Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Cell Aggregation analyser att utvärdera bindningen av Drosophila skåran med Trans-ligander och dess hämning av Cis-ligander

doi: 10.3791/56919 Published: January 2, 2018

Summary

Komplexiteten i vivo system gör det svårt att skilja mellan aktivering och hämning av Notch receptor av trans- och cis-ligander, respektive. Här presenterar vi ett protokoll baserat på in vitro- cell-aggregering analyser för kvalitativa och semikvantitativt utvärdering av bindningen av Drosophila Notch till trans-ligander vs cis-ligander.

Abstract

Notch signalering är ett system för kommunikation av evolutionärt bevarade cell-cell som används i huvudsak i djurs utveckling och vuxen underhåll. Interaktion av Notch-receptorn med ligander från angränsande celler inducerar aktivering av signalvägen (trans-aktivering), medan interaktion med ligander från samma cell hämmar signalering (cis-hämning). Balans mellan trans-aktivering och cis-hämning hjälper upprätta optimala nivåer av Notch signalering i vissa sammanhang under djurens utveckling. På grund av överlappande uttryck domäner av Notch och dess ligander i många celltyper och förekomsten av återkopplingsmekanismer, studera effekter av en viss post-translationella ändring på trans- kontra cis-interaktioner av Notch och dess ligander i vivo är svårt. Här beskriver vi ett protokoll för att använda Drosophila S2 celler i cell-aggregering analyser för att bedöma effekterna av knacka ner en Notch väg modifierare på bindningen av Notch till varje liganden i trans och cis. S2 celler stabilt eller övergående transfekterade med en Notch-uttryckande vektor blandas med celler som uttrycker varje Notch ligand (S2-Delta eller S2-Serrate). Trans-bindning mellan receptor och ligander resulterar i bildandet av heterotypic cell aggregat och mäts i antalet aggregat per mL består av > 6 celler. Att undersöka den hämmande effekten av cis-ligander, S2 celler tillsammans uttrycker Notch och varje ligand är blandade med S2-Delta eller S2-Serrate celler och antalet aggregat kvantifieras enligt ovan. Den relativa minskningen av antalet aggregat på grund av cis-ligander ger ett mått på cis-ligand-medierad hämning av trans-bindande. Dessa enkla analyser kan ge delvis kvantitativa uppgifter om effekterna av genetiska eller farmakologiska manipulationer på bindningen av Notch till dess ligander, och kan hjälpa till att dechiffrera de molekylära mekanismerna bakom i vivo effekterna av sådana manipulationer på Notch signalering.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kanoniska Notch signalering är en cell till cell kortdistanskommunikation mekanism som kräver fysisk kontakt på angränsande celler för att underlätta samspelet mellan Notch receptorer och deras ligander1. Interaktion av Notch receptorn (finns på ytan av signal-ta emot celler) med ligander (finns på ytan av signal-skicka celler) initierar Notch signalering och är känd som trans-aktiveringen2. Däremot, interaktionen mellan Notch och dess ligander i samma cell leder till hämning av Notch väg och kallas cis-hämning3. Balansen mellan trans- och cis-interaktioner är krävs för att säkerställa optimal ligandberoende Notch signalering4. Drosophila har en Notch receptor och två ligander (Delta och Serrate) i motsats till däggdjur, som har fyra Notch receptorer och fem ligander [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-liknande 1 (DLL1), DLL3 och DLL4]5. Drosophila modellen att ha denna enkelhet, och erbjuder lättheten att dissekera/studera effekterna av väg modifierare på Notch-ligand interaktioner och därefter på Notch signalering. I vissa sammanhang under djurens utveckling (inklusive wing utveckling i Drosophila), både cis- och trans-interaktioner är inblandade att uppnå korrekt Notch signalering och cell öde1,6 . Det är viktigt att skilja effekterna av Notch väg modifierare i dessa sammanhang på cis- kontra trans-interaktioner mellan Notch och dess ligander.

