노치의 활성화-ligands8에 의해 저해. 그러나, 피드-다시 규정 그리고 내 인 성 ligands의 효과 소성 overexpression 학문1,,69의 해석 복잡 하 게 만들 수 있습니다.
10 사용 되었다 초파리 S2 세포가이 문제를 해결 하려면는 노치 ligand 상호 작용 연구11,12간단한 체 외에 시스템을 제공 합니다. S2 셀 하지 생 노치 수용 체 델타 리간드11 을 표현 하 고 표현 Serrate13, 노치 ligand 집계 실험8에 영향을 주지 않는 낮은 수준. 따라서, S2 셀 수 수 안정적으로 또는 정도 페 노치 또는 개별 ligands 델타 (Serrate) 독점적으로 노치 수용 체 또는 그것의 ligands의 하나를 표현 하는 세포를 생성 하 또는 그들의 조합에 의해. Heterotypic 수용 체 ligand 바인딩11,,1214중재의 형성에 S2 셀 결과 ligand 표현 S2 노치 표현 세포의 혼합. 트랜스의 측정을 제공 하는 집계 형성의 정량화-노치와 그것의 ligands15 (그림 1) 사이의 바인딩. 마찬가지로, S2 셀 노치와 델타 또는 Serrate ligands와 공동 transfected 수 (즉, cis-ligands). Cis-S2 노치 표현 세포에 ligands 파기 트랜스와 노치의 바인딩-ligands 및 결과에 집계 형성8,,1214감소. Cis에 의해 발생 하는 집계 형성의 상대적 감소- cis의 억제 효과의 측정을 제공 하는 ligands-노치와 트랜스간의 바인딩에 ligands-ligands (그림 2). 따라서, 셀 집계 분석 트랜스-와 cis에 xylosylation의 손실의 영향을 검토 하 활용 했다-노치와 그것의 ligands 사이 상호 작용.
여기, 선물이 상세한 프로토콜 트랜스와 노치의 바인딩을 평가를 겨냥 한 셀 집계 분석 실험-ligands 및 cis에 의해 그것의 억제-ligands 초파리 S2 세포를 사용 하 여. 예를 들어, 제공 하는 데이터 바인딩 노치와 트랜스사이 노치 xylosylation의 효과 결정 하는-델타8. 이러한 간단 분석 노치 ligand 상호 작용에서 생체 외에서 의 반 정량적 평가 제공 하 고 기본 노치 통로 한정자의 비보에 효과 분자 메커니즘을 결정 하는 데 도움이.
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Protocol
1. 가짜 최저 두 배 좌초 RNA (dsRNA)의 준비
- 제품의 PCR 증폭
- 야생-타입 옐로우 화이트 (y w) 게놈 DNA와 pAc5.1 EGFP 템플릿과 다음 뇌관 쌍으로 dsRNA 합성에 사용 된 DNA 파편을 증폭을 사용 합니다. 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여: 변성 (95 ° C, 30 s), 어 닐 링 (58 ° C, 30 s) 및 확장 (72 ° C, 1 분).
녹색 형광 단백질 강화 (EGFP) dsRNA 뇌관 (5'-3')-
앞으로 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
반전 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
Shams dsRNA 뇌관 (5'-3')-
앞으로 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
반전 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
참고: EGFP dsRNA 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.
- 야생-타입 옐로우 화이트 (y w) 게놈 DNA와 pAc5.1 EGFP 템플릿과 다음 뇌관 쌍으로 dsRNA 합성에 사용 된 DNA 파편을 증폭을 사용 합니다. 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여: 변성 (95 ° C, 30 s), 어 닐 링 (58 ° C, 30 s) 및 확장 (72 ° C, 1 분).
- 젤-제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 젤 정화 키트를 사용 하 여 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 제품을 정화.
- 전사 체 외에 상업 제품 제조 업체의 프로토콜에 따라 T7 발기인에서 속기의 능력을 사용 하 여 수행 합니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 RNA 정화 키트를 사용 하 여 dsRNA를 정화 하 고-80 ° c.에 저장
- 다음 단계 (1.5.1-1.5.5)를 사용 하 여 가짜 최저의 효율성을 평가 합니다.