Vår grupp har tidigare rapporterats att tillägg av kolhydrater rester kallas xylos till Drosophila snäpp negativt reglerar Notch signalering i vissa sammanhang, inklusive wing utveckling7. Förlust av shams (enzymet att xylosylates Notch) leder till en ”förlust av wing venen” fenotyp7. Mer nyligen, gen dosering experiment och klonal analys användes för att visa att förlusten av shams förbättrar Delta-medierad Notch Givarländers. Att skilja om det förbättrade Notch signalering i shams mutanter är ett resultat av minskad cis-hämning eller ökad trans-aktivering, ektopisk överuttryck studier av Notch ligander i larval wing imaginal skivor använda drivrutinen dpp-GAL4 utfördes. Dessa experiment som bevis tyder på att Shams reglerar trans-aktivering av Notch av Delta utan att påverka Notch cis-hämning av ligander8. Dock återkopplingsfjädern förordningar och effekterna av endogena ligander kan komplicera tolkningen av ektopisk överuttryck studier1,6,9.

Lös problemet, Drosophila S2 celler10 användes, som ger ett enkelt in vitro- system för Notch-ligand interaktion studier11,12. S2 celler inte uttrycka endogena Notch receptor och Delta ligand11 och uttrycka en låg nivå av Serrate13, vilket inte påverkar Notch-ligand aggregering experiment8. Därför kan S2 celler vara stabilt eller övergående transfekterade av Notch eller enskilda ligander (Delta eller Serrate) för att generera celler som enbart uttrycker Notch receptorn eller en av dess ligander, eller en kombination av dessa. Blandning av Notch-uttryckande S2 celler med ligand-uttryckande S2 celler resulterar i bildandet av heterotypic aggregat medieras av receptor-ligand bindande11,12,14. Kvantifiering av aggregerade bildandet ger ett mått på trans-bindande mellan Notch och dess ligands15 (figur 1). Likaså, S2 celler kan vara co transfekterade med Notch och Delta eller Serrate ligander (dvs. cis-ligander). CIS-ligander i dessa Notch-uttryckande S2 celler upphäva bindningen av Notch med trans-ligander och resultera i minskade sammanlagda bildandet8,12,14. Den relativa minskningen av sammanlagda bildandet orsakas av cis-ligander ger ett mått på den hämmande effekten av cis-ligander på bindningen mellan skåran och trans-ligander (figur 2). Därför cell aggregering analyser utnyttjades för att undersöka effekten av förlusten av xylosylation på trans- och cis-interaktioner mellan Notch och dess ligander.

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för cell aggregering analyser som syftar till att utvärdera bindningen av Notch med trans-ligander och dess hämning av cis-ligander använda Drosophila S2 celler. Som ett exempel, vi tillhandahåller de data som tillät oss att avgöra effekten av Notch xylosylation på bindningen mellan skåran och trans-Delta8. Dessa enkla analyser ger en semikvantitativ bedömning av Notch-ligand interaktioner i vitro och avgöra de molekylära mekanismerna bakom i vivo effekterna av Notch väg modifierare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. beredning av dubbel Stranded RNA (dsRNA) för Shams Knockdown

  1. PCR-amplifiering av produkter
    1. Använda vildtyp gul vit (y w) genomisk DNA och pAc5.1-andra som mall och följande primer par för att förstärka de DNA-fragment som används i dsRNA syntes. Använd följande PCR termisk profil: denaturering (95 ° C, 30 s), glödgning (58 ° C, 30 s) och förlängning (72 ° C, 1 min).
      Enhanced grönt fluorescerande Protein (Andra) dsRNA primers (5' - 3')-
      Forward primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Reverse primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Shams dsRNA primers (5' - 3')-
      Forward primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Reverse primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      Observera: Andra dsRNA används som negativ kontroll.
  2. Gel-rena polymeras-kedjereaktion (PCR) produkterna med en kommersiell gel rening kit enligt tillverkarens protokollet.
  3. Utför in vitro- transkription med hjälp av en kommersiell produkt som är kapabel att transkribera från en T7 promotorn enligt tillverkarens protokollet.
  4. Rena de dsRNA använder ett RNA rening kit enligt tillverkarens protokollet och lagra vid-80 ° C.
  5. Bedöma effektiviteten av shams knockdown med hjälp av följande steg (1.5.1-1.5.5).
    1. Räkna cellerna manuellt med en hemocytometer och plåt 5 x 105 S2 celler i varje brunn en 6 väl plattan i 1 mL/väl av Schneiders medium kompletteras med 10% fetalt bovint Serum (FBS) och 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
    2. Tillsätt 7,5 µg andra- eller shams dsRNA till varje brunn och inkubera vid 25 ° C under 24 h.
    3. Skörden kontrollen (andra dsRNA-behandlade) och shams dsRNA-behandlade S2 celler av mild pipettering följt av pelletering ner genom centrifugering vid 1 000 x g för 5 min vid 25 ° C och processen för RNA isolering med en RNA extraktion kit enligt tillverkarens protokollet.
    4. Kvantifiera RNA med en spektrofotometer och processen 100 ng av RNA för 1-step qRT-PCR med kommersiella qPCR reagens och primer/sonder och följande PCR termisk profil: denaturering (95 ° C, 15 s) och glödgning/förlängning (60 ° C, 1 min).
      Obs: Se Tabell av material för information om primer/probe set och de instrument som används för shams och kontroll qRT-PCR experiment i dessa studier.
    5. Beräkna relativa shams mRNA nivåer med 2ΔΔCT metod16.

2. bedömning av bindningen mellan Notch Receptor och Trans-ligander

  1. Förbereda signal-ta emot celler (S2 celler uttrycker Notch receptorn).
    1. Räkna cellerna manuellt med hjälp av en hemocytometer och platta 5 x 105 S2 och stabil S2-Notch celler i varje brunn 6-well platta i 1 mL/väl av Schneiders medium kompletteras med 10% FBS och 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
      Obs: För S2-Notch celler, som är tillgängliga från Drosophila genomik Resource Center (DGRC), lägga till 200 nM metotrexat i media. För att förbereda en 0,5 mM metotrexat stamlösning, först Bered en 20 mM metotrexat i 250 µL 1 M NaOH. Nästa, späd lösningen till 0,5 mM i 1 M fosfat buffert saltlösning och förvaras vid-20 ° C. I S2-Notch celler är uttryck av proteinet Notch under kontroll av promotorn Drosophila metallotionein i pMT vektorn.
    2. Tillsätt 7,5 µg av dsRNA till varje brunn och inkubera vid 25 ° C under 24 h.
    3. Lägg till 0,7 mM CuSO4 inducerar uttryck av Notch och inkubera vid 25 ° C i 3 dagar.
      Obs: CuSO4 används för att framkalla uttryck av proteiner som kontrolleras av promotorn metallotionein.
  2. Förbereda signal-skicka celler (S2 celler uttrycker Delta eller Serrate ligander).
    1. Räkna cellerna manuellt med en hemocytometer och tallrik ~ 5 x 106 stabila S2-Delta eller S2-SerrateTom celler i varje brunn 6-well platta i 1 mL/väl av Schneiders medium kompletteras med 10% FBS och 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
      Obs: Lägg till 200 nM metotrexat för S2-Delta celler och 100 µg/mL hygromycin för S2-SerrateTom celler i media. Uttryck för Delta och SerrateTom— en tomat-taggade, fungerande version av Serrate12— under Drosophila metallotionein arrangören i pMT vektorn.
    2. Lägg till 0,7 mM CuSO4 inducerar uttryck av ligander och inkubera vid 25 ° C under 3 h.
  3. Utföra aggregering mellan signal-skicka- och signal-mottagande cellerna.
    1. Skörda dsRNA-behandlade S2 (kontroll) och S2-Notch celler av mild pipettering och plattan 2,5 x 105 celler per brunn i en 24-well platta efter manuell räkning av hemocytometer.
    2. Lägg till 5 x 105 stabila S2-Delta eller S2-SerrateTom celler i en total volym på 200 µL av Schneiders medium (kompletteras med 10% FBS och 100 U/mL Penicillin-Streptomycin).
      Obs: Alla S2 celler hantering (inklusive plätering, induktion och dsRNA behandling) skedde under en biosäkerhet skåp.
    3. Placera plattan i orbitalskak på 150 rpm (942.48 rad/min).
    4. Efter 1 min, blanda innehållet i varje brunn och ta 20 µL ut för att räkna antalet aggregat.
      1. Samtidigt ta en representativ bild under inverterad förening Mikroskop med 10 x förstoring (PLL 10/0,25 mål).
      2. Manuellt räkna aggregaten (> 6 celler) med hjälp av en hemocytometer.
    5. Placera plattan på en shaker.
    6. Upprepa bild förvärv och räkna efter 5 min och 15 min av aggregation.
  4. Utföra kvantifiering av trans-bindande.
    1. Beräkna antalet aggregat per mL mellan S2 och S2-Delta eller S2-SerrateTom celler som bakgrund kontroll.
    2. Beräkna antalet aggregat per mL mellan S2-Notch och S2-Delta eller S2-SerrateTom celler (omfattningen av trans-bindning).