- 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 U/mL 페니실린-스 셀 사용 하 여 수동으로 hemocytometer 및 플레이트 5 x 105 s 2 셀에는 6의 각 잘 잘 플레이트 1 mL/슈나이더의 매체의 10% 보충 수.
- 각 잘 하 EGFP-또는 shams dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.
- 수확 컨트롤 (EGFP dsRNA 치료) 및 25 ° C에서 5 분 동안 1000 x g와 RNA 분리에 따라 RNA 추출 키트를 사용 하 여 프로세스에서 원심 분리에 의해 아래로 산 뒤 부드러운 pipetting으로 shams dsRNA 취급 S2 셀 제조 업체의 프로토콜입니다.
- 분 광 광도 계 및 프로세스 100 사용 하 여 RNA를 정량 1 단계 qRT-PCR 상업 정량 시 약 및 뇌관/프로브와 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여에 대 한 RNA의 ng: 변성 (95 ° C, 15 s) 및 소 둔/확장 (60 ° C, 1 분).
참고: 뇌관/프로브 세트와 이러한 연구에서 shams 및 제어 qRT-PCR 실험을 위해 사용 하는 악기에 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. - 2-ΔΔCT 방법16를 사용 하 여 상대 shams mRNA 레벨을 계산 합니다.
2. 평가의 노치 수용 체와 트랜스사이의 바인딩-ligands
- 신호 수신 셀 (S2 노치 수용 체를 표현)을 준비 합니다.
- hemocytometer를 사용 하 여 수동으로 셀 및 플레이트 5 x 105 S2 및 안정적인 S2-노치 셀에 1 ml에서 6 잘 플레이트/슈나이더의 매체의 잘 각 잘 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스.
참고: S2 노치 셀, 초파리 게놈 자원 센터 (DGRC)에서 사용할 수 있는 미디어에 200 nM 토트를 추가 합니다. 0.5 m m 토트 재고 솔루션을 준비 하려면 먼저 1 M NaOH의 250 µ L에 20 mM 토트 솔루션 준비. 다음, 0.5 m m 1 M 인산 염 버퍼 식 염 수에-20 ° c.에가을이 솔루션을 희석 S2-노치 셀에 노치 단백질의 표정은 pMT 벡터에 초파리 metallothionein 발기인의 제어. - 각 잘 하 dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.
- 0.7 m m 노치의 표현을 유도 하 여 25 ° C에서 3 일 동안 품 어 CuSO4 를 추가 합니다.
참고: CuSO4 metallothionein 발기인에 의해 제어 하는 단백질의 표정을 유도 하는 데 사용 됩니다.
- hemocytometer를 사용 하 여 수동으로 셀 및 플레이트 5 x 105 S2 및 안정적인 S2-노치 셀에 1 ml에서 6 잘 플레이트/슈나이더의 매체의 잘 각 잘 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스.
- 신호를 보내는 셀 (S2 셀 델타 또는 Serrate ligands 표현)을 준비 합니다.
- 사용 하 여 수동으로 hemocytometer를 접시 ~ 5 x 106 안정 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 1 ml에서 6 잘 플레이트의 각 음에 셀/슈나이더의 매체의 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스.
참고: 미디어에 S2-델타 셀 200 nM 토트와 100 µ g/mL hygromycin S2 Serrate톰 셀을 추가 합니다. 델타와 Serrate톰의 표정-Serrate12의 토마토 태그, 기능 버전- pMT 벡터에 초파리 metallothionein 발기인을 받고 있다. - 0.7 m m ligands의 표현을 유도 하는 3 h 25 ° C에서 품 어 CuSO4 를 추가 합니다.
- 사용 하 여 수동으로 hemocytometer를 접시 ~ 5 x 106 안정 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 1 ml에서 6 잘 플레이트의 각 음에 셀/슈나이더의 매체의 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스.
- 신호 보내기 및 신호 받기 셀 사이의 집계를 수행 합니다.
- DsRNA 취급 S2 수확 (제어)과 부드러운 pipetting 접시 2.5 x 105 셀/잘 hemocytometer에 의해 수동 계산 후 24-잘 접시에에서 의해 S2-노치 셀.
- 5 x 105 안정 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 슈나이더의 매체의 200 µ L의 전체 볼륨에 추가 (보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스).