3.Utvärdering av hämning av bindningen mellan skåran och Trans-ligander av Cis-ligander

  1. Förbereda signal-ta emot celler.
    1. Tallrik 5 x 105 S2 celler i varje brunn 6-well platta i 1 mL/väl av Schneiders medium kompletteras med 10% FBS och 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
    2. Tillsätt 7,5 µg av dsRNA till varje brunn och inkubera vid 25 ° C under 24 h.
    3. Samtidig transfect dsRNA-behandlade cellerna med pBluescript och pMT-Notch11 (DGRC) ensam eller med pMT-Notch och pMT-Delta11 (DGRC) eller pMT-Serrate17 totalt DNA-koncentration av 2 µg per brunn med en kommersiell transfection reagens enligt tillverkarens protokollet.
      Obs: pBluescript används som en kontroll. Co transfekterade cellerna kommer att kallas S2-Notch & Deltaövergående eller S2-Notch & Serrateövergående celler nedan.
    4. Inkubera S2 normalnivå transfekterade cellerna vid 25 ° C under 24 h.
    5. Lägg till 0,7 mM CuSO4 att inducera uttrycket av Notch och liganderna och inkubera vid 25 ° C i 3 dagar.
  2. Förbereda signal-skicka celler som beskrivs i 2.2.
  3. Utför aggregering mellan signal-skicka- och signal-mottagande cellerna som beskrivs i avsnitt 2.3.
  4. Kvantifiera hämning av trans-bindande av cis-ligander.
    1. Beräkna antalet aggregat per mL mellan S2 och S2-Delta eller S2-Serrate celler som bakgrund kontroll.
    2. Kvantifiera omfattningen av hämning av cis-ligander enligt följande.
      1. Definiera A som antal aggregat mellan S2-Notchövergående och S2-Delta celler.
      2. Definiera B som antal aggregat mellan S2 celler normalnivå Co transfekterade med Notch och Delta (S2-Notch & Deltaövergående) och S2-Delta celler.
      3. Beräkna relativa aggregering C = (B x 100) /A
      4. Beräkna omfattningen av hämning av cis- ligand (Delta eller Serrate) som 100 – C.
        Obs: som ett exempel, om relativa aggregering är 45%, då cis-ligander anses hämma den transen-bindande med 55%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Våra observationer i vivo föreslagit att förlust av xylosyltransferase gen shams resulterar i vinst på Notch signalering beror på ökat Delta-medierad trans-aktivering av Notch utan att påverka cis-hämning av Notch av ligander8. Testa detta begrepp genom utfördes in vitro- cell aggregering analyser. Först, shams uttryck i S2 celler slogs ned med hjälp av shams dsRNA. Andra dsRNA användes som kontroll. Effektiviteten i knockdown (KD) undersöktes av realtids-PCR och visade sig vara större än 80%8. Då bindningen av Notch receptor med trans-Delta vid shams KD undersöktes med hjälp av aggregation analyser. Aggregeringen mellan S2-Notch och S2-Delta celler undersöktes vid olika tidpunkter efter blanda dem. Aggregation mellan vanlig S2 och S2-Delta celler togs som bakgrund kontroll. Figur 3 visar grafen som visar antalet aggregat bildas vid olika tidpunkter (1, 5, 15 och 30 min) efter blandning. En kraftig ökning observerades i antalet aggregat mellan 1 och 5 min. därefter antalet aggregat fortsatte att öka tills 30 min i en långsammare takt. Därför samlade bildandet fotograferades på 1, 5 och 15 min och antalet aggregat kvantifierades efter 5 min blandning.