참고: 모든 S2 셀 (를 포함 하 여 도금, 유도 및 dsRNA 처리) 처리는 biosafety 캐비닛 아래 이루어졌다. - 150 rpm (942.48 rad/min)에서 궤도 통에 접시를 놓습니다.
- 1 분 후 각의 내용을 혼합 하 고 꺼내 20 µ L의 수를 계산 합니다.
- 10 배 확대 (PLL 10/0.25 목표)를 사용 하 여 거꾸로 화합물 현미경 대표 이미지 걸릴 동시에.
- 수동으로 집계를 계산 (> 6 셀)는 hemocytometer를 사용 하 여.
- 통에 접시를 놓습니다.
- 이미지 수집 및 5 분 후, 15 분 집계의 계산을 반복 합니다.
- 트랜스의 정량화를 수행-바인딩.
- 배경 컨트롤 S2 셀과 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 간의 mL 당 집계 수를 계산 합니다.
- S2-노치와 S2-델타 또는 S2 Serrate톰 셀 사이의 mL 당 집계 수를 계산 ( 트랜스의 크기-바인딩).
3입니다.노치와 트랜스간의 바인딩의 저해의 평가- Cis에 의해 ligands-ligands
- 신호 수신 셀을 준비 합니다.
- 플레이트 5 x 105 s 2 셀의 1 mL에는 6-잘 접시/슈나이더의 매체의 잘 각 잘 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스.
- 각 잘 하 dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.
- 공동 transfect dsRNA 치료 셀 pBluescript 및 pMT 노치11 (DGRC) 혼자 또는 pMT 노치 및 pMT 델타11 (DGRC) 또는 pMT Serrate총17 DNA는 2 µ g/잘 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 transfection 시 약의 농도.
참고: pBluescript 컨트롤로 사용 됩니다. 공동 transfected 세포 S2-노치 이라고 불릴 것 이다 & 델타과도 또는 S2-노치 & Serrate과도 셀이. - 뚜렷이 페 S2 셀 24 h에 대 한 25 ° c를 품 어.
- 0.7 m m 노치와는 ligands의 표현을 유도 하 여 25 ° C에서 3 일 동안 품 어 CuSO4 를 추가 합니다.
- 2.2에 설명 된 대로 신호를 보내는 셀을 준비 합니다.
- 2.3 섹션에 설명 된 대로 신호 보내기 및 신호 받기 셀 사이의 집계를 수행 합니다.
- 트랜스의 저해를 계량- cis에 의해 바인딩-ligands.
- 배경 컨트롤 S2 셀과 S2 델타 또는 S2 Serrate 셀 간의 mL 당 집계 수를 계산 합니다.
- Cis에 의해 억제의 크기를 정량화-다음과 같이 ligands.
- S2-노치과도 S2-델타 세포 사이의 집계의 수로 A 를 정의 합니다.
- S2 셀 사이의 집계 수 노치와 델타 정도 공동 페 B 정의 (S2-노치 & 델타과도)와 S2-델타 세포.
- 상대 집계 C 계산 = (B x 100) /A
- Cis-ligand (델타 또는 Serrate) 100-의해 억제의 크기를 계산 C.
참고: 한 예로, 상대 집계가 45%, cis-ligands 횡단을 억제 하는 것으로 간주 됩니다-55% 바인딩.
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Representative Results
우리의 vivo에서 관측 제안는 노치 신호 때문에 이득에 xylosyltransferase 유전자 shams 결과의 손실 증가 델타 중재 트랜스- cis를 영향을 주지 않고 노치의 활성화-의 저해 노치 ligands8. 이 테스트 하려면 셀 집계 분석 생체 외에서 수행 했다. 첫째, shams 식 S2 셀에는 뜨 shams dsRNA를 사용 하 여. EGFP dsRNA 제어로 사용 되었다. 최저 (KD)의 실시간 PCR에 의해 시험 되었다 그리고 808보다 큰 수를 표시 했다. 그런 다음 트랜스와 노치 수용 체의 바인딩을-shams KD 집계 분석 실험을 사용 하 여 조사 되었다 시 델타. S2-노치와 S2-델타 세포 사이 집계는 그들을 혼합 후 여러 시간 지점에서 시험 되었다. 일반 S2 셀과 S2-델타 세포 간의 집계 배경 제어로 찍은. 그림 3 쇼의 수를 나타내는 그래프에서 다른 형성 혼합 후 포인트 (1, 5, 15, 30 분) 시간. 날카로운 증가 계속 느린 속도로 30 분까지 증가 하는 집계 수 사이 1 그리고 5 분 후, 집계 수가 관찰 되었다. 따라서, 집계 형성은 1, 5, 15 분에 몇 군데와 혼합의 5 분 후의 수 정량 했다.