Figur 4A visar representativa bilder av cell aggregering analyser mellan stabil S2-Notch och S2-Delta celler att bedöma effekterna av shams KD på bindningen mellan Notch receptor och trans-Delta. Bilderna visar aggregeringen vid tre-tiden punkter (1, 5 och 15 min). För bakgrund kontroll, var vanligt S2 celler (behandlade med shams dsRNA) blandade med S2-Delta celler. Andra dsRNA-behandlade S2-Notch celler bildas aggregat med S2-Delta celler, som ökar i antal med tiden. Däremot shams dsRNA-behandlade S2-Notch celler bildas aggregat snabbare, och aggregaten var större och större i antal än kontrollen dem (figur 4B). Detta indikerade att sänka Shams halterna ökar trans-bindning av Notch med Delta8.

För att undersöka huruvida Shams reglerar den hämmande effekten av cis-ligander på bindningen mellan skåran och trans-Delta, vi etablerade först att samtidig uttryck för Notch och Delta i signal-mottagande cellen kan minska cell sammanläggning medieras av Notch och trans-Delta. Figur 5A visar grafen som visar antalet aggregat bildas mellan S2-Delta och S2-Notch & Deltaövergående celler med olika mängder cis-Delta. Transfecting lika mängder Notch - och Delta-uttryck konstruktioner i S2 celler dramatiskt minskar antalet aggregat bildas mellan dessa celler och S2-Delta celler. Dessutom minskar mängden cis-Delta resulterar i en ökning av antalet aggregat, vilket tyder på att i den rad av skåran /cis-Delta nyckeltal används i dessa analyser, cis-Delta kan hämma bindningen mellan Notch och trans-Delta i ett dos-beroende sätt. Sedan S2-skåran & Deltaövergående celler uttrycker både Notch och Delta, de kan bilda homotypic aggregat oberoende av S2-Delta cellerna. Att undersöka om bildandet av homotypic aggregat bland S2-Notch & Deltaövergående celler kan vara en störande faktor i cis-hämning-analyser som visas i figur 5A, vi blandade dessa celler med S2 celler och kvantifieras de aggregat. Figur 5B visar antalet aggregat bildas efter blandning S2 celler med S2-Notch & Deltaövergående celler som uttrycker olika Notch /cis-Delta nyckeltal. Ett ganska litet antal homotypic aggregat jämfört med heterotypic aggregat som visas i figur 5A observerades. Vi konstatera att dessa aggregering analyser troget mäta effekten av cis-Delta på bindningen mellan skåran och trans-Delta.