그림 4A 에 노치 수용 체와 트랜스간의 바인딩을 shams KD의 효과 평가 하기 위해 안정적인 S2-노치와 S2-델타 셀 사이의 집계 분석 셀의 대표 이미지를 보여줍니다-델타. 이미지는 3 시간 포인트 (1, 5, 15 분)에서 집계를 표시합니다. 배경 컨트롤에 대 한 일반 S2 셀 ( shams dsRNA와 대우) S2-델타 세포와 혼합 했다. EGFP dsRNA 취급 S2-노치 셀 집계 시간 수가 증가 S2-델타 세포 형성. 반면, shams dsRNA 취급 S2-노치 셀, 집계 형성 하 고 크고 수 컨트롤 것 들 보다 (그림 4B)에서 더 큰 집계 했다. 이 트랜스향상 Shams 수준 감소 표시-델타8노치의 바인딩.
검사 여부 Shams 조절 cis의 억제 효과-노치와 트랜스간의 바인딩에 ligands-델타, 우리가 먼저 설립 노치와 델타의 공동 식 신호 수신에 셀 셀 집계를 줄일 수 있다 노치와 트랜스에 의해 중재-델타. 그림 5A S2-델타와 S2-노치 사이 형성 하는 집계 수를 나타내는 그래프를 보여준다 & 다른 양의 cis델타과도 셀-델타. S2 셀에 같은 양의 노치 및 델타 식 구조를 극적으로 transfecting 사이 이러한 셀 및 S2-델타 세포 형성의 수 감소. 또한, cis의 양을 감소-델타 홈의 범위를 나타내는 집계의 증가에서 결과 /cis-델타 비율 이러한 분석 실험, cis에 사용-델타 노치 사이 바인딩을 억제할 수 있는 고 트랜스-델타는 복용량-의존 방식에서. S2-노치 이후 & 델타과도 셀 노치와 델타 익스프레스, S2-델타 세포 별도로 homotypic 집계 형성 수 있습니다. Homotypic 형성 S2-노치 사이에서 집계 하는 경우 검사 & 델타과도 셀 cis혼동 요인일 수 있다-금지 분석 실험 에서처럼 그림 5A, 우리 s 2 세포와이 세포를 혼합 하 고 정량은 집계합니다. S2-노치 S2 셀 혼합 후 형성 하는 집계 수를 표시 하는 그림 5B & 델타과도 셀 다양 한 노치 표현 /cis-델타 비율. 그림 5A 와 같이 heterotypic 집계에 비해 homotypic 집계의 오히려 작은 수 관찰 되었다. 우리는 이러한 집계 분석 충실 하 게 cis의 효과 측정 하는 결론-바인딩 노치와 트랜스사이 델타-델타.
우리는 다음 shams KD cis의 억제 능력의 효과 검사-델타. 이 끝, S2-델타와 S2-노치 사이 집계 & 델타과도 셀 시험 되었다. 그림 6A S2-델타 세포와 S2-노치과도 (제어) 또는 S2-노치 사이 집단의 대표 이미지를 보여주는 & 델타과도 셀. S2-델타와 EGFP dsRNA 취급 S2-노치과도 셀 집계, 시간, S2-델타와 안정적인 S2-노치 셀 (그림 4) 사이의 집계를 비슷한 숫자의 증가 형성. 특히, S2-델타와 S2-노치 혼합 & 델타과도 셀 노치 및 델타 식 플라스 미드의 동등한 양의 페 공동 형성 EGFP KD와 shams KD, 감소 하는 그 제안에 따라 덜 집계 Shams의 수준 cis의 기능에 영향을 주지 않습니다-노치를 차단 하는 델타 /트랜스-델타 바인딩. 더 나은 shams KD 활동에 cis의 효과 평가 하기 위해-델타, cis에 의해 억제의 크기-델타 노치의 범위를 통해 상대 집계 비율을 계산 하 여 측정 되었다 /cis-델타 3.4.2 섹션에 설명 된 대로 비율입니다. 상대 집단의 정량화 EGFP 그리고 shams dsRNA 치료 (그림 6B) 시 집계의 유사한 금지를 보여주었다. 함께, 이러한 관찰이 좋습니다 xylosylation의 손실 트랜스촉진- cis를 영향을 주지 않고 바인딩-억제8, shams 관찰 날개 정 맥 손실 형에 대 한 분자 메커니즘을 제공 하 고 돌연변이.
그림 1: 트랜스에 대 한 셀 집계 분석 결과의 도식 표현-바인딩. 0.7 m m CuSO4(S2-델타 또는 S2 Serrate) 표현 S2 세포 수용 체 (S2-노치)와 리간드의 유도 보여주는 다이어그램. 두 s 2 세포의 유도 집계 하는 경향이,에 선행 된다. 이러한 집계 (> 6 셀) 몇 군데 고 정량.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Cis를 평가 하기 위해 셀 집계 분석 결과의 도식 표현-억제. S2 셀 pMT 노치 (S2-N과도), pMT 노치 와 pMT 델타 페 정도 되었다 (S2-노치 & 델타과도), 또는 pMT 노치 및 pMT Serrate (S2-노치 & Serrate과도)입니다. 0.7 m m CuSO4 와 S2-델타 세포와 혼합 하 여 유도, 후 집계 (> 6 셀)는 계량. Cis에 의해 억제-ligands 존재 및 각 cis의 부재에 상대 집계 백분율의 점에서 측정 된다-ligand. Cis의 효과-노치와 트랜스간의 바인딩에 ligands-Serrate S2 Serrate톰 셀 (표시 되지 않음)으로 뚜렷이 transfected 세포를 혼합 하 여 확인할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: S2-노치와 S2 또는 다른 시간 지점에서 S2-델타 세포 사이 집계. 그래프는 다른 시간 포인트 (1, 5, 15, 30 분) 셀의 표시 형식 사이 mL 당 집계 수를 보여 줍니다. 오차 막대는 3 개의 복제의 의미 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 셀 집계 노치와 트랜스에 의해 중재-델타. (A) 이미지 다른 시간 포인트 (1, 5, 15 분)에서 집계를 표시. Shams dsRNA 취급 일반 S2 셀과 S2-델타 세포 간의 집계 배경 제어로 찍은. Shams-dsRNA 취급 S2-노치 세포 수에서 증가 보여와 S2-델타 세포와 혼합 후 S2-노치 셀 EGFP dsRNA 처리 (제어)에 비해 집계의 크기. 눈금 막대 = 100 µ m. 세포의 수의 (B) 부 량 집계 6 셀 보다 큰 집단의 5 분 후. 오차 막대 표시 SEM. * P < 0.01 (단방향 분산 분석 (ANOVA)). 3 개의 독립적인 반복 된 3 개의 복제를 수행 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: Cis-델타는 셀 집계 형성에 의해 중재 노치와 트랜스억제-델타는 복용량-의존 방식에서. (A) 그래프로 S2-델타 세포와 s 2 셀 정도 페 식 벡터의 다른 비율으로 노치와 cis에 대 한 조건 (집계/mL의 수) 집계-델타 (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 및 1:0. 1). 오차 막대 표시 SEM. * P < 0.01 (단방향 ANOVA). 3 개의 독립적인 반복 된 3 개의 복제를 수행 했다. 참고는 cis의 수준을 감소-델타 결과 집계, 감소 cis인해 가능성이 증가-억제. (B) 그래프 정도 S2 셀에 조건 (mL 당 집계 수) homotypic 집계를 보여주는 노치와 델타 (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 및 1:0. 1)의 다른 비율으로 페와 일반 S2 세포와 혼합. 오차 막대 표시 SEM. 수 집계의 S2-델타와 S2-노치 사이 형성 heterotypic의 수보다 훨씬 작습니다 & 델타과도 셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 최저 shams 의 영향을 주지 않습니다 cis의 금지 활동-델타. (A) 표시는 cis에 shams KD의 효과의 대표적인 이미지-델타-중재 하는 노치에 의해 중재 하는 세포 집단의 금지 /트랜스-델타 바인딩. 