Vi nästa undersökte effekten av shams KD på hämmande förmågan av cis-Delta. Till detta avsluta, aggregering mellan S2-Delta och S2-Notch & Deltaövergående celler undersöktes. Figur 6A visar representativa bilder av aggregering mellan S2-Delta celler och S2-Notchövergående (kontroll) eller S2-Notch & Deltaövergående celler. S2-Delta och andra dsRNA-behandlade S2-Notchövergående celler bildas aggregat, som ökar i antal med tiden, liknar aggregering mellan S2-Delta och stabil S2-Notch celler (figur 4). Särskilt, blanda S2-Delta och S2-Notch & Deltaövergående celler Co transfekterade med lika mängder Notch - och Delta-uttryck plasmider bildas mindre aggregat vid både andra KD och shams KD, tyder på att minska nivån på Shams påverkar inte möjligheten för cis-Delta att blockera Notch /trans-Delta bindande. Att bättre bedöma effekterna av shams KD på aktiviteten av cis-Delta, omfattningen av hämning av cis-Delta mättes genom att beräkna den relativa aggregering procentsatsen över ett utbud av Hack /cis-Delta nyckeltal som förklaras i avsnitt 3.4.2. Kvantifiering av relativa aggregation visade en jämförbar hämning av aggregation på andra och shams dsRNA behandling (figur 6B). Tillsammans, dessa observationer tyder starkt på att förlust av xylosylation främjar trans-bindande utan att påverka cis-hämning8, och ge en molekylär mekanism för wing ven förlust fenotypen observerats i shams mutanter.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av Cell Aggregation Assay för Trans-bindande. Diagram visar induktion av receptor (S2-Notch) och ligand (S2-Delta eller S2-Serrate) uttrycker S2 celler av 0,7 mM CuSO4. Induktion av båda S2 celler följs av blandning, som tenderar att göra aggregat. Dessa aggregat (> 6 celler) är avbildade och kvantifieras.Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk framställning av Cell Aggregation Assay att bedöma Cis-hämning. S2 celler var övergående transfekterade med pMT-Notch (S2-Növergående), pMT-Notch och pMT-Delta (S2-Notch & Deltaövergående), eller pMT-Notch och pMT-Serrate (S2-Notch & Serrateövergående). Efter induktion av 0,7 mM CuSO4 och blanda med S2-Delta celler, aggregerar (> 6 celler) är kvantifierade. Hämning av cis-ligander mäts i termer av relativa aggregering procent i närvaro och frånvaro av varje tis-ligand. Effekterna av cis-ligander på bindningen mellan skåran och trans-Serrate kan bestämmas genom att blanda normalnivå transfekterade cellerna med S2-SerrateTom celler (visas inte). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: aggregering mellan S2-Notch och S2 eller S2-Delta celler vid olika tidpunkter. Diagrammet visar antalet aggregat per mL vid olika tidpunkter (1, 5, 15 och 30 min) mellan angivna typer av celler. Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) av tre replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Cell Aggregation medieras av Notch och trans-Delta. (A) bilder visar aggregering vid olika tidpunkter (1, 5 och 15 min). Aggregation mellan shams dsRNA-behandlade vanligt S2 och S2-Delta celler togs som bakgrund kontroll. Shams- dsRNA behandlas S2-Notch celler visar en ökning i antalet och storleken på aggregat jämfört andra dsRNA-behandlade (kontroll) S2-Notch celler efter blandning med S2-Delta celler. Skalstapeln = 100 µm. (B) kvantifiering av antal cell aggregerar större än 6 celler efter 5 min av aggregation. Felstaplar visar SEM. * P < 0,01 (enkel variansanalys (ANOVA)). Tre replikat med tre oberoende repetitioner utfördes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Cis-Delta hämmar den Cell sammanlagda bildandet medieras av Notch och trans-Delta i ett dos-beroende sätt. (A) diagrammet visar aggregeringen (i termer av antal aggregat/mL) mellan S2-Delta och S2 celler normalnivå transfekterade med olika nyckeltal av uttrycket vektorer för Notch och cis-Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 och 1:0. 1). Felstaplar visar SEM. * P < 0,01 (envägsavgift ANOVA). Tre replikat med tre oberoende repetitioner utfördes. Observera att minska cis-Delta resulterar i en ökning av aggregering, sannolikt på grund av minskad cis-hämning. (B) diagrammet visar homotypic aggregation (i termer av antal aggregat per mL) i S2 celler normalnivå transfekterade med olika nyckeltal Notch och Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 och 1:0. 1) och blandas med vanlig S2 celler. Felstaplar visar SEM. antal aggregat är mycket mindre än antalet heterotypic aggregat bildas mellan S2-Delta och S2-Notch & Deltaövergående celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Knockdown av shams påverkar inte den hämmande effekten av cis-Delta. (A) visas är representativa bilder av effekten av shams KD på cis-Delta-medierad hämning av cell aggregation medieras av Notch /trans-Delta bindande. Bilderna visar aggregering vid olika tidpunkter (1, 5 och 15 min). Aggregation mellan shams dsRNA-behandlade vanligt S2 och S2-Delta celler togs som bakgrund kontroll. Liknar stabilt transfekterade S2-Notch celler, shams KD ökat antalet aggregat mellan S2-Delta och S2-Notchövergående celler jämfört med kontroll (andra dsRNA-behandlade). Samtidig uttryck för cis-Delta med nagg i förhållandet 1:1 resulterade i en jämförbar minskning av antalet aggregat kontroll (andra dsRNA-behandlade) samt som shams dsRNA behandlade celler. Skalstapeln = 100 µm. (B) diagrammet visar relativa aggregering mellan S2-Delta och S2 celler normalnivå Co transfekterade med angivna nyckeltal (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 och 1:0. 1) i skåran och cis-Delta. Andra och shams dsRNA behandling visar en jämförbar minskning aggregation på varje Hack /cis-Delta baserat. Data som presenteras här är representativa för tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kanoniska Notch signalering beror på samspelet mellan Notch receptorn och dess ligands5. Även om de flesta studier på Notch vägen anser främst bindningen av Notch och ligander i angränsande celler (trans), Notch och samma-cell ligander samspelar, och dessa så kallade cis-interaktioner kan spela en hämmande roll i Notch signalering3,4. Följaktligen för att dechiffrera de mekanismerna bakom effekterna av en modifierare på kanoniska notch signalering, är det ofta relevant att undersöka båda typerna av Notch-ligand interaktioner (trans och cis). Dock i många sammanhang under djurens utveckling försvårar deltagande av båda dessa interaktioner och deras feedback reglering i vivo studier1,6. I detta protokoll ger vi en detaljerad metod för in vitro- cell aggregering analyser använder Drosophila S2 celler för att utvärdera bindningen av Notch receptor med trans- ligander och dess hämning av cis- ligander. Vi har presenterat utnyttjandet av denna metod att bedöma effekten av en genetisk modifierare av Notch signalering (den xylosyltransferase Shams7,8) på receptor-ligand bindande.

Först, aggregering analyser utfördes mellan stabil S2-Delta och andra eller shams dsRNA-behandlade stabil S2-Notch celler för att undersöka effekten av shams KD på trans-bindande. Aggregering av S2-Delta celler med shams dsRNA-behandlade vanligt S2 celler togs som bakgrund kontroll. Shams KD enhanced aggregering mellan S2-Notch och S2-Delta celler jämfört med kontrollgruppen. Det är viktigt att utföra bakgrund experimentell kontroll aggregeringar mellan vanlig S2 och ligand-carrying S2 celler parallellt till de transen-bindande experiment. Även om Drosophila S2 celler inte uttrycker endogena Notch receptor och Delta ligand11, rapporteras uttryck av låga nivåer av Serrate i S2 celler13. Med tanke på detta, vanligt S2 celler användes i cell aggregering analyser som bakgrund kontroll; dessa celler visade inte någon sammanläggning (figur 5B). Aggregat räknas manuellt med hjälp av en hemocytometer. För att säkerställa konsekvens i sammanlagda kvantifiering, kan 10-20 µL av blandad cell befolkningen vara pipetteras ut från minst tre olika områden per brunn för inventering. Dessa analyser kräver friska växande S2 celler. Med tanke på semi vidhäftande beskaffenhet S2 celler, skonsam pipettering samtidigt samla cellerna och konstant skakar under aggregering analysen är viktiga.

Tidigare har har vi och andra använt väletablerade, lösligt ligand-receptor bindande analyser för en kvantitativ bedömning av receptor-ligand bindande i trans17,18,19, 20. eftersom aggregering analyserna är semikvantitativt, lösliga ligand bindande analyser utfördes också för att undersöka effekten av shams KD på Notch-ligand trans-bindande. De observerade resultaten var likartade i trenden med dem som erhålls från aggregering analyser8. Detta intygas trogen utvärderingen av bindningen av Notch med trans-ligander använder cell aggregering analyser. Även om det sammanlagda bildandet är en avläsning av receptor-ligand bindande, kan det intrikata om surface uttrycket av Notch receptorn eller dess ligands påverkas av angivna modifierarna. Detta belyser begränsning av cell aggregering analyserna, som den inte kan särskiljas om förändringen i sammanlagda bildandet är på grund av förändrad receptor-ligand bindande eller förändras ytan uttryck. Parallellt med aggregering analyser, effekterna av varje modifierare på ytan uttryck för Notch och ligander måste därför provas i S2 celler. I samband med våra studier påverkades inte surface nivåer av Notch och Delta i shams dsRNA-behandlade S2 celler8.

Att undersöka hämning av trans-bindande genom tillsats av cis-ligander, aggregering analyser utfördes mellan S2-Delta celler och andra eller shams dsRNA-behandlade S2-Notch & Deltaövergående celler . Antalet aggregat bildas mellan dessa celler jämfördes med antalet aggregat bildas mellan S2-Delta och S2-Notchövergående celler. Den relativa minskningen av antalet aggregat beräknades och används som en indikator för omfattningen av hämning av cis-Delta. Kontroll experimenten visade att cis-ligander Visa en robust och dos-beroende hämning av Notch /trans-Delta bindande över ett ganska brett utbud av snäpp till cis-ligand nyckeltal (1:1 till 1:0. 1) (figur 5A),8 . Förhållandet 1:1 resulterade i den starkaste graden av cis-hämning, och minskar den relativa nivån av cis-Delta försvagades cis-hämning. Följaktligen de KD experiment över denna rad nyckeltal utfördes. Notera hölls mängden Notch receptor och den totala mängden transfekterade DNA konstant i alla experiment. Detta kommer att säkerställa att aggregera bildandet påverkas primärt av aktiviteten av cis-ligander och inte av förändrade nivåer av Notch uttryck av celler.