이미지는 다른 시간 포인트 (1, 5, 15 분)에서 집계를 표시합니다. Shams dsRNA 취급 일반 S2 셀과 S2-델타 세포 간의 집계 배경 제어로 찍은. 안정적으로 페 비슷합니다 S2-노치 셀, shams KD S2-델타와 제어 (EGFP dsRNA 취급)에 비해 S2-노치과도 셀의 수를 증가. Cis의 공동 식-1:1 비율로 노치 델타 결과 집계 컨트롤 (EGFP dsRNA 처리)에서 수에 비해 감소 뿐만 shams 취급 dsRNA 세포에서. 눈금 막대 = 100 µ m. (B) 그래프로 S2-델타 셀과 뚜렷이 표시 비율 (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 및 1:0. 1) 노치와 cis의 페 공동 S2 셀 간의 상대 집계-델타. EGFP 그리고 shams dsRNA 치료 각 노치에 집계에 비해 감소 표시 /cis-델타 비율. 여기에 제시 된 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
정식 노치 신호 노치 수용 체와 ligands5간의 상호 작용에 따라 달라 집니다. 노치 통로에 대부분의 연구는 주로 노치와 인접 셀 (트랜스)에 ligands의 바인딩은 고려, 하지만 노치와 같은 셀 ligands 할 상호 작용, 그리고 이러한 소위 cis-상호 작용 단계에서 억제 역할을 재생할 수 있습니다 신호3,4. 따라서, 정식 노치 신호에 한정자의 영향을 기본 메커니즘을 해독, 그것은 종종 두 종류 (트랜스 와 cis) 노치 ligand 상호 작용의 검사 관련. 그러나, 동물 개발 하는 동안 많은 컨텍스트에서 이러한 상호 작용 및 그들의 피드-다시 규제의 둘 다의 참여는 vivo에서 연구1,6복잡. 현재 프로토콜에서 우리는 생체 외에서 셀 집계 분석 초파리 S2 세포를 사용 하 여 트랜스ligands 및 cis에 의해 그것의 억제와 노치 수용 체의 바인딩을 평가 대 한 상세한 방법론을 제공 ligands입니다. 우리는 (xylosyltransferase Shams7,8)에 수용 체 ligand 바인딩 신호 노치의 유전 한정자의 효과 평가 하기 위해이 방법론의 활용을 제시 했습니다.
첫째, 집계 분석 트랜스에 shams KD의 효과 검사 안정적인 S2-델타 EGFP 또는 shams dsRNA 치료 안정 S2-노치 셀 사이 수행한-바인딩. S2-델타 shams dsRNA 취급 일반 S2 셀과 셀의 배경 제어로 찍은. Shams KD S2-노치와 제어에 비해 S2-델타 세포 사이의 집계를 향상. 트랜스에 병렬로 일반 S2 셀과 리간드 들고 S2 셀 간의 배경 실험 제어 집계를 수행 하는 것이 중요 하다-실험 바인딩. 내 생 노치 수용 체 및 델타 리간드11 초파리 S2 세포 표현 하지 않습니다, 비록 Serrate의 낮은 레벨의 표현 S2 셀13에 보고 됩니다. 고려, 일반 S2 셀 배경 제어; 셀 집계 분석 실험에서 사용 되었다 이 세포는 어떤 집계 (그림 5B)를 보여주지 않았다. 집계는 hemocytometer를 사용 하 여 수동으로 계산 됩니다. 집계 정량화에 일관성을 보장 하기 위해, 혼합된 세포 인구의 10-20 µ L 잘 계산 당 적어도 3 개의 다른 지역에서 밖으로 pipetted 수 있습니다. 이 분석 실험 건강 한 성장 S2 셀 필요합니다. S2의 반 부착 성격을 고려 셀, 셀을 수집 하는 동안 pipetting 부드러운 고 집계 분석 결과 동안 떨고 상수는 중요 한.
이전에 우리와 다른 사용 잘 설립, 수용 성 리간드-수용 체 바인딩 분석 트랜스17,,1819, 수용 체 ligand 바인딩의 양적 평가 대 한 20. 성 ligand 바인딩 분석 노치 ligand 트랜스에 shams KD의 효과 검사 하도 수행한 집계 분석 실험 반 정량적 이기 때문에,-바인딩. 관찰된 결과 집계 분석 실험8에서 얻은 그 추세에서 유사 했다. 이 트랜스와 노치의 바인딩의 충실 한 평가 인증-ligands 셀 집계 분석 실험을 사용 하 여. 집계 형성은 수용 체 ligand 바인딩의 판독, 노치 수용 체 또는 그것의 ligands의 표면 식 주어진된 한정자에 의해 영향을 받는 경우 복잡 한 수 있습니다. 이것으로 집계 형성에 변경 변경된 수용 체 ligand 바인딩 때문에 또는 표면 식 변경 경우 고유 수 없습니다 셀 집계 분석의 한계를 강조 한다. 따라서, 집계 분석을 병렬, 노치와 ligands의 표면 식 각 한정자의 효과 필요 S2 세포에서 테스트 합니다. 우리의 연구의 맥락에서 노치와 델타의 표면 레벨 shams dsRNA 취급 S2 셀8에 영향을 받지 했다.
트랜스의 억제 검사- cis의 추가 의해 바인딩-ligands, 집계 분석 실험 S2-델타 세포와 EGFP 또는 가짜 사이 수행 된 dsRNA 취급 S2-노치 & 델타과도 셀 . 이 세포 사이 형성 하는 집계 수는 S2-델타 세포와 S2-노치과도 세포 사이 형성 하는 집계 수와 비교 되었다. 수 집계의 상대적 감소 계산 되었고 cis에 의해 억제의 크기에 대 한 지표로 서 사용-델타. 제어 실험 보여주었다는 cis-ligands 노치의 강력 하 고 복용량 의존 금지 표시 /트랜스- cis에 노치의 다소 넓은 범위 동안 델타 바인딩-ligand 비율 (1:1 1:0. 1) (그림 5A)8 . Cis의 강한 정도 귀착되 었 다 1:1 비율-억제, 및 cis의 상대적 수준 감소-델타 cis약화-억제. 따라서, 비율의이 범위 KD 실험 수행 되었다. 메모의 노치 수용 체의 양과 transfected DNA의 총 금액은 모든 실험에서 일정 유지 되었다. 이렇게 하면 집계 형성 주로 cis의 활동에 의해 영향을-ligands 노치 식 세포의 수준에 의해 변경 되지.
그것은 이전 노치와 cis의 공동 식 표시 했다-S2 셀에 ligands homotypic 집계14의 형성에 발생할 수 있습니다. 유사 여부를 검사 하 S2-노치 사이 homotypic 집계 & 델타과도 또는 S2-노치 & Serrate과도 셀 cis에서집계 quantifications의 우리의 해석을 손상 시킬 수 있습니다-리간드 연구, S2-노치 사이 제어 집계 분석 결과 수행한 & 델타과도 및 일반 S2 셀. S2 셀이이 실험에 사용 된 수는 cis에서사용 S2-델타 세포와 동일-델타 실험. 일부 homotypic 집계 관찰 되었다, 하지만 정량화 결과 집계 S2-노치 사이 heterotypic 집계에 비해 총 집계의 낮은 분수 기여 & 델타과도 S2-델타 세포 ( 그림 5B)입니다.우리가 변화 cis에서의 수에서 관찰 된 결론- cis의 억제 효과 주로 ligand 분석 실험-노치와 트랜스간의 바인딩에 ligands-델타.
요약, 집계 분석 실험이이 프로토콜에 트랜스-와 cis의 반 정량적 평가 위한 쉽고 간단한 방법론을 제공-노치 수용 체 및 그것의 ligands의 상호 작용. 이 분석 실험에 노치 ligand 바인딩에서 생체 외에서 유전자 또는 약리학 노치 통로 한정자의 효과 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 및 따라서 vivo에 효과 이러한 한정자의 계급에 기본 메커니즘을 명료 하 게 도움이 될 수 있습니다. 신호.
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Disclosures
저자는 전혀 충돌의 관심이 없다.
Acknowledgments
저자 인정 NIH/NIGMS에서 지원 (HJN에 R01GM084135) 및 Glycoscience (부여 #110071 HJN), 그리고 톰 V. 리 토론 및 분석 실험에 대 한 제안에 대 한 감사에 대 한 미즈타 니 재단과 Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, 로버트 플레밍, 켄 어바인과 플라스 미드를 세포 초파리 게놈 자원 센터 (DGRC)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
References
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