Det var tidigare visat att samtidig uttryck för Notch och cis-ligander i S2 celler kan resultera i bildandet av homotypic aggregeringar14. Att undersöka om liknande homotypic aggregeringar bland S2-Notch & Deltaövergående eller S2-Notch & Serrateövergående celler kan äventyra våra tolkningar av de sammanlagda kvantifieringar i cis-ligand studier, en aggregering kontrollanalysen utfördes mellan S2-Notch & Deltaövergående och vanlig S2 celler. Antalet S2 celler används i dessa experiment var samma som S2-Delta cellerna som används i cis-Delta experiment. Vissa homotypic aggregation observerades, men kvantifiering visade att de resulterande aggregat bidra en låg andel av totala aggregaten jämfört med heterotypic aggregaten mellan S2-Notch & Deltaövergående och S2-Delta celler () Figur 5B).Vi konstatera att förändringarna som observerats i antalet aggregat i cis-ligand analyser beror främst på den hämmande effekten av cis-ligander på bindningen mellan skåran och trans-Delta.

Sammanfattningsvis, aggregering analyserna presenteras i detta protokoll ger en lätt och okomplicerad metod för semikvantitativ bedömning av trans- och cis-interaktioner Notch receptorn och dess ligander. Dessa analyser kan användas för att undersöka effekterna av genetiska eller farmakologiska Notch väg modifierare på Notch-ligand bindande in vitro- och därför kan bidra till att klarlägga mekanismerna bakom de i vivo effekterna av dessa modifierare på Notch signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Författarna erkänner stöd från den NIH/NIGMS (R01GM084135 till HJN) och Mizutani Foundation för Glycoscience (grant #110071 till HJN), och de är tacksamma att Tom V. Lee för diskussioner och förslag på analyserna, och Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine och Drosophila genomik Resource Center (DGRC) för plasmider och cellinjer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified Lonza 04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare lifescience  SV30010
CELLSTAR 6 well plate Greiner Bio-One 657 160
CELLSTAR 24 well plate Greiner Bio-One 662160
VWR mini shaker Marshell Sceintific 12520-956
Hemocytometer Fisher Sceintific  267110
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit Ambion AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) Zymo Research R1054
VistaVision Inverted microscope VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software AmScope MU-900 Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
Fetal Bovine Serum GenDepot F0600-050
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10
Hygromycin B Invitrogen HY068-L6
Copper sulphate Macron Fine Chemicals 4448-02
S2 cells Invitrogen R69007
S2-SerrateTom cells Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells DGRC 152
S2-Notch cells DGRC 154
pMT-Delta vector DGRC 1021 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector DGRC 1022 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit Applied Biosystem 1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) Applied Biosystem Dm02144576_g1  with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) Applied Biosystem Dm02151827_g1 with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 4351405 96-well Block module

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124, (10), 1919-1928 (1997).
  2. Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16, (5), 633-647 (2009).
  3. del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21, (1), R40-R47 (2011).
  4. Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465, (7294), 86-90 (2010).
  5. Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137, (2), 216-233 (2009).
  6. Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124, (17), 3283-3291 (1997).
  7. Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9, (6), e1003547 (2013).
  8. Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13, (4), e1006723 (2017).
  9. Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125, (22), 4531-4540 (1998).
  10. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, (2), 353-365 (1972).
  11. Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61, (3), 523-534 (1990).
  12. Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140, (9), 2039-2049 (2013).
  13. Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18, (5), 862-876 (2010).
  14. Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239, (3), 798-805 (2010).
  15. Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167, (6), 1217-1229 (2004).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, (4), 402-408 (2001).
  17. Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278, (43), 42340-42345 (2003).
  18. Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132, (2), 247-258 (2008).
  19. Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406, (6794), 411-415 (2000).
  20. Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338, (6111), 1229-1232 (2012).
Cell Aggregation analyser att utvärdera bindningen av <em>Drosophila</em> skåran med <em>Trans</em>-ligander och dess hämning av <em>Cis</em>-ligander
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).More

Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter